人參花中人參皂苷Re和Rg1成分提取工藝優(yōu)選

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(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

人參花系采集五加科(Araliaceae)植物人參(PanaxGinsengC.A.Meyer)生長(zhǎng)4年以上的花蕾，我國(guó)人參的野生及栽培地區(qū)主要包括吉林、遼寧、黑龍江及河北北部的山地。人參花，性溫和，味甘、微苦。據(jù)史書《本草綱目》記載，人參花性溫和，味甘微苦，具有清熱消炎、平肝清火、解毒利咽、降血壓、頭昏、目眩、失眠、耳鳴、暗瘡、青春痘、急性咽喉炎等諸多醫(yī)療保健作用[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明人參花中的皂苷具有增強(qiáng)免疫力、防治心血管疾病、安神、提高思維能力、改善記憶力、防治老年癡呆、抗癌、抗疲勞、抗衰老等功效[4-8]。

人參花中的活性成分主要為人參皂苷，具有促智作用的人參皂苷Re和Rg1分別約占人參總皂苷含量的41.07%和10.47%。根據(jù)對(duì)人參根中這兩種皂苷的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re和Rg1具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙，抗老年癡呆的作用[9-12]，其分子結(jié)構(gòu)見圖1。說明人參花總皂苷中一半以上成分具有改善學(xué)習(xí)障礙和促智的作用，因此開發(fā)人參花的藥用價(jià)值意義十分重大。本試驗(yàn)采用正交分析法，以人參皂苷Re和Rg1的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選人參花中人參皂苷Re和Rg1成分的提取工藝，為合理開發(fā)利用人參花提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 人參皂苷Re、Rg1 化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見分光光度計(jì)TU-1810(北京普析通用儀器有限公司)；分析天平FA2004A(上海精天電子儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)FDU-1100(日本EYELA儀器公司)；粉碎機(jī)(德國(guó)IKA集團(tuán))；Agilent RRLC-Q-TOF/6520 包括Agilent RRLC色譜儀(配備1200SL二元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、SL+標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、自動(dòng)進(jìn)樣器控溫模塊、智能柱溫箱)；Agilent 6520 Q-TOF質(zhì)譜儀(配備雙噴霧ESI源，自動(dòng)校準(zhǔn)系統(tǒng))。

1.2 儀器條件

色譜條件：Agilent SB-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm，600 bar)，柱溫35℃；采用二元線性梯度洗脫：流動(dòng)相(A)為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相(B)為乙腈。梯度洗脫： 0～13min ( 18%B～46%B)，13～20 min(46%B～50%B)，20～23 min(50%B～90%B)，23～25 min (90%B)；流速為0.3 mL/min；樣品進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧負(fù)離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z100～2200，干燥氣流量(N2)為8.0 L/min，干燥氣溫度為350 ℃，霧化氣壓力為255 kPa，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，碎裂電壓為200 V，錐孔電壓為65 V，八極桿射頻電壓為250 V。樣品測(cè)試前，需使用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，質(zhì)量誤差小于1 ppm。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Masshunter Qualitative Analysis(B.03.01)分析軟件處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

人參花(采于吉林撫松)；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Re和Rg1(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；乙醇、冰醋酸、高氯酸鉀(均為分析純，北京化工廠)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)；甲酸(色譜純，aladdin)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)。

2 方法

2.1 人參皂苷Re/Rg1含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別精密稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品、Rg1標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg，用80%色譜甲醇溶解并定容至1 mL。分別精密吸取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品、Rg1標(biāo)準(zhǔn)品各120 μL，用80%色譜甲醇定容至1 mL，配成120 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別以12、24、48、72、96、120 μg/mL進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣三次，以濃度x對(duì)色譜峰面積y進(jìn)行線性回歸。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取人參花水提物1 mg，用80%色譜甲醇溶解并定容至1 mL，精密吸取400 μL，用80%色譜甲醇定容至1 mL，配成濃度為400 μg/mL的樣品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶中，通過RRLC-Q-TOF MS 測(cè)定Re/Rg1的含量。

