蒙藥乳腺-Ⅰ號對大鼠乳腺增生組織中Prdx-1、GSTP和SOD蛋白表達(dá)的影響

王忠超 麻瑩 宋曉環(huán) 姚曉媛 朱莉 魏成喜 張彬

(1長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理教研室，吉林 長春 130031；2吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院；3內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院；4內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科)

乳腺增生癥本質(zhì)是非感染性慢性炎癥及非腫瘤性腫物的病變，目前發(fā)病率逐年升高，并趨向年輕化。蒙藥乳腺-I(M-I)號是內(nèi)蒙古自治區(qū)治療乳腺增生癥的傳統(tǒng)秘方〔1〕。通過對M-Ⅰ號處理后的大鼠乳腺組織進(jìn)行熒光差異雙向凝膠電泳(DIGE)和質(zhì)譜鑒定，在大鼠乳腺組織中檢測出16種與M-Ⅰ號治療相關(guān)的蛋白，其中3種蛋白〔過氧化物酶(Prdx)-1、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTP)、超氧化物歧化酶(SOD)〕與氧化損傷相關(guān)〔2〕。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討M-Ⅰ號對乳腺增生癥的治療機(jī)制，為推進(jìn)蒙藥的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物及主要試劑 雌性未孕Wistar大鼠(體重200～220 g)購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK-(吉)2016-0003。苯甲酸雌二醇注射液，購于杭州動物藥品廠；黃體酮注射液，購于浙江仙居制藥股份有限公司；Prdx-1，GSTP,SOD多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG，均購于上海善然生物有限公司。

M-Ⅰ號(哲衛(wèi)藥準(zhǔn)字：9604-79)處方由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供。大鼠給藥劑量根據(jù)臨床藥物劑量換算而得。

1.2分組及給藥 雌性未孕Wistar大鼠40只，隨機(jī)選出8只作為正常對照組，其余動物每日1次肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg連續(xù)25 d，隨后每日1次肌肉注射黃體酮4 mg/kg連續(xù)5 d，用于復(fù)制大鼠乳腺增生模型；同時(shí)，正常對照組大鼠肌肉注射橄欖油。模型復(fù)制成功后，隨機(jī)分為3組(每組8只)并給予相應(yīng)處理，模型對照組給予生理鹽水灌胃；M-Ⅰ號低劑量組給予M-Ⅰ號0.5 g/kg，高劑量組給予M-Ⅰ號3.0 g/kg灌胃，期間正常對照組給予生理鹽水灌胃，每天觀察大鼠狀態(tài)。給藥4 w后，禁食12 h，取大鼠左側(cè)乳腺組織用4%多聚甲醛固定。

1.3大鼠乳腺組織病理學(xué)檢查 大鼠乳腺組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋、切片和蘇木素-伊紅染色后在纖維鏡下觀察分析，對大鼠乳腺增生情況分級：輕度增生：小葉內(nèi)纖維組織增多，腺泡擴(kuò)張，數(shù)量增多，但腺泡及導(dǎo)管上皮無增生；重度增生：不僅腺泡數(shù)目增多，且腺泡擴(kuò)張及分泌現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)管上皮出現(xiàn)多層或乳頭狀改變；將正常、輕度、重度增生依次計(jì)為1、2、3分，對各組平均積分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠乳腺組織中Prdx-1,GSTP,SOD的表達(dá) 按照pv-6000通用型二步法檢測試劑盒操作步驟測定：先將組織切片進(jìn)行脫蠟和水化；3% H2O2去離子水孵育10 min；滴加一抗后室溫孵育2 h，用配好的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；滴加親和素室溫孵育20 min，PBS沖洗3次；滴加生物素-HRP室溫孵育30 min，PBS沖洗3次；應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色；自來水充分沖洗后蘇木素復(fù)染。采用Motic Images Advanced3.2軟件分析Prdx-1,GSTP,SOD免疫組織化學(xué)圖像中目標(biāo)總面積占選區(qū)總面積的百分比。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1M-Ⅰ號對大鼠乳腺組織Prdx-1,GSTP,SOD 表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型對照組乳腺組織中Prdx-1和GSTP水平顯著升高(P<0.01或P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對照組大鼠比較，M-Ⅰ號高劑量組Prdx-1、SOD水平明顯降低接近于正常對照組，GSTP水平仍高于正常對照組和模型對照組大鼠。見表1，圖1。

表1 各組乳腺組織Prdx-1,GSTP,SOD表達(dá)比較

與正常對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與模型對照組比較：3)P<0.05,4)P<0.01

圖1 各組乳腺組織中Prdx-1、GSTP和SOD的表達(dá)(HE，×400)

