miRNA調(diào)控昆蟲(chóng)與病毒互作的研究進(jìn)展

魯 莎， 郭建洋， 席 羽， 萬(wàn)方浩,,*

1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109； 2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東 深圳 518120

作為非編碼RNA家族重要成員之一的miRNA是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)堿基的小RNA分子，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可以通過(guò)mRNA剪切或者抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式負(fù)調(diào)控靶標(biāo)基因(Florisetal.,2016; Kraussetal.,2018)。Leeetal. (1993)在秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA：lin-4，負(fù)調(diào)控lin-14基因表達(dá)，使其在翻譯水平上受到抑制。隨后第二個(gè)miRNA分子let-7也在線蟲(chóng)中被成功鑒定，與lin-4調(diào)控機(jī)制相似(Reinhartetal.,2000)。此后被鑒定的miRNA的數(shù)量快速增長(zhǎng)，截至2018年3月，在miRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase (http:∥www.mirbase.org/)第22版中收錄miRNA前體38589個(gè)，共計(jì)產(chǎn)生48885個(gè)成熟miRNA，涵蓋了271個(gè)物種，其中包括33種昆蟲(chóng)、35種病毒；另有一專門(mén)針對(duì)病毒miRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)Vir-Mir (http:∥alk.ibms.sinica.edu.tw/cgi-bin/miRNA/miRNA.cgi)統(tǒng)計(jì)獲得病毒miRNA前體30439個(gè)，其中雙鏈DNA病毒(dsDNA)26339個(gè)，昆蟲(chóng)中主要存在的桿狀病毒miRNA前體1683個(gè)。研究表明，miRNA可以調(diào)節(jié)大約50%的蛋白編碼基因，參與包括生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、激素分泌等多種生理過(guò)程(Taftetal.,2010)，以及包括肺癌、結(jié)腸癌、病毒感染等多種病理過(guò)程(Gangaraju & Lin,2009; Katsushima & Kondo,2014)。

病毒是害蟲(chóng)生物防治中的一種主要防治措施，然而，隨著病毒制劑的不斷應(yīng)用，昆蟲(chóng)與病毒之間相互作用、協(xié)同進(jìn)化，昆蟲(chóng)發(fā)展出對(duì)病毒的抗性，而病毒也相應(yīng)發(fā)展出應(yīng)對(duì)這種抗性的對(duì)策。近年來(lái)，隨著miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)與病毒中產(chǎn)生的miRNA研究熱度增大，其在兩者互作中的調(diào)控作用也成為關(guān)注熱點(diǎn)。宿主昆蟲(chóng)與病毒的基因組都能編碼miRNA，這些miRNA能調(diào)控大量基因的表達(dá)。研究表明，病毒侵染后的昆蟲(chóng)，其體內(nèi)的miRNA表達(dá)水平發(fā)生顯著變化(Wuetal.,2013)，引起差異表達(dá)的原因可能是宿主自身產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)，也可能是病毒感染所誘導(dǎo)的調(diào)控因子導(dǎo)致；另一方面，病毒編碼的miRNA也可調(diào)控自身復(fù)制相關(guān)基因或直接作用于宿主免疫相關(guān)基因。本文從miRNA的生成、調(diào)控機(jī)制及其功能等方面綜述miRNA的生物學(xué)特性，重點(diǎn)闡述其在昆蟲(chóng)和病毒互作中的調(diào)控作用，為害蟲(chóng)生物防治提供新的思路。

