龍膽草總酚含量測定和自由基清除活性研究

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(1.廣西中醫(yī)藥大學 藥學院，廣西 南寧530001；2.南寧師范大學 化學與材料科學學院，廣西 南寧 530001)

研究表明，帕金森癥等眾多疾病與人體內(nèi)自由基失衡有關，因此，尋找具有良好自由基清除能力的天然抗氧化劑成為研究的熱點之一[1，2]。龍膽草(Gentianarigescens)是龍膽科龍膽屬植物，多年生草本，高30～60cm；根莖平臥或直立，短縮或長達5cm，具粗壯、略肉質(zhì)的須根；花枝單生，直立，黃綠色或紫紅色，中空，近圓形，具條棱，棱上具乳突，稀光滑。龍膽草具有清熱燥濕、瀉肝定驚的功效，可用于治療濕熱黃疸、小便淋痛、陰腫陰癢、濕熱帶下、肝膽實火之頭脹頭痛、目赤腫痛、耳聾耳腫、脅痛口苦、熱病驚風抽搐等病證[3]。目前，對于龍膽草的抗氧化能力未見報道。本研究采用不同溶劑對龍膽草進行提取，得到龍膽草的乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物，并測定其提取物的總酚含量和自由基清除能力。

1 材料與儀器

UV1901型紫外可見分光光度計(北京普析電子科技有限公司)；地膚子從廣西玉林藥材市場購買；沒食子酸標準品從百靈威試劑公司(北京)購買。

2 方法

2.1 龍膽草不同溶劑提取物的制備

將龍膽草剪碎后打成粉末，取20 g龍膽草粉末放入圓底燒瓶，分別加入200 mL乙醇、丙酮及乙酸乙酯。冷浸72 h后將提取液倒出，加入新的溶劑，重復浸泡3次。將提取液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑回收，得到龍膽草的乙醇、丙酮及乙酸乙酯提取物。

2.2 ABTS·+自由基清除能力測定[4]

將50 mL的2 mM的2,2'-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)溶液與200 mL K2S2O8水溶液(70 mM)混合，搖勻后避光12～16 h得到ABTS·+溶液，并用磷酸鹽緩沖液將其稀釋至73 nm處，吸光度為(0.70±0.02)。取一定量提取物溶液，加入1.9 mLABTS·+溶液，在不同時間點測其吸光度并計算提取物對ABTS·+自由基清除率。

2.3 總酚含量測定

2.3.1 Folin-Ciocalteu試劑的配制 在圓底燒瓶中裝入80 g鎢酸鈉和20 g鉬酸鈉，加入 560 mL蒸餾水，溶解后加入40 mL磷酸溶液(85%)和80 mL濃鹽酸，回流10 h后加入12 g硫酸鋰及60 mL雙氧水，加熱沸騰15min至溶液呈亮黃色，冷卻后定容至1 000 mL。

2.3.2 提取液中總酚含量的測定 將龍膽草提取物溶液分別加入1 mL Folin-Ciocalteau試劑，混合均勻。加入3 mL 2 % Na2CO3溶液后用蒸餾水定容到10 mL，2 h后測量溶液在760 nm處的吸光度。提取液中總酚含量根據(jù)回歸方程計算。

3 結果

3.1 不同濃度提取物對ABTS·+自由基清除能力的影響

龍膽草乙醇提取物對ABTS·+自由基的清除能力如圖1所示?？梢姡S著提取物濃度增加，乙醇提取物對ABTS·+自由基的清除能力增強。在作用時間為5 min時，濃度為0.5 mg/mL的乙醇提取物對ABTS·+自由基的清除率為17.7 %，當濃度增加到1.0 mg/mL時清除率增大到25.5 %。同時，EE對ABTS·+自由基的清除能力與作用時間有關。對于濃度為1.8 mg/mL的乙醇提取物，1 min時對ABTS·+自由基的清除率為38.6 %，當作用時間增加到10 min，其對ABTS·+自由基的清除率增加到58.8 %。

圖2顯示不同濃度龍膽草丙酮提取物對ABTS·+自由基的清除能力。丙酮提取物的ABTS·+自由基清除效果隨不同提取物濃度和作用時間的變化規(guī)律與乙醇提取物相似。隨著提取物濃度和作用時間增加，丙酮提取物對ABTS·+自由基的清除能力增加。作用時間為5 min時，提取物濃度為0.5和0.8 mg/mL的丙酮提取物對自由基清除率分別為15.9 %和26.2 %，濃度為1.5 mg/mL和1.8 mg/mL時清除率分別為39.4 %和46.9 %，當濃度增加為2.0 mg/mL時清除率達到71.1 %。對于濃度為1.8 mg/mL的丙酮提取物，其對ABTS·+自由基的清除能力從1 min時的52.4 %迅速增加到10 min時的66.7 %。

3.2 不同溶劑提取物對ABTS·+自由基清除率的比較

龍膽草不同溶劑提取物在10 min時對ABTS·+自由基清除能力如圖3所示。在最低濃度0.5 mg/mL時，丙酮提取物的清除率為17.0 %，乙醇提取物和乙酸乙酯提取物的清除率分別為20.2 %和22.8 %。在1.0 mg/mL時，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和丙酮提取物對ABTS·+自由基清除率分別為31.9 %、35.8 %和32.5 %。在最高濃度2.0 mg/mL時，丙酮提取物表現(xiàn)出最強的清除能力，其對ABTS·+自由基清除率為77.0 %。

3.3 不同溶劑提取物總酚含量測定結果

龍膽草乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和丙酮提取物的總酚含量分別為31.3 mg/g、21.9 mg/g和30.2 mg/g。三種提取物都具有較高的總酚含量，其優(yōu)良的自由基清除效果可能與其含有的酚類成分有關。

圖1 龍膽草乙醇提取物對ABTS·+自由基的清除能力

圖2 龍膽草丙酮提取物對ABTS·+自由基的清除能力

圖3 龍膽草溶劑提取物對ABTS·+自由基的清除能力

提取物EC50(mg/mL) 乙醇提取物1.41乙酸乙酯提取物1.70丙酮提取物1.53

4 結論

在本研究中，我們用不同溶劑對龍膽草進行提取，得到龍膽草的乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物，通過測定其提取物的總酚含量和自由基清除能力。結果表明，龍膽草三種溶劑提取物都表現(xiàn)出良好的自由基清除能力，其對ABTS·+自由基的EC50值在1.41～1.70 mg/mL范圍內(nèi)，表明三種溶劑提取物對這類自由基均表現(xiàn)出良好的清除效果。隨著濃度和時間的增加，提取物對ABTS·+自由基的清除能力增強，表明三種提取物優(yōu)良的自由基清除效果可能與其含有的酚類成分有關。