蝦肝腸胞蟲(EHP)孢子的純化和計(jì)數(shù)

趙若恒 高雯 邱亮 李晨 謝國駟 黃倢

摘?要：采用差速離心和密度梯度離心，從感染蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）對(duì)蝦的肝胰腺中，嘗試純化出孢子，并應(yīng)用透射電鏡、熒光桃紅染色和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的方法對(duì)純化出的孢子進(jìn)行了觀察和計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，從1 g的EHP載量為（4.7±2.2）×104 copies/ng DNA的肝胰腺組織中經(jīng)差速離心和密度梯度離心方法分離到EHP的孢子，電鏡觀察孢子為大小在0.7～1.2 μm的橢圓形，純化孢子懸液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)顯示孢子濃度為5.30×103個(gè)/μL，蔗糖密度梯度中的純化孢子區(qū)帶含有的孢子總數(shù)約1.06×106個(gè)。

關(guān)鍵詞：蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）;純化;計(jì)數(shù)

自從蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）在泰國養(yǎng)殖的生長緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）中被發(fā)現(xiàn)以來[1]，越南、印尼、馬來西亞和泰國等國家均有檢測出蝦肝腸孢蟲對(duì)凡納濱對(duì)蝦的感染，對(duì)蝦感染該病原后，會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦出現(xiàn)生長緩慢或生長停滯，并有時(shí)會(huì)出現(xiàn)白便等癥狀，但其不影響對(duì)蝦的攝食和存活率[2-3]。我們最早也于2013年從浙江臺(tái)州養(yǎng)殖的日本囊對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦以及羅氏沼蝦樣品中檢出了EHP的感染，當(dāng)對(duì)蝦肝胰腺中EHP SSU rDNA的相對(duì)拷貝數(shù)在103 copies/（ng Hp DNA）數(shù)量級(jí)或EHP 載量指數(shù)在3以上時(shí)，對(duì)蝦的生長明顯較慢，表明該載量的EHP已處于一個(gè)較高的風(fēng)險(xiǎn)水平，其導(dǎo)致對(duì)蝦生長緩慢的問題給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失，需要引起高度重視[4]。EHP孢子是EHP發(fā)生個(gè)體和群體間傳播的關(guān)鍵形式，其分離純化對(duì)于查明微孢子蟲寄生、感染機(jī)制及防治技術(shù)等具有重要意義。目前分離純化微孢子蟲孢子的方法有：差速離心法、蔗糖密度梯度離心法和Percoll密度梯度離心法[5]。蔗糖密度梯度離心法是純化病毒常用的一種方法，應(yīng)用十分廣泛，能滿足多數(shù)試驗(yàn)的需求。本實(shí)驗(yàn)以滅菌海水（pH 6.0）作為緩沖液，蔗糖為純化介質(zhì)，感染對(duì)蝦的肝胰腺為材料進(jìn)行分離純化，并通過電鏡觀察，染色后光鏡觀察，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)對(duì)純化的EHP孢子進(jìn)行評(píng)價(jià)以及孢子顆粒的結(jié)構(gòu)和孢子數(shù)量等信息進(jìn)行研究，以期對(duì)該病的感染機(jī)制和防控策略提供技術(shù)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)用蝦

實(shí)驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦于2017年10月27日購自山東日照凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場，參照OIE水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)（OIE， 2017）及已發(fā)表的文獻(xiàn)方法[4，6-7]進(jìn)行主要病原檢測，包括白斑綜合征病毒（WSSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）、桃拉綜合征病毒（TSV）、偷死病野田村病毒（CMNV）、黃頭病毒（YHV）、傳染性肌壞死病毒（IMNV）、蝦肝腸胞蟲（EHP）和致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（VpAHPND）。