1 miRNA的生成機(jī)制

成熟miRNA的形成過(guò)程包括若干步驟：首先，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的指導(dǎo)下被轉(zhuǎn)錄成初始miRNA(primitive miRNA, pri-miRNA)(Leeetal.,2004)。在細(xì)胞核內(nèi)，pri-miRNA經(jīng)RNaseⅢ家族的Drosha內(nèi)切酶剪切后，形成帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)70～100 nt的前體miRNA(precursor miRNA, pre-miRNA)(Leeetal.,2003)，這一過(guò)程中Pasha蛋白作為輔助蛋白與Drosha形成復(fù)合體(Yeometal.,2006)。加工好的pre-miRNA再由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5從細(xì)胞核主動(dòng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。Exportin-5可特異性識(shí)別經(jīng)RNaseⅢ(Drosha)剪切后在3′末端有2個(gè)未配對(duì)核苷酸的pre-miRNA，并保護(hù)pre-miRNA從核內(nèi)到胞質(zhì)的完整性(Zeng & Cullen, 2004)。轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的pre-miRNA再進(jìn)一步被Dicer(RNaseⅢ家族中專門(mén)消化雙鏈RNA的酶分為dicer 1和dicer 2，將長(zhǎng)鏈dsRNA剪切成約21 nt的短鏈dsRNA)及其輔助因子TRBP切割成18～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈miRNA:miRNA*分子。miRNA*雙體中成熟miRNA鏈會(huì)選擇性地整合到RISC(RNA induced silencing complex)中識(shí)別靶基因，通過(guò)與靶標(biāo)mRNA的特定序列互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)結(jié)合(Trujillordetal.,2010)，誘導(dǎo)靶標(biāo)mRNA剪切或阻止其翻譯，從而調(diào)控靶基因表達(dá)；另一條鏈miRNA*或許會(huì)快速降解(Leeetal.,2003)。還有一些來(lái)源和上述過(guò)程不同的miRNA，稱為mirtron (Du & Zamore,2005; Ghildiyaletal.,2010)。mirtron由一些小的內(nèi)含子經(jīng)過(guò)剪接和去分支后，可不經(jīng)過(guò)Drosha酶切而直接形成pre-miRNA，再進(jìn)一步加工為成熟的miRNA (Yangetal.,2014)。

2 miRNA的調(diào)控機(jī)制

miRNA與RISC結(jié)合形成miRISC效應(yīng)復(fù)合物后才能夠調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)。通常由miRNA的種子序列(5′第2～8位核苷酸)來(lái)識(shí)別靶基因，有2種機(jī)制來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)：mRNA剪切和翻譯抑制。miRNA與其靶基因的互補(bǔ)程度決定了它以何種機(jī)制沉默靶基因，當(dāng)其與靶基因幾乎完全互補(bǔ)時(shí)就會(huì)使mRNA降解；當(dāng)其與靶基因不完全互補(bǔ)時(shí)則會(huì)引起mRNA的翻譯抑制。盡管這個(gè)模型已被許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)了例外，擬南芥Arabidopsisthaliana(L.)中miRNA-172盡管與靶標(biāo)基因APETALA2有近乎完全的堿基配對(duì)，卻通過(guò)抑制靶標(biāo)基因的翻譯而行使功能(Chen,2004)；哺乳動(dòng)物的miRNA-196與靶標(biāo)基因HOXB8的3′端非翻譯區(qū)(3′-UTR)幾乎完全互補(bǔ)，卻導(dǎo)致靶基因的降解(Kawasaki & Taira,2004)。而miRNA與靶標(biāo)基因結(jié)合的位點(diǎn)也存在多種結(jié)合方式：早些時(shí)候認(rèn)為miRNA的靶標(biāo)位點(diǎn)位于靶基因的3′-UTR區(qū)，但Schnall-Levinetal. (2010)利用軟件MinoTar (http:∥www.minotar.csail.mit.edu)預(yù)測(cè)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在mRNA的編碼區(qū)和5′-UTR區(qū)也有很多miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。Lytleetal. (2007)研究發(fā)現(xiàn)，let-7不僅靶向3′-UTR，同時(shí)靶向5′-UTR。 miRNA對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)十分復(fù)雜的機(jī)制，往往不是一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系，有可能一個(gè)靶基因由多個(gè)miRNA共同調(diào)控，也有可能一個(gè)miRNA調(diào)控多個(gè)靶基因表達(dá)(Legeaietal. 2010; Yuetal.,2007)。

