人源性異種移植模型在胰腺癌個(gè)體化治療研究中的應(yīng)用

胡斌權(quán), 儲(chǔ)海盟, 師長(zhǎng)宏

(1. 94895部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì), 漳州 363000； 2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 西安 710032)

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿, 治療效果及預(yù)后極差的惡性腫瘤, 5年生存率僅為9%[1]。手術(shù)根治性切除仍是至今唯一可能治愈胰腺癌的方法, 但胰腺癌早期診斷困難, 多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期[2]。傳統(tǒng)的放化療方案療效甚微，毒副作用大[3-5], 因此, 選擇更為有效安全的藥物是迫切需要解決的問(wèn)題。

基于動(dòng)物模型上的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)可為臨床優(yōu)化用藥方案提供理論支持。來(lái)自胰腺癌臨床手術(shù)標(biāo)本的人源性異種移植(patient-derived xenograft，PDX)模型較好保持了原發(fā)瘤的異質(zhì)性，建立反映患者自身特征的藥物評(píng)價(jià)系統(tǒng)，臨床預(yù)見(jiàn)性高，應(yīng)用于胰腺癌藥物篩選具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[6,7]。此外，二代基因測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)的發(fā)展極大地推動(dòng)了腫瘤精準(zhǔn)靶向治療的進(jìn)程，多項(xiàng)研究表明[8,9]，基于PDXNGS的藥物篩選模式(PDX-NGS-based drug screening)在識(shí)別新的腫瘤生物標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)及研究化療藥物的耐藥機(jī)制上獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，在胰腺癌的個(gè)體化治療研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 胰腺癌PDX模型建模及基本特征

胰腺癌PDX模型常見(jiàn)的移植方式為皮下移植，如將患者新鮮的腫瘤組織剪為3 mm3碎塊，混合適量的基質(zhì)膠，利用穿刺針移植到裸小鼠背部皮下，命名為P1代；移植瘤生長(zhǎng)至1 000 mm3時(shí)，異氟烷麻醉小鼠，手術(shù)獲取腫瘤組織，在另一只裸小鼠皮下進(jìn)行傳代，命名為P2代，以此類推，傳代至P5代。此過(guò)程中應(yīng)用組織病理學(xué)和基因分型的手段對(duì)各代移植瘤進(jìn)行朔源性分析，確定出合格的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本[10,11]。研究[11,12]證實(shí),胰腺癌PDX模型中移植瘤在基因分型檢測(cè)、組織病理學(xué)和生物標(biāo)志物表達(dá)方面均與原發(fā)瘤保持了較好的一致性，即使多次傳代擴(kuò)增(5～8代內(nèi))，原發(fā)腫瘤的生物學(xué)信息及遺傳特征仍能夠被穩(wěn)定地保留，因而在預(yù)測(cè)臨床治療反應(yīng)上優(yōu)勢(shì)顯著。該研究[11]中，胰腺癌PDX模型的成模率與患者年齡、性別、患病史及腫瘤分化程度等均無(wú)顯著相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其與原發(fā)腫瘤的大小和淋巴浸潤(rùn)情況顯著相關(guān)。其中，相比裸小鼠，SCID小鼠移植成模率較高, 可能與其免疫缺陷程度更高有關(guān)[13]。常規(guī)移植使用的小鼠中，裸小鼠存在T細(xì)胞缺乏，SCID小鼠存在T、B細(xì)胞缺乏，NOD-SCID小鼠則是一種非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠, 存在T、B、自然殺傷(NK)細(xì)胞及補(bǔ)體缺陷，因移植小鼠的免疫篩選作用，使得原發(fā)腫瘤的某些異質(zhì)性可能會(huì)在體內(nèi)傳代中丟失，人們?cè)诜治鯬DX模型結(jié)果時(shí), 應(yīng)注意某些表型的缺失，可選擇免疫缺陷程度更高的小鼠來(lái)降低這種影響[14]。

