麥冬皂苷D通過抑制PI3K/Akt信號通路減輕大氣細顆粒物對肺泡上皮細胞的氧化損傷

王瑩 唐興華 孫立燕 張珍珍 丁會

(1吉林大學白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春 130021；2山東大學齊魯醫(yī)院；3濰坊市中醫(yī)院)

隨著工業(yè)化的發(fā)展，大氣污染已成為人類健康的一大威脅。目前已知的大氣污染物約有100多種，但PM2.5(即空氣動力學直徑≤2.5 μm的細顆粒物)因其特殊性，已成為人類健康所面臨的最大環(huán)境風險。研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露可引起活性氧(ROS)產(chǎn)生增多，而ROS導致的氧化應激是PM2.5導致機體損傷的主要機制之一〔1，2〕。PM2.5隨呼吸進入肺組織，造成ROS在肺內(nèi)產(chǎn)生增多，過多的ROS作用于細胞膜引起脂質(zhì)過氧化，還可以消耗體內(nèi)抗氧化物質(zhì)使氧化還原系統(tǒng)失衡，導致組織細胞的氧化損傷，最終引起呼吸系統(tǒng)疾病〔3〕。麥冬皂苷(OP)-D是從麥冬中提取的一種甾體皂苷類化合物〔4〕。前期研究發(fā)現(xiàn)OP-D可通過抑制核因子(NF)-κB信通路減輕PM2.5誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應〔5〕，但OP-D是否可以減輕PM2.5誘導的氧化應激及作用機制尚屬未知。本文通過PM2.5誘導小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞(MLE-12)建立氧化應激模型，OP-D進行干預，從而檢測OP-D對PM2.5所致肺上皮細胞氧化應激反應是否具有抑制作用，并探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 OP-D(含量質(zhì)量分數(shù)≥98%，Biotoppe 公司)，PM2.5，DMEM培養(yǎng)基(Corning 公司)、胎牛血清(FBS，Transgen公司)、二甲基亞砜(DMSO，SIGMA公司)，胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)及雙抗(Transgen公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒及增強型電化學發(fā)光試劑(ECL)試劑盒(Thermo 公司)，細胞核蛋白提取試劑盒(SIGMA公司)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)一抗、p-NF-κBp65一抗、NF-κBp65一抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)及辣根過氧化物酶(HRP)-標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(ABclonal公司)，絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)和磷酸化(p)-Akt (Abcam公司)，超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其他試劑為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.2細胞培養(yǎng) 小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞(MLE-12)，購于中國科學院上海細胞所。MLE-12細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞用于實驗。

1.3藥物配制

1.3.1PM2.5懸濁液 用顆粒采樣器采集大氣PM2.5于玻璃纖維濾膜(孔徑2.5 μm)上，將載有 PM2.5 樣品的濾膜剪裁成小片并浸泡在無菌蒸餾水中，超聲震蕩60 min，無菌紗布過濾、干燥后獲得PM2.5 樣品，加入無菌PBS配制PM2.5懸濁液。應用前超聲震蕩滅菌30 min使顆粒物充分混勻。

1.3.2OP-D溶液 用DMSO配成質(zhì)量濃度為10 mmol/L的原液，實驗時再用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(DMSO濃度小于總體積的0.01%)。前期實驗發(fā)現(xiàn)，OP-D在<80 μmol/L的濃度內(nèi)對MLE-12細胞活力無明顯影響〔5〕。

1.4MDA含量與SOD活性檢測 實驗分為空白對照組、PM2.5組及OP-D低、中、高濃度(10、20、40 μmol/L)組。MLE-12細胞以2×105個細胞/ml接種于細胞培養(yǎng)皿中，細胞長至70%后，依既定濃度加OP-D于各濃度組中，預處理1 h后，在OP-D組及PM2.5組中分別加入PM2.5混懸液(終濃度80 μg/ml)培養(yǎng)24 h。分別收集各組細胞及細胞培養(yǎng)基上清。硫代巴比妥法檢測細胞上清液中MDA含量，操作步驟按照說明書進行。收集各組細胞沉淀后，超聲5 s×5次，使細胞破碎得到細胞勻漿，黃嘌呤氧化酶法檢測細胞裂解液中SOD 活性。