3 miRNA的功能研究

從第一個(gè)miRNA發(fā)現(xiàn)至今，已經(jīng)有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的miRNA在不同的生物中被發(fā)現(xiàn)，miRNA在生物體中發(fā)揮的功能越來(lái)越引起人們的重視。目前對(duì)于其功能的研究主要還是通過(guò)基因突變或在miRNA的靶位點(diǎn)上引入突變來(lái)抑制miRNA的作用，通過(guò)觀察生物體的表型變化來(lái)推測(cè)miRNA的功能，這是一種反向遺傳學(xué)的研究方法(Jackson & Standart,2007)。另外一種推測(cè)miRNA功能的方法是對(duì)相應(yīng)的miRNA進(jìn)行過(guò)量表達(dá)。但是很多生物體的表型變化特征不明顯，因而人們開(kāi)始利用表達(dá)譜分析和生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)靶基因來(lái)研究其相對(duì)應(yīng)的miRNA功能。

對(duì)已發(fā)現(xiàn)的一些miRNA的功能研究表明，miRNA幾乎參與了生物體的整個(gè)生命過(guò)程，主要調(diào)控生理和病理2個(gè)方面。生理方面如細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、組織分化、胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及形態(tài)發(fā)生等。病理方面包括miRNA的異常表達(dá)會(huì)引起人類的各種疾病發(fā)生，如癌癥、心血管紊亂、艾滋病、白血病、糖尿病等(Kloosterman & Plasterk,2006)。實(shí)驗(yàn)表明，miRNA在生物抵抗外界不良環(huán)境中起著十分重要的作用，miRNA的異常表達(dá)受環(huán)境壓力的影響，當(dāng)miRNA表達(dá)量變化時(shí)可以影響相應(yīng)的靶基因表達(dá)，從而使生物體更好地適應(yīng)環(huán)境改變(Lema & Cunningham,2010)。例如，當(dāng)寄生蜂Glyptapantelesflavicoxis(Marsh)寄生舞毒蛾LymantriadisparL.后，舞毒蛾體內(nèi)相關(guān)miRNA發(fā)生顯著變化，從中發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)昆蟲(chóng)適應(yīng)環(huán)境變化起到了積極的促進(jìn)作用(Gundersen-Rindal & Pedroni,2010)。

4 miRNA在昆蟲(chóng)與病毒互作中的作用

4.1 病毒編碼的miRNA在宿主—病毒互作中的作用

目前，已確定300種能編碼miRNA的病毒,這些病毒包括皰疹病毒、桿狀病毒、腺病毒、多瘤病毒、囊泡病毒和主要侵染鱗翅目昆蟲(chóng)的Nudivirus(Belluttietal.,2015; Kozomara & Griffiths-Jones,2014； Liuetal.,2017; Singhetal.,2014)。miRNA已經(jīng)在不同的桿狀病毒如斜紋夜蛾核型多角體病毒(SpltNPV)、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)和家蠶核型多角體病毒(BmNPV)中被預(yù)測(cè)，其中一些已在實(shí)驗(yàn)中證實(shí):Kharbandaetal. (2015)預(yù)測(cè)了48個(gè)新的SpltNPV編碼的miRNA，其中10個(gè)在Sf21細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證;AcMNPV-miR-1被證實(shí)在AcMNPV感染的細(xì)胞中表達(dá)，調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)以達(dá)到促進(jìn)病毒自身感染的目的(Zhuetal.,2013,2016)。為了揭示由BmNPV編碼的miRNA并闡明它們?cè)贐mNPV和宿主互作中產(chǎn)生的作用，Singhetal. (2010)通過(guò)檢測(cè)中腸和脂肪體組織中病毒miRNA的表達(dá)譜報(bào)道了4種BmNPV編碼的miRNA。其中一種miRNA：BmNPV-miR-3，可調(diào)節(jié)DNA結(jié)合蛋白的表達(dá)，在病毒侵染階段發(fā)揮重要作用。BmNPV-miR-3在BmNPV侵染早期階段表達(dá)，并對(duì)DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行負(fù)調(diào)控，使用鎖核酸技術(shù)(locked nucleic acid,LNA)抑制BmNPV-miR-3的表達(dá)后，DNA結(jié)合蛋白的表達(dá)量增加，同時(shí)病毒量增加，而過(guò)表達(dá)BmNPV-miR-3則導(dǎo)致其表達(dá)量減少，病毒量也相應(yīng)減少。