1.2?蝦肝腸胞蟲的分離與純化

1.2.1?蝦肝腸胞蟲孢子粗提液的制備?取EHP強(qiáng)陽性的凡納濱對(duì)蝦，解剖取其肝胰腺（約1 g），置于冰冷的滅菌海水（鹽度25‰， pH 6.0）中，在冰浴中勻漿破碎，用高速離心機(jī)（CR21GIII，日立）在2 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清液。沉淀再加冰冷滅菌海水（pH 6.0），于冰浴中勻漿破碎，再經(jīng)3 000 r/min，4 ℃離心20 min，將兩次上清合并，直接用有效孔徑為10 μm的濾膜過濾去除殘留的細(xì)胞或其他雜質(zhì)。之后將過濾的上清于8 000 r/min，4 ℃離心10 min，得到的沉淀分別用200 μL的滅菌海水重懸。

1.2.2?蔗糖密度梯度離心?用滅菌海水作為溶劑，分別按重量比配制20%、30%、40%、50%和60%的蔗糖溶液。鋪設(shè)于超速離心管中，于4 ℃靜置一夜，形成均勻的蔗糖密度梯度。將孢子粗提取液緩慢加到蔗糖密度梯度頂部，將各離心管重量嚴(yán)格配平后，使用超速離心機(jī)（CP100WX，日立，日本）于4 ℃、12 500 r/min離心30 min。將離心后的離心管放置于黑色背景下，在自然光和紅色激光下觀察管中條帶。

1.3?蔗糖密度梯度各區(qū)帶的樣品提取

蔗糖密度梯度離心后，收集梯度中的白色條帶，加入10倍體積的滅菌海水稀釋，混勻，于8 000 r/min，4 ℃離心15 min，倒掉上清，用200 μL滅菌海水重懸沉淀，振蕩混勻。樣品懸液保存于4 ℃冰箱。

1.4?透射電鏡觀察

將最后收集到的各個(gè)條帶的懸液樣品，用銅網(wǎng)吸附后，經(jīng)2%磷鎢酸（pH7.0）負(fù)染，在透射電子顯微鏡（JEOL JEM-1200，日本）下進(jìn)行觀察，確定孢子形態(tài)。

1.5?光鏡觀察

取一小滴（約20 μL）純化后的孢子懸液均勻涂布于載玻片上，滴加一小滴2%的熒光桃紅B，將兩者輕輕混勻，室溫孵育3 min，于100倍油鏡下進(jìn)行觀察。

1.6?孢子計(jì)數(shù)方法

依照姜義仁等的方法[5]，取最后離心稀釋得到的孢子懸液5 μL，再加入5 μL的2%的熒光桃紅B，染色后將溶液滴在血球計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋片，在100倍油鏡下觀察、計(jì)數(shù)。按以下公式計(jì)算單位體積懸液的孢子數(shù)量。

孢子數(shù)/mL=80小格內(nèi)孢子個(gè)數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)

2?結(jié)果與分析

2.1?EHP的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

成功的純化工作需要優(yōu)良的原材料?，F(xiàn)已建立的方法中只有EHP的實(shí)時(shí)定量PCR方法[4，6]能準(zhǔn)確地對(duì)EHP載量進(jìn)行定量檢測，為了選擇帶有足夠EHP的肝胰腺進(jìn)行EHP孢子的純化，我們采用TaqMan探針qPCR方法對(duì)蝦組織樣品進(jìn)行EHP定量。對(duì)該方法用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行TaqMan探針qPCR進(jìn)行校準(zhǔn)（圖1），質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板量在6.60×101～6.60×107copies/μL范圍內(nèi)，Ct值與SQ的對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系為Ct=-3.350 log（SQ）+39.286，相關(guān)系數(shù)R2=0.990，擴(kuò)增效率98.8%。

2.2?蝦樣EHP載量檢測

對(duì)實(shí)驗(yàn)用蝦進(jìn)行了病原的檢測，結(jié)果顯示W(wǎng)SSV、IHHNV、TSV、CMNV、YHV、SHIV、IMNV和VpAHPND均為陰性，依照劉雅梅等的方法進(jìn)行了EHP的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測[6]，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦的EHP載量為（4.7±2.2）×104copies/ngDNA。

2.3?EHP的蔗糖密度梯度離心提純

用1 g感染EHP載量達(dá)（4.7±2.2）×104copies/ngDNA的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織，經(jīng)勻漿和差速離心，通過20%～60% （W/W）蔗糖密度梯度于12 500 r/min超速離心30 min后，在離心管的各密度交界處，通過自然光下，或紅色激光照射下均能看到4條乳白色區(qū)帶（圖2）。自然光下蔗糖梯度中的4條乳白色區(qū)帶可勉強(qiáng)觀察到;而紅色激光下，4條區(qū)帶更加明顯，其中條帶1較為色淺，3最為集中，條帶2和4很微弱。

