HPLC-MS/MS法測定人體血液中文拉法辛的濃度

包東偉

摘 要：目的：建立檢測血液中文拉法辛的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法。方法：以乙腈為沉淀劑，經(jīng)蛋白質(zhì)沉淀，取上清液進(jìn)高效液相串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（LC-MS/MS）分析。結(jié)論：該方法操作簡單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，可用于血液中文拉法辛的定量測定。

關(guān)鍵詞：文拉法辛;血液;高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號：R115 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）23-0250-02

文拉法辛（venlafaxine）是一種全新的口服抗抑郁藥，用于治療抑郁癥和廣泛性焦慮癥，是5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑，具有雙抽抑制作用。因其起效較快且不良反應(yīng)較小，已逐漸成為抗抑郁的一線藥物[1]。文拉法辛在體內(nèi)主要通過肝臟細(xì)胞色素P450酶代謝，生成主要活性代謝產(chǎn)物O-去甲基文拉法辛。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)文拉法辛血藥濃度的測定方法較多，包括熒光檢測法[2]、高效液相色譜法[3]、質(zhì)譜檢測法[4-6]等。本文建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），采用蛋白沉淀方法測定血液中文拉法辛濃度。

1 材料與試藥

1.1 儀器

臺式三重四極桿串接質(zhì)譜系統(tǒng)（含ESI電噴霧離子源）;U3000二元超高效LC;德國賽多利斯Quintix35-1CN。

1.2 試劑

鹽酸文拉法辛，批號：100543-201602，純度：99.9%，中國食品藥品檢定研究院。

1.3 色譜條件

分析柱為：Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm，流動相為乙腈：20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液（70：30），流速為200μL/min。柱溫為常溫。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（H-ESI）正離子選擇多反應(yīng)檢測（SRM）掃描分析，定量分析離子對分別為：m/z 278.212→m/z 57.97（文拉法辛）;m/z 290.125→m/z 198.054（地西泮-d5）。

2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

在空白血液中分別加入文拉法辛的工作液，配置成文拉法辛濃度分別為1、10、50、100、250、500ng/mL的血液標(biāo)準(zhǔn)液。

3 血液樣品處理

精密量取100μL血液，加入內(nèi)標(biāo)50μL和沉淀劑乙腈900μL，混旋2min，10000轉(zhuǎn)/min離心2.5分鐘，取上清液1μL供LC-MS/MS分析。

4 方法考察

4.1 專屬性

分別取6份不同來源的不服用文拉法辛的正常人空白血液100μL，不加內(nèi)標(biāo)，按“血液樣品處理”項(xiàng)處理，進(jìn)樣分析，得空白樣品色譜圖。另取空白血3份，1份加內(nèi)標(biāo)，1份加分析物，1份加內(nèi)標(biāo)和分析物，同法處理，得相應(yīng)色譜圖。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下線

含藥標(biāo)準(zhǔn)曲線血液按“血液樣品處理”處理后進(jìn)樣分析。以文拉法辛添加濃度為X軸，樣品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為Y軸，進(jìn)行線性回歸，經(jīng)“Equal”權(quán)重得文拉法辛標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

4.3 精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率

取24份空白血液，分別配制定量下線及低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品各6份，按“血液樣品處理”項(xiàng)處理，進(jìn)樣分析，連續(xù)測定3批，計(jì)算精密度和準(zhǔn)確度。

分別配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各8份，其中6份于提取前加入工作液和內(nèi)標(biāo)，另2份于提取后加入工作液和內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣分析，計(jì)算提取回收率。

4.4 穩(wěn)定性

制備低、高質(zhì)量濃度的血液質(zhì)控樣品，分別考察在常溫光照放置24h、反復(fù)凍融3次、-70℃凍存1個月、進(jìn)樣器內(nèi)24h條件下的穩(wěn)定性。

4.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別取6種不同來源的空白血清90μL，按“血液樣品處理”處理，得空白基質(zhì)后，分別加入低、高質(zhì)量濃度工作液10μL及內(nèi)標(biāo)50μL，制備成基質(zhì)考察樣品，進(jìn)樣分析，得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)1。用去離子水代替血液，同法操作，得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)2。內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子=A1/A2×100%。

5 結(jié)果

5.1 專屬性

文拉法辛的保留時間約為3.22min，地西泮-d5的保留時間約為1.83min，血液中內(nèi)源性物質(zhì)對目標(biāo)分析物及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的測定無干擾，專屬性好，見圖1。

左及中：空白血液，右上：空白血液添加內(nèi)標(biāo)，右中：空白血液添加分析物，右下：空白血液添加內(nèi)標(biāo)及分析物。

5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

文拉法辛的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.00173148+0.00604996* X（R^2=0.9991），定量下線為1ng/mL（S/N≥10：1），線性范圍為1～500ng/mL。

5.3 精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率

文拉法辛定量下線的批間精密度（RSD）為18.80%，其余在3.38～7.76%之間，準(zhǔn)確度為87.83～102.98%，結(jié)果見表1。在低、中、高質(zhì)量濃度下，文拉法辛的平均提取回收率為101.33～104.61%，結(jié)果見表1。

5.4 穩(wěn)定性

含藥血液質(zhì)控樣品在常溫光照下放置24h、反復(fù)凍融3次、-70℃凍存1個月、進(jìn)樣器內(nèi)24h各條件下穩(wěn)定，RSD小于15%。

5.5 基質(zhì)效應(yīng)

文拉法辛在低和高2個質(zhì)量濃度水平下的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子RSD分別為3.61%、4.54%，小于15%，樣品測定不受基質(zhì)效應(yīng)影響。

6 討論

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS建立的檢測人血液中文拉法辛的方法，所需血液樣品量少，專屬性好，靈敏度高，準(zhǔn)確穩(wěn)定。以乙腈為沉淀劑，采用蛋白沉淀法處理樣品，簡單快捷，可快速對樣品進(jìn)行定性定量分析。

參考文獻(xiàn)

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