傳統(tǒng)的PDX模型構(gòu)建中所用標(biāo)本多數(shù)來(lái)源于手術(shù)切除下的瘤體組織，然而胰腺癌患者確診時(shí)多屬晚期，并無(wú)手術(shù)指證，難以獲得術(shù)中標(biāo)本用于移植，這嚴(yán)重影響了該類人群利用PDX模型進(jìn)行藥物篩選的可行性。近期研究報(bào)道[15]，對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移或無(wú)法手術(shù)切除的胰腺癌患者，可使用活檢標(biāo)本構(gòu)建PDX模型，標(biāo)本可在超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下通過(guò)細(xì)針穿刺(fine-needle aspirate, FNA)獲得。該研究中移植成功率為33%，由此建立的FNA-PDX模型亦能較好地保留了患者腫瘤和基質(zhì)組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)，不僅增加了特定階段PDX模型的儲(chǔ)備及遺傳信息的提取，也使得該模型的適用人群更廣。胰腺癌進(jìn)展快，復(fù)發(fā)率高，在接受化療或手術(shù)的胰腺癌患者中, 中位復(fù)發(fā)時(shí)間為1年，2年內(nèi)80%的患者復(fù)發(fā)，可供治療的時(shí)間窗極短，因此，在疾病確診初期即開(kāi)始建立FNA-PDX模型、行基因表型及治療學(xué)的研究以評(píng)估個(gè)體化治療及疾病復(fù)發(fā)時(shí)的替代方案就顯得尤為重要[16]。

2 PDX模型適用于胰腺癌個(gè)體化藥物篩選及耐藥性研究

胰腺癌PDX模型在基因表達(dá)和藥物反應(yīng)性方面均與原發(fā)瘤保持相對(duì)一致，可代替特定患者進(jìn)行藥物篩選，而不同腫瘤患者來(lái)源的PDX模型其生物學(xué)和遺傳學(xué)特性會(huì)有所不同，對(duì)藥物的反應(yīng)性也會(huì)有所差別。這樣可為不同腫瘤患者篩選出優(yōu)化的個(gè)體化用藥方案，同時(shí)也可用于耐藥機(jī)制的研究[17,18]。

研究發(fā)現(xiàn)[7]，胰腺癌PDX模型和體外培養(yǎng)的原代腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性是一致的，在兩者的耐藥組中均存在骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因MCF2L基因高表達(dá)的情況，表明了MCF2L基因在吉西他濱耐藥中起到重要作用。另有研究[17]報(bào)道胰腺癌PDX模型用于奧沙利鉑、吉西他濱和伊立替康三種藥物的療效及副作用評(píng)價(jià)。其中吉西他濱抑瘤效果最為顯著，伊立替康療效次之，但副作用最輕。針對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推薦吉西他濱作為患者的首選化療藥物，而選擇伊立替康進(jìn)行維持治療。然而, 在將PDX模型的藥物篩選結(jié)果用于指導(dǎo)臨床用藥時(shí), 需要重點(diǎn)關(guān)注以下幾點(diǎn)： ①PDX模型在傳代過(guò)程中部分原始腫瘤異質(zhì)性可能會(huì)丟失，特定細(xì)胞亞群的過(guò)度生長(zhǎng)，鼠源化間質(zhì)和免疫微環(huán)境無(wú)法完全模擬腫瘤在患者體內(nèi)真實(shí)的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況； 這些可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床預(yù)見(jiàn)性降低； ②由于PDX模型代表了不同患者的狀況,在篩藥過(guò)程中化療藥物劑量、治療頻次需要個(gè)體化的策略, 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整； ③同時(shí)PDX模型治療前的分組、治療時(shí)機(jī)、治療周期，停藥后觀察時(shí)間等因素都會(huì)影響藥物的評(píng)價(jià)效果[19-21]。

