全真一氣湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠整聯(lián)蛋白水平的影響

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(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，福建 福州 350003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)作為呼吸系統(tǒng)的常見病之一，若延誤治療，將會演變?yōu)槁苑卧葱孕呐K病。肺血管重塑是COPD病情發(fā)展中的重要病理過程[1]，且在COPD初期即有肺血管的改變形成，若不及時控制將會使病情進(jìn)行性惡化。研究表明[2]，COPD組患者肺小動脈存在明顯的肺血管重塑現(xiàn)象，在COPD大鼠實(shí)驗(yàn)中亦見相同結(jié)果[3]。整聯(lián)蛋白αM(Integrin Alpha M，ITGAM)在COPD患者中高表達(dá)[4]，且ITGAM的減少可延緩由慢性缺氧引起的肺動脈高壓的發(fā)展[5]。全真一氣湯系明朝醫(yī)學(xué)家馮兆張著作中的方劑[6]，臨床上使用此方治腎不納氣型COPD患者，頗具療效[7-8]。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，使用全真一氣湯干預(yù)COPD模型大鼠，檢測大鼠右肺組織中ITGAM基因及蛋白水平，探討全真一氣湯對COPD大鼠ITGAM水平的影響，旨在為全真一氣湯治療COPD提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

18只清潔級SD大鼠采購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號：70092411)的(180～220 g)。本研究醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)于福建中醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)中心鼠類實(shí)驗(yàn)室開展，清潔級。動物使用規(guī)范符合《福建省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會管理?xiàng)l例》。

1.2 藥物

采用由全真一氣湯生藥制成40%的中藥濃縮湯劑，按0.4 mL/20 g劑量喂養(yǎng)，每日上午8∶00-9∶00灌胃1次。中藥制法：①稱取生藥226 g，于水中浸泡30 min后，再由電爐加熱至沸騰，沸騰后再煎30 min，取濾液；②取濾渣，注水，二次加熱至沸騰后，再煎20 min，再次過濾；③2次濾液混合，加熱濃縮至體積為226 mL，相當(dāng)于原材料1.0 g/mL。原藥材由福建省藥材公司提供，中藥濃縮湯劑全程由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑中心加工完成。

1.3 試劑與儀器

SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒(TaKaRa公司, Code：DRR820A)；RNAiso Plus(TaKaRa公司，Code：D9108A)；ExScriptTM RT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa公司, Code：DRR037A)；Rat_Gapdh_primer(TaKaRa公司，Code：D379212)；兔抗大鼠ITGAM抗體(美國Santa Craz公司)；戊二醛(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；四氧化鋨(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；7500Fast實(shí)時熒光定量PCR儀(美國 ABI公司)；Westen-blotting(美國 BIO-RAD)。

2 方法

2.1 動物模型建立、分組及給藥方法

將18只SPF級大鼠隨機(jī)分成模型組、中藥組，每組各9只。模型組、中藥組分別于實(shí)驗(yàn)第1天、第11天、第21天使用10 %水合氯醛將大鼠麻醉，手術(shù)暴露氣管，經(jīng)氣管注入內(nèi)毒素LPS 200 μL(1 mg/mL)。兩組大鼠自第2天起連續(xù)煙熏造模，具體為將其放置于30 cm×40 cm×50 cm的有機(jī)玻璃熏箱中，箱中煙熏濃度維持于5%左右，煙熏30 min后移至通風(fēng)處，共60 d(氣管內(nèi)滴注日不煙熏)。于第2天起，模型組大鼠予以生理鹽水5 mL/d灌服，中藥組大鼠予以全真一氣湯濃縮液(生藥制成40 %的濃縮湯劑，按0.4 mL/20 g/d)灌服，兩組均連續(xù)灌服60 d。第60天，于每組隨機(jī)取3只大鼠用于取材，取材部位為右肺組織，取材完畢后用消毒錫箔紙將肺組織標(biāo)本包裹并速凍于液氮中，再轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，以便用于實(shí)時熒光定量PCR及Western Blot檢測。

2.2 觀察指標(biāo)與測定方法

2.2.1 實(shí)時熒光定量PCR檢測 取右肺組織，采用TRIzol(invitrogen)法抽提取總RNA后，用ExScriptTM RT Reagent Kit試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再由SYBR Premix Ex Taq II試劑盒以7500 Software v2.0.5進(jìn)行熒光擴(kuò)增。使用SYBR Green I嵌合熒光法，引物設(shè)計參照 Genebank序列，該序列由自寶生物工程(大連)有限公司合成，基因的上下游引物序列檢測情況見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參照。將模型組mRNA的表達(dá)量表示為“1”，再通過校正值計算出中藥組mRNA的相對含量，并比較組間相對量。