1.5Western印跡檢測 藥物處理后收集各組細胞，加入細胞裂解液提取目的蛋白。而后BCA法蛋白定量，加入上樣緩沖液煮沸變性 10 min，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗 4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后，加入ECL顯影液顯色。化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)下顯影成像，Image Lab5.2.1 軟件對目的條帶進行灰度掃描，以GAPDH為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1OP-D對MDA含量及SOD活性的影響 與空白對照組比較，PM2.5組及OP-D高、中、低劑量組中的MDA含量均明顯增高(P<0.05)，SOD 活性均明顯降低(P<0.05)。OP-D低、中、高濃度組MDA含量隨干預劑量的增加呈一定的下降趨勢，SOD活性呈一定上升趨勢，且OP-D中、高濃度組MDA含量顯著低于PM2.5組，SOD活性顯著高于PM2.5組(P<0.05,P<0.01)，見表1。

表1 各組MLE-12細胞培養(yǎng)基上清MDA含量及 SOD活性比較

與空白對照組比較：1)P<0.05;與PM2.5組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，表2同

2.2OP-D對PI3K、p-Akt和p-NF-κBp65蛋白表達量的影響 與空白對照組相比，PM2.5組細胞內(nèi)PI3K、p-Akt和p-NF-κBp65蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。而隨OP-D干預劑量的增加，PI3K、p-Akt和NF-κBp65蛋白表達呈濃度依賴性的下降，OP-D高濃度組可使各蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，但并未恢復至正常水平(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 各組PI3K、p-Akt、p-NF-κBp65 相對表達量的比較

3 討 論

PM2.5可以長時間懸浮于空氣中，吸附重金屬、有機物、細菌病毒等多種有害物質(zhì)，可經(jīng)呼吸系統(tǒng)最終進入血液，引起多器官的氧化應激損害。而實驗發(fā)現(xiàn)，OP-D可阻斷NF-κB和胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號級聯(lián)反應，抑制過氧化氫(H2O2)誘導的血管內(nèi)皮細胞的脂質(zhì)過氧化，進而抑制ROS的產(chǎn)生及氧化酶的活性，并提高細胞抗氧化能力〔6〕。還可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)素(catenin)信號通路，抑制氧化應激，使骨細胞功能障礙得到改善〔7〕。OP-D可能具有抑制PM2.5介導的氧化應激的作用，可能具有減輕PM2.5誘導的肺泡上皮細胞氧化應激的作用。

SOD 是細胞內(nèi)的抗氧化酶，其活性的高低可反映機體抗氧化損傷能力，而MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，二者常用于氧化應激的研究。研究顯示〔8〕，PM2.5作用于支氣管上皮細胞，能引起 SOD 的表達抑制,而使MDA等的表達增加,導致肺組織的氧化應激損傷。本研究結(jié)果顯示，PM2.5暴露可明顯降低肺泡上皮細胞內(nèi) SOD 活性并增加細胞上清液中MDA 含量，這一結(jié)論與相關(guān)報道一致〔9〕。而中高濃度的OP-D預處理，可拮抗PM2.5誘導的SOD 活性降低及MDA的增加，說明麥冬皂苷D能在一定程度上抑制PM2.5所致的氧化應激損傷。

PM2.5暴露所產(chǎn)生的ROS可激活一些信號通路，如PI3K/Akt，腫瘤相關(guān)蛋白53(p53)和NF-κB等，并對細胞產(chǎn)生一系列不利影響〔10，11〕。PI3K/Akt信號通路是一條重要的信號轉(zhuǎn)導通路，在細胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、基因組穩(wěn)定等多種功能。其中，Akt能夠促使活化的NF-κB隨后轉(zhuǎn)入細胞核，與啟動子和增強子序列位點發(fā)生特異性結(jié)合，促進目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達，參與免疫、炎癥和應激反應等過程〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露可通過抑制氧化應激介導的PI3K/Akt信號通路，導致NF-κB抑制蛋白激酶(IKK)-β/NF-κB的持續(xù)激活，使氣道上皮細胞產(chǎn)生炎癥反應〔13〕。本研究結(jié)果顯示，PM2.5顯著上調(diào)了PI3K的表達及Akt的磷酸化水平，而OP-D干預可降低細胞內(nèi)PI3K、p-Akt蛋白的表達，且其抑制作用隨濃度增大而更加明顯；并且PM2.5誘導的活化NF-κB p65也呈濃度依賴性的降低。據(jù)此推測OP-D可能通過抑制PI3K/AKT/ NF-κB信號通路，一定程度上減輕PM2.5 誘導的氧化損傷，從而保護肺泡上皮細胞。本實驗結(jié)果顯示，高劑量的OP-D并未能使PM2.5誘導的氧化應激反應完全被抑制，說明可能存在其他未知通路參與其中，有待進一步深入研究。