3 基于PDX-NGS的藥物篩選有助于胰腺癌的靶向研究

靶向治療具有準(zhǔn)確、高效，毒副反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，是近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[22]，主要是依靠腫瘤的基因分析從突變的基因中識(shí)別出可干預(yù)的靶點(diǎn)，以便確定治療選擇，然而目前胰腺癌的研究中可干預(yù)靶點(diǎn)十分有限[23]。PDX模型和NGS技術(shù)的成功整合為腫瘤的靶向治療和個(gè)體化治療研究提供了有效的手段[24]。該研究模式主要是通過(guò)NGS技術(shù)對(duì)癌癥患者或PDX模型上的腫瘤組織行高通量基因檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)臨床療效肯定的靶點(diǎn)及可干預(yù)的潛在治療靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)藥物療效及分析耐藥機(jī)制，然后利用PDX模型對(duì)基因分析后預(yù)測(cè)的敏感藥物進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，最終將藥物篩選結(jié)果用于指導(dǎo)患者臨床用藥選擇，從而提供精準(zhǔn)的個(gè)體化治療方案。Guan等[8,9]發(fā)現(xiàn)，司美替尼(AZD6244)作為促分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MEk1)的高度選擇性抑制劑在胰腺癌PDX模型上療效確切，提示MEk1可能成為胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)該組胰腺癌PDX模型中腫瘤細(xì)胞的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(FGFR1)基因擴(kuò)增了3.1倍，略高于RECQL4、SOX2、MYC和PIK3CA等其余研究位點(diǎn)，隨后通過(guò)使用PDX模型對(duì)FGFR的抑制劑AZD4547進(jìn)行療效評(píng)估，發(fā)現(xiàn)該抑制劑對(duì)PDX模型能起到顯著治療效果，提示其可能是治療FGFR 1過(guò)表達(dá)型胰腺癌患者的有效藥物，同時(shí)，也證實(shí)了基于PDX-NGS的藥物篩選在識(shí)別胰腺癌治療靶點(diǎn)和個(gè)體化藥物篩選中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

4 PDX模型在靶向胰腺癌微環(huán)境研究中的應(yīng)用

胰腺癌細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞治療策略針對(duì)不同的個(gè)體存在較大差異，相比之下，其腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)異質(zhì)性較小，靶向腫瘤微環(huán)境具有高效、廣譜等優(yōu)勢(shì)[25]。胰腺癌細(xì)胞的快速增殖可導(dǎo)致局部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的相對(duì)缺乏，從而產(chǎn)生以缺氧和高代謝壓力為特征的TME。缺氧的TME可誘發(fā)腫瘤血管生成、免疫抑制及其他大量信號(hào)通路的產(chǎn)生，促進(jìn)癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[26]。胰腺癌基膜聚糖(lumican)可抑制胰腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在Ⅰ～Ⅲ期的胰腺癌患者中，原發(fā)腫瘤基質(zhì)中存在基膜聚糖的患者經(jīng)過(guò)治療后的生存時(shí)間比原發(fā)腫瘤基質(zhì)中無(wú)基膜聚糖的患者長(zhǎng)3倍[27]。Li等[26]使用胰腺癌PDX模型探究缺氧對(duì)胰腺星形細(xì)胞表達(dá)和分泌基膜聚糖的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧降低了基質(zhì)中星形細(xì)胞基膜聚糖的表達(dá)，并闡明了部分基質(zhì)中的基膜聚糖與腫瘤微環(huán)境分子間的相互作用及信號(hào)通路，為抗腫瘤治療提供新的理論依據(jù)。PDX模型較好地保留了患者腫瘤基質(zhì)成分，代表了部分人類基質(zhì)的性質(zhì)，適合作為靶向基質(zhì)微環(huán)境研究的動(dòng)物模型，但值得注意的是，隨著傳代次數(shù)增加，鼠源性的基質(zhì)會(huì)逐漸代替人源性基質(zhì)，目前尚無(wú)法明確這些基質(zhì)成分可保留多久[19]。