2.2.2 Western blot檢測ITGAM蛋白水平 稱量后的組織塊按比例(1∶10)加入對應(yīng)的裂解液中進(jìn)行勻漿，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度。加入buffer，100 ℃變性后，取20 μg電泳，轉(zhuǎn)膜，于室溫條件下將之浸入于含5 %脫脂奶粉并封閉1 h，加入一抗(ITGAM；CST公司)，4 ℃孵育過夜，次日加入二抗(碧云天，HRP標(biāo)記)，室溫孵育lh，使用TBST將其充分洗滌后，標(biāo)本膜上的信號由增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL)檢測。

表1 檢測基因的引物序列和產(chǎn)物長度

3 結(jié)果

3.1 PCR結(jié)果

中藥組大鼠ITGAM mRNA表達(dá)水平較模型組降低，其表達(dá)豐度為模型組的0.630，P值為0.0026(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖1。

表2 模型組與中藥組大鼠ITGAM mRNA表達(dá)比較

圖1 模型組與中藥組大鼠ITGAM mRNA表達(dá)比較

注：中藥組與模型組比較，P<0.05。

3.2 Western blot檢測

中藥組大鼠ITGAM蛋白表達(dá)水平較模型組下調(diào)。見圖2。

圖2 各組大鼠ITGAM蛋白表達(dá)水平

4 討論

COPD是可預(yù)防以及治療的疾病，其發(fā)病機(jī)制的核心是氣道和肺組織(如肺血管、肺實(shí)質(zhì))長期持續(xù)的炎癥病變，而肺血管存在的持續(xù)性炎癥改變與肺血管重塑緊密相關(guān)[9]，且與COPD相關(guān)的慢性低氧、炎癥以及吸煙會誘導(dǎo)肺血管重塑形成。研究表明[10]，COPD肺血管重塑的特征為血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)成分增加等。中性粒細(xì)胞作為與COPD密切聯(lián)系的炎癥因子，其可分泌大量炎性蛋白，促進(jìn)持續(xù)性炎癥，影響內(nèi)皮細(xì)胞，并導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)改變和功能發(fā)生異常，而ITGAM的下降可顯著降低中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[11]，以延緩肺血管重塑。

ITGAM(Integrin， Alpha M)是構(gòu)成整合素αMβ2 的一種蛋白質(zhì)亞基，表達(dá)于骨髓細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等[12]。ITGAM基因位于第16號染色體短臂11 區(qū)2帶，約79.08 kb，由30個外顯子、36個內(nèi)含子構(gòu)成，其mRNA有12個剪切體[13]，具有調(diào)節(jié)白細(xì)胞活化、黏附和遷移的功能[14]。ITGAM可編碼整合素的α鏈產(chǎn)生CD11b，高水平的CD11b可使中性粒細(xì)胞同參與肺血管重塑相關(guān)的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附增加[15]，影響血管壁結(jié)構(gòu)和功能異常。CD11b可與結(jié)締組織生長因子CTGF結(jié)合，參與肺血管重塑[16]。有研究[17]顯示，CD11b參與缺氧所致的肺血管重塑，CD11b在肺動脈高壓組中高表達(dá)[18-19]。ITGAM可編碼整合素的β鏈產(chǎn)生CD18，CD18再與CD11b以非共價鍵結(jié)合的方式形成結(jié)合物CD11b/CD18[20]，CD11b/CDl8參與肺血管重塑[21]。CD11b/CDl8分布于CD8+T細(xì)胞[20]，而COPD者的肺血管可見大量CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤[10]。此外，由ITGAM編碼產(chǎn)生的CD11b/CD18為中性粒細(xì)胞上的重要β2整合素受體，同時乃炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)組織損傷的主要受體[20]，且慢性低氧可促進(jìn)血小板活化因子PAF增加，從而使CD11b/CD18水平上調(diào)，使內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的黏附增加[22]，加劇肺血管重塑。

中醫(yī)對于COPD常以肺脹等疾病辨證施治，病因有內(nèi)、外之別，內(nèi)因主要與肺脾腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)。COPD屬于慢性疾病，病程長，病性多屬虛，大部分患者有呼多吸少、氣短等腎不納氣癥狀，與中醫(yī)久病易致體虛、久病傷腎的特點(diǎn)相符合。全真一氣湯主治腎不納氣型疾病，由熟地黃、人參、白術(shù)、五味子、麥冬、牛膝、附子組成[6]，具有同補(bǔ)肺脾腎三臟之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷Rb1可舒張肺動脈，抑制由慢性低氧導(dǎo)致的肺動脈高壓大鼠的肺血管環(huán)的收縮效應(yīng)[23]；懷牛膝具有直接舒張血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[24]，而附子亦可舒張肺動脈[25]，故筆者推測全真一氣湯可能具有延緩肺血管重塑的功效。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，給予全真一氣湯的COPD大鼠肺組織ITGAM水平較模型組明顯下調(diào)，推測全真一氣湯可能通過下調(diào)ITGAM水平影響肺血管炎癥病變，從而延緩肺血管重塑過程。