隨著對(duì)miRNA的深入研究，病毒來(lái)源的miRNA在調(diào)節(jié)病毒—宿主互作中發(fā)揮的重要作用被更多發(fā)現(xiàn)。病毒miRNA可直接改變宿主生理機(jī)制，干擾宿主與病毒互作中的宿主防御機(jī)制。一些病毒miRNA，如KUN-miR-1和OvHV-2-miR-5直接與昆蟲(chóng)宿主靶標(biāo)基因相互作用，直接調(diào)控病毒感染和病毒復(fù)制(Hussainetal.,2012; Riazetal.,2014; Wuetal.,2016)。BmNPV-miR-1通過(guò)調(diào)節(jié)輸出蛋白-5輔因子Ran來(lái)抑制其宿主miRNA的表達(dá)，從而導(dǎo)致病毒增殖增強(qiáng)(Singhetal.,2012)。AcMNPV-miR-1是一種由AcMNPV編碼的miRNA，其堿基序列與病毒基因ODV-E25的編碼區(qū)完全匹配，通過(guò)下調(diào)ODV-E25 mRNA的表達(dá)削弱病毒的產(chǎn)生(Zhuetal.,2013)。Zhuetal. (2016)將Ac18和Ac95鑒定為AcMNPVmiR-1的2個(gè)新靶點(diǎn)，盡管AcMNPV-miR-1與ac18和ac95顯示不完全匹配，但它可同時(shí)調(diào)節(jié)它們的表達(dá)，總之，ac18的輕度表達(dá)和ac95的下調(diào)表達(dá)意味著AcMNPV-miR-1通過(guò)上調(diào)Ac18同時(shí)下調(diào)Ac95來(lái)抑制細(xì)胞感染和病毒復(fù)制?；谏鲜鰣?bào)道，可以認(rèn)為病毒miRNA可能靶向大量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物和病毒，利用miRNA作為調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)境的有效手段，構(gòu)建病毒適宜生長(zhǎng)的內(nèi)部環(huán)境。

4.2 昆蟲(chóng)編碼的miRNA在宿主—病毒互作中的作用

研究表明，病毒感染可誘導(dǎo)宿主miRNA表達(dá)譜的變化。miRNA微芯片測(cè)序結(jié)果表明，棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(Hübner)感染棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(HaSNPV)后脂肪體內(nèi)有127個(gè)差異表達(dá)的宿主miRNA(張松斗,2017)。埃及伊蚊Aedesaegypti(L.)感染登革熱病毒(DENV)會(huì)改變miRNA表達(dá)譜，在感染后第9天，23種miRNA表達(dá)量發(fā)生變化(Campbelletal.,2014)。白紋伊蚊AedesalbopictusSkuse感染DENV病毒后，miR-252在血淋巴中表達(dá)增加，并且抑制此miRNA導(dǎo)致病毒拷貝增加，而miRNA的過(guò)表達(dá)則抑制病毒繁殖(Yanetal.,2014)。埃及伊蚊感染ZIKV(一種主要由埃及伊蚊傳播的黃病毒)時(shí)，感染組織與未感染組織相比較，其17種miRNA表達(dá)量發(fā)生變化，其中aae-miR-2940-3p和aae-miR-1-5p明顯上調(diào)表達(dá)(Saldaaetal.,2017)。感染BmCPV的家蠶BombyxmoriL.和正常家蠶比較，有58個(gè)miRNA表達(dá)差異顯著，10個(gè)差異表達(dá)的miRNA通過(guò)qRT-PCR方法進(jìn)一步被證實(shí)(施莉莉,2016)，它們?cè)诓《靖腥竞蟊磉_(dá)水平的改變意味著可能在病毒—宿主互作中起作用。而桿狀病毒感染時(shí)sfrmiR-184下調(diào)4種不同基因的表達(dá)(Mehrabadietal.，2013)。斜紋夜蛾P(guān)rodenialitura(Fabricius)幼蟲(chóng)受到桿狀病毒感染后，大多數(shù)宿主miRNA表達(dá)水平下降，但在Sf9細(xì)胞中的miRNA、Bantam增加(Shietal.,2016)。