2.2大鼠乳腺組織病理學(xué)特征分析 纖維鏡下可見，正常對照組大鼠乳腺小葉呈散在分布，數(shù)量無明顯增高，腺泡未見擴(kuò)張和增多、腺腔內(nèi)無分泌物或僅有少許分泌物。模型對照組乳腺增生明顯，表現(xiàn)為乳腺小葉數(shù)量增多，腺泡及導(dǎo)管大量增生，腺泡高度擴(kuò)張并且分泌旺盛，導(dǎo)管上皮呈多層和(或)乳頭狀改變。和模型對照組比較，M-Ⅰ號各劑量組乳腺小葉數(shù)及腺泡數(shù)均少于模型對照組，乳腺腺泡數(shù)目及腔內(nèi)分泌物較少，導(dǎo)管管腔變小，體積縮小；M-Ⅰ號高劑量組中少數(shù)大鼠的乳腺結(jié)構(gòu)接近正常大鼠。模型對照組乳腺組織病理學(xué)評分〔(2.68±0.31)分〕明顯高于正常對照組〔(1.00±0.00)分，P<0.01〕，M-Ⅰ號低劑量組〔(1.78±0.49)分〕、高劑量組〔(1.24±0.67)分〕的病理學(xué)評分顯著低于模型對照組(P<0.05，P<0.01)。

3 討 論

M-Ⅰ號是內(nèi)蒙古自治區(qū)治療乳腺增生癥的傳統(tǒng)秘方，經(jīng)多年臨床觀察，療效安全可靠，是治療乳腺增生癥的良方〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制實(shí)驗(yàn)動物模型證明M-Ⅰ號對大鼠乳腺增生組織有明顯的改善作用，并能夠通過改變Prdx-1、GSTP、SOD 的表達(dá)來治療乳腺增生。

Prdx是細(xì)胞內(nèi)存在的一類抗氧化酶，對其認(rèn)識最初在于它們能催化氧化還原反應(yīng)使細(xì)胞里面過氧化氫水平保持恒定，這對于細(xì)胞進(jìn)行正?；顒雍凸δ苁种匾?〕。越來越多的證據(jù)表明，Prdx-1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔4〕；但至今為止Prdx-1在乳腺癌中的潛在作用仍然非常模糊。Bajor等〔5〕研究表明Prdx-1可作為人類乳腺癌的生物標(biāo)志物，Prdx-1下調(diào)顯著降低了MCF-7和ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞的生長速度；當(dāng) Prdx-1在乳腺癌組織中高表達(dá)時(shí)，增加了乳腺癌的惡性程度。O′Leary等〔6〕研究表明，Prdx-1通過其抗氧化功能，可以防止氧化應(yīng)激引起的ERα損失，從而可能導(dǎo)致乳腺腫瘤的雌激素受體陽性表型的維護(hù)。這證實(shí)了Prdx-1的生物學(xué)活性與乳腺癌雌激素介導(dǎo)信號的調(diào)控密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳腺增生大鼠乳腺組織中 Prdx-1表達(dá)明顯增高，M-Ⅰ號治療后Prdx-1表達(dá)明顯下降，提示Prdx-1參與了雌激素誘導(dǎo)的大鼠乳腺增生發(fā)生過程，而M-Ⅰ號能通過調(diào)節(jié)Prdx-1的表達(dá)改善乳腺增生的病理變化。

GSTP是GSTs蛋白超家族中最重要的亞族，在解毒、抗氧化、抗炎癥等過程中發(fā)揮著重要作用〔7，8〕。在本研究中，模型對照組大鼠乳腺組織中GSTP 表達(dá)明顯高于正常對照組，當(dāng)給予M-Ⅰ號治療后GSTP的表達(dá)明顯高于模型對照組，推測在大鼠乳腺增生組織中，氧化損傷或毒性物質(zhì)的作用使GSTP代償性表達(dá)增強(qiáng)，而M-Ⅰ號能夠促進(jìn)GSTP的表達(dá)。有研究表明，乳腺癌組織與癌旁組織比較，GSTP的表達(dá)明顯減少，主要原因是GSTP基因甲基化發(fā)生率升高〔9,10〕。M-Ⅰ號促進(jìn)GSTP表達(dá)的過程是否參與了抑制GSTP基因甲基化的過程，還有待進(jìn)一步研究。

SOD為自由基清除劑，能有效減輕由于自由基過量引起的脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜損傷、炎癥、腫瘤等的發(fā)生。在本研究中，模型對照組大鼠乳腺組織中SOD表達(dá)明顯低于正常對照組，當(dāng)給予M-Ⅰ號治療后SOD的表達(dá)明顯高于模型對照組大鼠，說明M-Ⅰ號能有效增加SOD的表達(dá)，通過減少自由基而減少氧化損傷對機(jī)體的影響。

綜上，M-Ⅰ號不僅可以明顯改善乳腺增生大鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)，還可以通過上調(diào)SOD、GSTP的表達(dá)、下調(diào)Prdx-1的表達(dá)而發(fā)揮治療作用。