糖根甜菜營養(yǎng)成分的挖掘

程智超 王文浩

[摘 要]隨著現(xiàn)代社會人類對糖的需求，甜菜在民間一直保持極高的地位，從歐洲中世紀起，甜菜便融人了當?shù)厝嗣竦娘嬍成钪?，并且十分盛行。目前甜菜在歐洲、美國等種植較多，選育研究也達到很高水平，但我國對甜菜的研究在很長的時間里基本上屬于空白，僅因旅游業(yè)的發(fā)展及出口的需要，正逐年擴大甜菜的栽培面積，甜菜品種的選育工作也剛起步。為充分利用甜菜各種功能，本實驗選取了糖根甜菜進行代謝組學(xué)定性和定量分析，采用高效液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC–MS/MS）技術(shù)對他糖根甜菜 5 份具有代表性的材料進行代謝產(chǎn)物分析，在負離子模式下共檢測到了397個代謝物，利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對的代謝譜進行分析發(fā)現(xiàn)了糖根甜菜的營養(yǎng)成分，明顯為一步研究甜菜的營養(yǎng)成分和營養(yǎng)功能提供了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]糖根甜菜;代謝組學(xué);營養(yǎng)成分

[中圖分類號]S917.3 [文獻標識碼]A

1 概述

甜菜中除含有宏量營養(yǎng)素糖類、蛋白質(zhì)、脂肪外，還有包含其他不同種類的微量營養(yǎng)素，例如烯酸、核苷酸、氨基酸、維生素這些微量營養(yǎng)素是甜菜特質(zhì)性營養(yǎng)的分子基礎(chǔ)。甜菜的主要產(chǎn)品是糖，作為糖料作物開展的科學(xué)研究，至今僅有200多年。但目前食用甜菜在歐洲、美國等的選育研究也達到很高的水平，育成一批具有豐產(chǎn)抗病、高蛋白、中糖、高色素、低氮、低纖維等優(yōu)良性狀的食用甜菜品種。

甜菜同時具有比例合理的鈣、鎂，及可以幫助人體更好利用鈣的硼，且其高鉀低鈉的特性對高血壓患者是很有利的。1.對抗腫瘤;2.降脂保肝;3.降壓作用;4.生長刺激;5.保胃治肝?，F(xiàn)階段，利用甜菜收獲期次生代謝產(chǎn)物分析，更傾向于鑒別國外進口品種。對于國產(chǎn)甜菜血源及其他栽培種甜菜覆蓋面較小。因此原有標記一方面缺少科學(xué)性驗證，另一方面局限了可以鑒定的品種范圍。本研究的開展能夠為未來甜菜營養(yǎng)價值的確定提供更加科學(xué)準確的依據(jù)。

隨著生物物理學(xué)以及生物信息學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)作為研究生物體內(nèi)所有小分子代謝物的綜合性分析手段，其目的是開展生物系統(tǒng)中所有小分子代謝物進行全面整體、動態(tài)分析，更準確地確定代謝物動態(tài)變化?；趯μ鸩舜x物的定性定量分析，代謝組學(xué)可以用于研究代謝途徑或代謝網(wǎng)絡(luò)的解析，不同生物個體的代謝組學(xué)表型現(xiàn)象，不同疾病、藥物等物理、化學(xué)或病原生物刺激后代謝產(chǎn)物的應(yīng)答機制，以及食品、藥物等安全評價。

2 材料與方法

2.1 主要試劑與材料

甲醇（LC-MS級），乙腈（LC-MS級），醋氨酸（LC-MS級），氨水（LC-MS級）均購買于CNW Technologies。L-2-氯苯丙氨酸（≥98%）購買于上海恒柏生物科技有限公司。

2.2 代謝組測定分析

2.2.1 代謝物鑒定與定量

由黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院提供的代表性質(zhì)資源，所有糖根甜菜均在相同繁育基地相同條件種植，待植株完全成熟后收獲移取100μL樣本至1.5ml EP管中，加入300μL甲醇，再加入20μL內(nèi)標，渦旋混勻30秒;超聲10min（冰水浴）;零下20℃ 靜置一小時;將樣本放置4℃，13000rpm離心15min;小心地取出200μL上清于2mL進樣瓶，每個樣本各取20μL混合成QC樣本，再取200μL上機檢測。將磨樣進行粉碎，至于磨口玻璃樣品瓶中保存在冰箱中通過質(zhì)譜特征結(jié)合保留指數(shù)的方法對甜菜進行定性分析，對質(zhì)譜分析后的代謝物數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，并基于自建數(shù)據(jù)庫及其他公共數(shù)據(jù)庫，對質(zhì)譜檢測的一級譜二級譜數(shù)據(jù)進行定性分析，得到樣本表達的代謝物組分信息。然后對所有代謝物質(zhì)譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正，對代謝物進行定量。