有些種類的病毒能夠利用宿主細(xì)胞的miRNA促進(jìn)自身復(fù)制(Joplingetal.,2005)，而其他的一些宿主miRNA卻能阻止病毒增殖(Sanghvi & Steel,2012)。Wolbachia能夠利用埃及伊蚊miRNA調(diào)控宿主的基因(如metalloprotease、MCTl、MCM6和methyltransferase)表達(dá)來(lái)抑制登革熱病毒的復(fù)制或促進(jìn)自身增殖(Osei-Amoetal.,2012)。當(dāng)白紋伊蚊感染登DENV后，miR-252表達(dá)增加，并且當(dāng)加入此miRNA抑制劑時(shí)導(dǎo)致病毒復(fù)制，而加入類似物時(shí)抑制病毒復(fù)制，推斷miR-252對(duì)DENV的復(fù)制侵染具有抑制作用(Yanetal.,2014)。HaSNPV能夠操縱棉鈴蟲(chóng)miR-14下調(diào)Ha-ECR基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)宿主幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育以促進(jìn)自身的復(fù)制(Jayachandranetal.,2013)。谷實(shí)夜蛾Helicoverpazea(Boddie)中的Hz-miR-24負(fù)調(diào)控編碼DNA依賴性RNA聚合酶家族的HvAV-3e的轉(zhuǎn)錄物DdRP和DdRPβ，從而對(duì)病毒復(fù)制起到調(diào)控作用(Hussain & Asgari，2010)。

5 總結(jié)與展望

miRNA的發(fā)現(xiàn)讓研究者對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的理解又進(jìn)了一層。有關(guān)在昆蟲(chóng)免疫方面起作用的miRNA報(bào)道極少，Kayvanetal. (2013)證實(shí)小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaL. miR-8正向調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin27的轉(zhuǎn)錄水平，serpin27調(diào)節(jié)Toll途徑的激活和參與昆蟲(chóng)黑化反應(yīng)的酚氧化酶，在被半閉彎尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellen寄生后，miR-8表達(dá)水平降低，導(dǎo)致serpin27轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，作為宿主免疫應(yīng)答的一部分，miR-8及其靶標(biāo)基因serpin27在寄生后下調(diào)表達(dá)來(lái)激活宿主免疫系統(tǒng)。Yuanetal. (2017)報(bào)道了serpin-5和serpin-9在棉鈴蟲(chóng)感染桿狀病毒后上調(diào)表達(dá)，抑制黑化反應(yīng)，降低棉鈴蟲(chóng)的存活率。棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(HearNPV)是近幾十年來(lái)越來(lái)越多地被用作害蟲(chóng)防治的生物殺蟲(chóng)劑，在桿狀病毒殺死害蟲(chóng)之前，它必須侵入并躲避宿主的免疫反應(yīng)。

越來(lái)越多的昆蟲(chóng)或病毒的miRNA被發(fā)現(xiàn)和鑒定出來(lái)，miRNA在昆蟲(chóng)宿主與病毒互作中調(diào)控作用的研究也成為熱點(diǎn)。昆蟲(chóng)miRNA能夠調(diào)控靶標(biāo)基因抑制病毒在其體內(nèi)的大量復(fù)制增殖，而病毒miRNA則利用宿主miRNA或自身產(chǎn)生的miRNA提高自身的增殖能力，從miRNA的角度揭示了昆蟲(chóng)與病毒之間的相互作用影響與協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。進(jìn)一步探索miRNA在昆蟲(chóng)與病毒互作中的調(diào)控作用，可以為害蟲(chóng)生物防治提供新思路與新方法；研究miRNA在昆蟲(chóng)—病毒中的作用機(jī)制，可以為病毒制劑的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。