2.2 提取工藝優(yōu)化

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):試驗(yàn)因素與水平：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)水用量(A)、提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)進(jìn)行條件優(yōu)選，考察指標(biāo)為RRLC-Q-TOF-MS方法測(cè)定人參花中人參皂苷Re和Rg1的含量(以下均寫為Re/Rg1的含量)。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 人參花中人參皂苷Re、Rg1含量正交試驗(yàn)因素水平

取適量人參花粉碎，過3號(hào)篩，稱取9份，每份15 g，提取前用水浸泡1 h，50 V加熱回流提取，合并提取液，濃縮，冷凍干燥，得人參花水提液干粉。

3 結(jié)果

3.1 RRLC-Q-TOF-MS定量分析

3.1.1 Re/Rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用RRLC-Q-TOF MS技術(shù)測(cè)定人參皂苷Re/Rg1的含量，在負(fù)離子模式下，一級(jí)全掃描質(zhì)譜(MS)中，Re和Rg1分別給出 [M-H]-離子m/z 945.54和m/z 799.45，見圖2。圖2a中峰1和圖2b中峰2分別為人參皂苷Re 和Rg1的RRLC-Q-TOF-MS的[M-H]-離子m/z 945.54和m/z 799.45提取離子流圖。以標(biāo)準(zhǔn)品Re/Rg1進(jìn)樣濃度x為橫坐標(biāo)，色譜峰面積y(峰面積A×10-6)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=394171x+817373，R2=0.9954。

圖2 負(fù)離子模式下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中人參皂苷Re和Rg1的離子流

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“1.2”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算人參皂苷Re/Rg1的RSD分別為：日內(nèi)精密度RSD為0.92%；連續(xù)3天同法測(cè)定，日間精密度RSD為0.97%。說明儀器精密度良好，方法可行。

3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24h測(cè)定各組分的含量，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果RSD為2.45%(n=6)，表明供試品溶液在實(shí)驗(yàn)條件下24 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品，按“2.1.2”項(xiàng)下配制供試品溶液，平行6份，按“1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。計(jì)算人參皂苷Re/Rg1平均含量(n=6)RSD為0.91%。說明該方法重復(fù)性良好。

3.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的人參花總皂苷提取物供試品6份，按“2.1.2”項(xiàng)下配制供試品溶液，分別精密加入人參皂苷Re和Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度均為1mg/mL)各100 μL ，按“1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定人參皂苷Re/Rg1含量，計(jì)算回收率為98%，RSD為0.89%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，測(cè)定結(jié)果真實(shí)、可靠。

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用RRLC-Q-TOF-MS測(cè)定單體皂苷Re/Rg1的含量，以Re/Rg1的含量為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2和表3。

由方差分析表可知，因素A、B有顯著性(P<0.05)，C無顯著性影響。根據(jù)直觀分析表可知，其影響因素大小依次為B > A > C。最佳提取工藝為A3B3C1，即最佳提取工藝為12倍量水，提取3次，每次1 h。表2為以Re/Rg1的含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果，表3為以Re/Rg1含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取適量人參花粉碎，過3號(hào)篩，稱取15 g藥材，加入12倍量水，50V加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮，冷凍干燥，得人參花水提液干粉。按照所建立RRLC-Q-TOF-MS方法定量，測(cè)定結(jié)果為Re/Rg1在生藥材中的含量是158.14 mg/g。證明所確定的提取工藝切實(shí)可行。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

4 結(jié)語

人參花口服液主要成分為人參皂苷，其中人參皂苷Re的含量最高，人參皂苷Re和Rg1具有改善學(xué)習(xí)障礙、增強(qiáng)記憶力和促智的作用。本研究以人參皂苷Re和Rg1為對(duì)照品，利用RRLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)人參花中人參皂苷Re和Rg1的含量進(jìn)行了測(cè)定，并采用正交試驗(yàn)確定了人參花中人參皂苷Re和Rg1成分含量的最佳提取工藝為料液比1∶12，提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為1h。本研究提取工藝為人參花中人參皂苷Re和Rg1的定性、定量分析提供了方法，為人參花的合理開發(fā)提供了依據(jù)。