2.2.2 代謝物分析

對比糖根不同實驗組的之間的代謝物，采用ANOVA、T-test等檢驗方法進行差異分析。差異判斷標準為差異倍數(shù)大于2，且P value<0.05。得到糖根甜菜代謝物，對其理化性質(zhì)進行分析。

2.2.3 代謝物KEGG富集分析

生物體中的復(fù)雜代謝反應(yīng)及其調(diào)控并不單獨進行，往往由不同基因和蛋白質(zhì)形成復(fù)雜的通路和網(wǎng)絡(luò)，它們的相互影響和相互調(diào)控最終導(dǎo)致代謝組發(fā)生系統(tǒng)性的改變。對這些代謝和調(diào)控通路的分析可以更全面，更系統(tǒng)的了解實驗條件改變導(dǎo)致的生物學(xué)過程的改變，性狀或疾病的發(fā)生機理和藥物作用機制等生物學(xué)問題。利用KEGG代謝通路富集分析并通過MBRole（http：//csbg.cnb.csic.es/mbrole2/）獲取代謝物的KEGG ID。

3 結(jié)果與分析

測定的糖根甜菜代謝組學(xué)數(shù)據(jù)用系統(tǒng)自帶軟件Analyst 1.6.1進行數(shù)據(jù)處理，采用MRM模式采集二級數(shù)據(jù)對代謝物進行定量分析。最終獲得糖根甜菜中代謝物結(jié)構(gòu)和含量信息，對397個代謝物進行了定性分析，推斷出33個代謝物可能的結(jié)構(gòu)。

利用鑒定397個代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組可覆蓋：磷酸合成，嘌呤代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，5（s），14（R）-脂蛋白B4和對氯苯基丙氨酸代謝，N-乙酰-L-苯丙氨酸和α-N-乙酰L-谷氨酰胺代謝等33條代謝路徑，基本覆蓋了KEGG中常見次生代謝物的代謝路徑，為發(fā)掘糖根甜菜營養(yǎng)成分打下很好的基礎(chǔ)。

4 討論

本章采用GC-MS非靶向代謝全譜分析方法對糖根甜菜進行了研究。GC-MS非靶向代謝全譜分析通過XCMS自動提取到397離子的33個代謝物含量信息，主要包括游離的氨基酸、脂肪酸、磷酸、甘油、脂肪酸、糖類或醇等。為進——步研究糖根甜菜的特質(zhì)性營養(yǎng)功能提供基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1] 盧秉福.耿貴.周艷麗.食用甜菜的開發(fā)應(yīng)用[J].中國糖料，2008（02）.

[2] 黃曉榮.基于代謝組學(xué)的黑芝麻黑花生營養(yǎng)成分挖掘與識別研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2017.

[3] 吳謙.基于多種分析技術(shù)的肺癌代謝組學(xué)研究[D].上海交通大學(xué)，2014.

[4] 張會敏.古井貢酒微生物群落結(jié)構(gòu)及其與主要風味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)研究[D].哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2017.

[5] 彭可壟.復(fù)方鹽酸吡格列酮格列美脲臨床藥代動力學(xué)[D].華中科技大學(xué)，2011.

[6] 彭可壟.子宮內(nèi)膜異位癥芳香化酶P450基因表達及其臨床意義[D].廣州醫(yī)學(xué)院，2002.

[7] 張然然，王磊，李洋，等.基于代謝組學(xué)技術(shù)的鹿血與鹿茸血鑒別研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報2018（07）.

[8] 賈遂賓.基于小波的基因差異表達建模分析[D].哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2015.

[9] 付旭平.基因芯片數(shù)據(jù)分析[D].復(fù)旦大學(xué)，2005.

[10] López-Ibá?ez J， Pazos F， Chagoyen M. MBROLE 2.0—functional enrichment of chemical compounds[J].Nucleic acids research，2016： gkw253.

[11] 王艷.鐵皮石斛與炭疽菌互作機制的初步探討[D].廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[12] 池毓斌.欖果實品質(zhì)特性及其代謝組學(xué)的初步研究[D].福建農(nóng)林大學(xué)，2017.

[13] 何昀潞.基于穩(wěn)定同位素標記--質(zhì)譜技術(shù)對吸煙者與非吸煙者血漿羧酸類差異代謝物的研究[D].中國煙草總公司鄭州煙草研究院，2018.