2.4?純化的EHP孢子的電鏡觀察

各條帶樣品用電鏡銅網(wǎng)吸附，經(jīng)磷鎢酸負(fù)染和透射電鏡觀察（圖3），在第3條帶的樣品中可見到橢圓形的孢子的形態(tài)，經(jīng)測量，孢子大小0.7～1.2 μm，在較低放大倍數(shù)下，一個(gè)視野中可以觀察到有較多的孢子。

圖3?純化的EHP孢子的透射電鏡觀察

注：A.白色箭頭指示EHP孢子，標(biāo)尺每個(gè)刻度為50 nm;B.白色箭頭指示孢子，標(biāo)尺每個(gè)刻度為1 μm。

2.5?純化EHP孢子的光鏡觀察

密度梯度離心的第3條樣品區(qū)帶，離心去蔗糖后的孢子懸液樣品經(jīng)2%的熒光桃紅B染液染色，在100倍油鏡下，可以觀察到大量純凈均一的染成紫紅色的孢子（圖4），孢子大小及形態(tài)與電鏡下觀察到的EHP孢子相符。

2.6?純化EHP孢子懸液的孢子光鏡計(jì)數(shù)

取5 μL密度梯度離心第3條區(qū)帶經(jīng)離心和混懸得到的最后EHP孢子懸液，再加入5 μL的2%的熒光桃紅B，染色后對(duì)孢子的染色觀察和計(jì)數(shù)，80小格內(nèi)EHP孢子個(gè)數(shù)為53個(gè)，代入公式：EHP孢子數(shù)/mL=80小格內(nèi)孢子個(gè)數(shù)/80×400×104×2 （稀釋倍數(shù)），求得EHP孢子的濃度為5.3×103個(gè)/μL。根據(jù)最后EHP孢子懸液的體積，得出密度梯度離心第3條區(qū)帶的EHP孢子總數(shù)為1.06×106個(gè)。

3?討論

蝦肝腸胞蟲首次在泰國養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)并且命名。但由于副溶血弧菌引起的急性肝胰腺壞死病（AHPND）的暴發(fā)，EHP的感染在前期并未受重視，使得EHP在養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦及凡納濱對(duì)蝦中廣泛傳播，導(dǎo)致對(duì)蝦生長緩慢的問題越來越普遍，帶來的經(jīng)濟(jì)損失也越來越嚴(yán)重，并直接或間接威脅整個(gè)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。從2013年始，已在越南、中國、印尼、馬來西亞和泰國等國家不斷暴發(fā)[8]。

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的蝦肝腸胞蟲TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法，對(duì)6.1×101～6.1×108 copies/μL的EHP SSU rDNA標(biāo)準(zhǔn)品檢測具有良好的線性關(guān)系和良好的組間和組內(nèi)重復(fù)性。通過對(duì)實(shí)際樣品檢測對(duì)比，該方法比套式PCR靈敏度高7.6±4.2倍，比SYBR Green I qPCR-EHP高1.3±0.2倍[6]。TaqMan探針實(shí)時(shí)PCR法使用特異性探針，可有效防止PCR反應(yīng)中非特異產(chǎn)物的影響，在水生動(dòng)物病原的檢測中廣泛得到應(yīng)用[9]。在蝦類病原的OIE水生動(dòng)物診斷標(biāo)準(zhǔn)中，常常成為標(biāo)準(zhǔn)的定量檢測方法。由于EHP存在滋養(yǎng)體和孢子體的兩個(gè)階段，qPCR方法是對(duì)總的EHP核酸的定量，方法雖然特異靈敏，卻無法對(duì)EHP孢子進(jìn)行單獨(dú)計(jì)量，而只有EHP孢子具有個(gè)體間的傳染性，因此有必要建立能單獨(dú)對(duì)EHP孢子進(jìn)行計(jì)量的方法。