胰腺癌微環(huán)境中富含不同種類的參與固有免疫和適應(yīng)性免疫的免疫細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)下多數(shù)具有殺傷腫瘤的效應(yīng)性免疫細(xì)胞數(shù)量減少、功能喪失，這種顯著的免疫抑制狀態(tài)，影響了化療藥物抗腫瘤作用[25]。胰腺癌的免疫治療其核心是通過(guò)解除原有的免疫抑制, 重新增值活化并重啟免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的功能, 其中, T細(xì)胞功能的活化是至關(guān)重要。臨床試驗(yàn)證實(shí)[28], T細(xì)胞嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor T cells,CAR T)對(duì)包括實(shí)體腫瘤在內(nèi)的腫瘤治療具有良好的臨床療效。Jiang等[29]使用胰腺癌PDX模型對(duì)這種新型CAR T細(xì)胞進(jìn)行臨床前療效評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)抗間皮素CAR T細(xì)胞能有效抑制模型中移植瘤的生長(zhǎng)，提示相應(yīng)臨床途徑可能成為胰腺癌患者一種新的治療方式。此外，腫瘤免疫檢查點(diǎn)也是潛在的免疫治療靶點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞毒T細(xì)胞上的程序性死亡受體1分子(programmed death 1, PD-1)與腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡配體1(programmed death ligand 1, PD-L1)結(jié)合時(shí)，抑制T細(xì)胞激活，使得腫瘤細(xì)胞能逃脫免疫系統(tǒng)的殺傷，Cao等[30]研究表明，雙靶向配體利達(dá)霉素(dual-targeting ligand-based lidamycin)可抑制胰腺癌PDX模型上腫瘤生長(zhǎng)的部分原因可能是其抑制了PD-L1/PD-1信號(hào)通路，再次驗(yàn)證了腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑可能為治療胰腺癌潛在的新途徑。近期研究[31]表明，胰腺癌PDX模型中小鼠惡病質(zhì)的程度與腫瘤負(fù)荷無(wú)關(guān)，而與局部或全身的腫瘤免疫反應(yīng)密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選出與惡病質(zhì)發(fā)生程度密切相關(guān)的細(xì)胞因子，為免疫治療提供潛在的靶點(diǎn)，同時(shí)也證明了PDX模型在免疫治療靶點(diǎn)篩選中的重要價(jià)值。近年來(lái)，人源化腫瘤模型(humanized patient-derived xenograft, Hu-PDX)已逐漸被用于開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，研究證實(shí)人的造血干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生各種免疫細(xì)胞，相比常規(guī)的PDX模型，Hu-PDX模型在小鼠中重建了人體免疫微環(huán)境，因而更適用于腫瘤免疫反應(yīng)方面的研究[32]。加強(qiáng)對(duì)腫瘤微環(huán)境的研究，通過(guò)針對(duì)腫瘤細(xì)胞以及靶向重塑腫瘤微環(huán)境的雙重治療策略，必將在治療上實(shí)現(xiàn)新的突破。

5 展望

胰腺癌惡性程度極高，預(yù)后極差，深入了解治療失敗的機(jī)制，獲取更加高效的治療方案是亟需解決的問(wèn)題。人們嘗試建立胰腺癌人源性類器官(patient-derived organoids，PDOs)模型進(jìn)一步提高藥物篩選效能，該模型是直接使用患者腫瘤組織來(lái)進(jìn)行體外三維(3D)培養(yǎng)構(gòu)建的多細(xì)胞團(tuán)，較好地保留原發(fā)腫瘤組織的異質(zhì)性及生物學(xué)特性。相比PDX模型，PDOs具有培養(yǎng)周期短、成本低、成功率高等優(yōu)勢(shì)，并且由于類器官既可來(lái)源于腫瘤組織，又可來(lái)源于正常成體組織，故能夠用于研發(fā)出特異性針對(duì)腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞損傷較小的藥物。該技術(shù)可與PDX模型優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，共同推動(dòng)胰腺癌個(gè)體化研究的進(jìn)程[33,34]。

雖然胰腺癌PDX模型能代表腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，表現(xiàn)出不同的基因型和表型特征，可替代特定患者進(jìn)行個(gè)體化藥物篩選試驗(yàn)[35]。然而，2016年Nature[36]以及N Engl J Med[37]均發(fā)文對(duì)包括PDX模型在內(nèi)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提出質(zhì)疑，受適用人群、制模周期長(zhǎng)、成本高、腫瘤異質(zhì)性及耐藥性等影響，最終真正受益的患者僅占所有患者的1.5%[21]。為此，研究者們應(yīng)清醒地認(rèn)識(shí)到使用PDX模型指導(dǎo)臨床胰腺癌個(gè)體化治療獲益人群有限[23]。因此，在強(qiáng)調(diào)PDX模型個(gè)體化藥物篩選的同時(shí)，更應(yīng)關(guān)注共性研究的重要性[21,38]，通過(guò)整合基因數(shù)據(jù)、生物標(biāo)志物及藥物反應(yīng)性等信息，以建立相關(guān)的疾病數(shù)據(jù)庫(kù)的形式來(lái)優(yōu)化指導(dǎo)胰腺癌患者個(gè)體化治療可能會(huì)是更合理的選擇[35]。

目前，基于NGS-PDX的研究模式為胰腺癌個(gè)體化藥物篩選提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，為潛在的靶點(diǎn)篩選提供更廣闊的視野。隨著基因測(cè)序技術(shù)的普及、大數(shù)據(jù)與生物信息等交叉學(xué)科的不斷發(fā)展，胰腺癌PDX生物庫(kù)必將日趨完善。