血球計(jì)數(shù)板是一種常見的生物學(xué)工具，通常用于對(duì)人體內(nèi)紅、白血球進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)，也常用于一些細(xì)菌、真菌、酵母等微生物數(shù)量的計(jì)算，EHP在分類上同屬于真菌，其孢子經(jīng)過染色后，形態(tài)在油鏡下能較容易辨別出來，因此用血球計(jì)數(shù)板可以直接對(duì)EHP孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，為EHP孢子的傳染性研究提供了一種計(jì)量方法。

本研究通過差速離心、密度梯度離心的方式從感染EHP對(duì)蝦的肝胰腺中，分離純化出EHP的孢子顆粒，其中蔗糖密度梯度離心后的第3條區(qū)帶最為明顯。經(jīng)磷鎢酸負(fù)染的透射電鏡也在該區(qū)帶樣品中觀察到了完整的孢子顆粒，由于孢子壁完整，負(fù)染液未進(jìn)入孢子內(nèi)部，因此其內(nèi)部的構(gòu)造無法看到。通過染料對(duì)孢子顆粒進(jìn)行染色，確定孢子形狀為橢圓形，其大小也與先前的報(bào)道一致[3]。

近年來，蝦肝腸胞蟲對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的危害越來越令人關(guān)注，但目前對(duì)該病還沒有有效的治療藥物，因此對(duì)該病原的檢測和凈化就尤為重要。由于該病原的感染部位主要在肝胰腺，取肝胰腺進(jìn)行檢測是致死性的檢測，在親蝦檢測及藥物篩選研究中無法進(jìn)行個(gè)體的精確定量跟蹤，導(dǎo)致無疫篩查和藥物篩選困難。由于EHP孢子能隨糞便排出，對(duì)EHP孢子的濃縮純化和定量檢測，可能為對(duì)對(duì)蝦活體進(jìn)行EHP監(jiān)測和EHP傳染風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估提供很好的解決措施，本文的孢子分離純化和計(jì)量方法將為后續(xù)的EHP感染檢測及定量分析提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] Tourtip S， Wongtripop S， Stentiford GD， et al.Enterocytozoon hepatopenaei sp.nov.（Microsporida： Enterocytozoonidae）， a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon （Decapoda： Penaeidae）： fine structure and phylogenetic relationships [J].J Invertebr Pathol， 2009， 102（1）： 21-29.

[2] Rajendran KV， Shivam S， Praveena PE， et al.Emergence of Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）， in farmed Penaeus （Litopenaeus） vannamei， in India [J].Aquaculture， 2016， 454：272-280.

[3] Santhoshkumar S， Sivakumar S， Vimal S， et al.Biochemical changes and tissue distribution of Enterocytozoon hepatopenaei （EHP） in naturally and experimentally EHP‐infected whiteleg shrimp， Litopenaeus vannamei （Boone， 1931）， in India [J].J Fish Diseases， 2017， 40（4）：529-539.

[4] 劉珍， 張慶利， 萬曉媛， 等.蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立及對(duì)蝦樣品的檢測[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展， 2016， 37（2）： 119-126.

[5] 姜義仁， 鄧真華， 王伯陽，等.柞蠶微孢子蟲孢子分離純化方法[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)， 2011， 48（2）：452-456.

[6] Liu Y M， Qiu L， Sheng A Z， et al.Quantitative detection method of Enterocytozoon hepatopenaei using TaqMan probe real-time PCR [J].J Invertebr Pathol， 2018， 151： 191.

[7] Li X P， Wan X Y， Xu T T， et al.Development and validation of a TaqMan RT-qPCR for the detection of convert mortality nodavirus （CMNV） [J].Journal of Virological Methods， 2018： 65-71.

[8] Tangprasittipap A ， Srisala J ， Chouwdee S ， et al.The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp Penaeus （Litopenaeus） vannamei [J].BMC Veterinary Research， 2013， 9（1）：139.

[9] Yue Z Q， Liu H， Wang W，et al.Development of real-time polymerase chain reaction assay with TaqMan probe for the quantitative detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus from shrimp [J].J AOAC Int. 2006 ，89（1）：240-4.