細菌和微藻作用下石油-礦物顆粒聚集體的形成及特性

郝樹廷 韓璐 張明遠 劉麗

摘?要：在海洋中，石油-礦物顆粒團聚體（Oil-Mineral Aggregation，OMA）在油的縱向遷移及去除中發(fā)揮重要作用。采用模擬實驗研究了細菌、微藻及菌藻共同作用下OMA的形成及特性。結果表明與無菌條件下生成的油滴狀OMA相比，菌、藻作用下生成的OMA有絲狀、纖維狀、網狀和球狀，且OMA生成速率加快，最快3 h即生成。OMA的沉降速率隨時間延長逐漸變快。菌藻共同作用下OMA沉速最大，且胞外聚合物透明顆粒（Transparent Exopolymer Particles，TEP）含量最大。

關鍵詞：細菌;微藻;OMA;沉降速率;TEP

隨著全球石油產品需求的增加和海洋石油運輸量的加大，海上溢油事故頻繁發(fā)生。溢油可與海洋中的礦物顆粒相互作用形成油-礦物顆粒聚集體OMA并發(fā)生沉降，繼而影響溢油的環(huán)境行為。以往的研究中主要考察了不同物化因素對OMA的影響，對微生物作用下OMA的形成及其特性研究的較少。本研究通過模擬實驗，分別研究了細菌、微藻及菌藻共同作用下OMA的形成及特性。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

由蒸餾水和海水素按一定比例配制鹽度為35‰的人工海水，pH=7.8;實驗用油為青島石化廠輕質原油;采用捷菲特001溢油分散劑使溢油迅速乳化分散;采用高嶺土來模擬海洋中的懸浮顆粒物，實驗用高嶺土平均密度為2.6 g/cm3，平均粒徑為2.25 μm。

在青島小港碼頭近岸海域取石油污染海水，人工海水培養(yǎng)基和微量元素混合液用于石油烴降解菌的富集培養(yǎng)[1];每日定時測其OD600值，繪制細菌生長曲線，選取對數(shù)生長期后期的培養(yǎng)菌液制備菌懸液。

以青島大扁藻為代表性微藻，培養(yǎng)大扁藻所用海水取自青島魯迅公園附近海濱，經0.45 μm濾膜過濾，121 ℃高壓蒸汽滅菌，冷卻后待用。配制營養(yǎng)液：采用f/2培養(yǎng)基[2-3]，在指數(shù)生長期接種，培養(yǎng)溫度20±1 ℃，光照強度1 200 lx，光暗周期12 h∶12 h。每天搖動錐形瓶數(shù)次，避免大扁藻黏附于瓶壁。

1.2?實驗設計

取12個容積為250 mL的錐形瓶，分別加入100 mL人工海水，加入5 mg高嶺土，121 ℃高壓蒸汽滅菌、冷卻，分別向錐形瓶內準確加入經0.22 μm濾膜過濾除菌的0.06 g輕質原油和10 μL分散劑，將上述錐形瓶分為4組，每組3個平行樣，向第1組錐形瓶每瓶加入20 mL無菌水作為對照，第2組錐形瓶每瓶加入20 mL菌懸液，第3組錐形瓶每瓶加入20 mL大扁藻藻液，第4組錐形瓶內每瓶加入20 mL大扁藻藻液和20 mL菌懸液，pH調至8，鹽度為35‰，將錐形瓶用高溫滅菌的紗布密封，保證錐形瓶透氣且不被外源菌污染，置于25 ℃、轉速為160 r/min的恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，觀察錐形瓶內OMA形成情況并記錄分析。

1.3?測定方法

（1）光密度（Optical Density，OD）法[4]測定細菌生長量。

（2）采用血球計數(shù)板對青島大扁藻進行計數(shù)。

（3）利用石油尤其是油中多環(huán)芳烴類化合物在紫外燈照射下顯熒光的原理，使用Olympus—IX83倒置熒光顯微鏡對OMA形態(tài)進行觀察，比較分析OMA尺寸、形態(tài)等參數(shù)。

（4）用移液槍吸取肉眼可見的OMA絮體，并手持移液槍以與液面近乎平行的角度，緩慢將絮體注入含有人工海水的比色管中，拍攝并記錄下其沉降過程，依據(jù)沉降距離和沉降時間，來計算其沉降速率[5]。

（5）TEP含量測定采用阿爾新藍染色半定量分析法[6]。將阿爾新藍染色后的樣品置于光學顯微鏡100×倍觀察，統(tǒng)計相同視野下直徑大于50 μm的TEP的數(shù)量及表面積，總表面積越大TEP含量越高。

2?結果與討論

2.1?生成速率與形態(tài)

無菌條件下，取培養(yǎng)至第7天的錐形瓶內溶液少許，置于熒光顯微鏡下觀察。

如圖1所示，觀察到的OMA大多數(shù)是油滴狀OMA，是由油滴表面包裹一層細小顆粒物高嶺土或是油滴表面黏附高嶺土的凝聚體構成。觀察到的油滴狀OMA有單滴狀OMA，即OMA中只有單個油滴存在（如圖1a所示），單滴狀OMA中油滴直徑在15～30 μm之間;溶液內也形成了多滴狀OMA，即OMA中結合多個油滴形成（如圖1b、c所示），多滴狀OMA中油滴的尺寸較單滴狀OMA中油滴偏小，直徑約在5～20 μm之間。顯微鏡照片中，綠色顯熒光的部分為油滴，油滴周圍包裹的顏色較黑的部分為固體顆粒物高嶺土。無菌條件下OMA在12 h內即可生成，尺寸為 μm級。

和無菌條件下形成的油滴狀的OMA相比，細菌作用下形成的OMA生成速率快，在7 h內即可生成，OMA尺寸較大，少數(shù)絮體可達cm級（實驗過程中觀察到，此處未列出），而且熒光顯微鏡下，OMA的形態(tài)呈多樣性，依據(jù)形態(tài)特征，主要分為以下4種（見圖2）：絲狀OMA、纖維狀OMA、網狀OMA和球狀OMA。如圖2a，絲狀OMA：外形似盤曲的樹枝，形態(tài)纖長，較松散，易破碎。圖2b，纖維狀OMA：結構密實，不易破碎，熒光性強，捕獲油能力強。圖2c，網狀OMA：比絲狀OMA和纖維狀OMA松散，好似一張網將分散的油滴捕獲在其中。圖2d，球狀OMA，形態(tài)相對規(guī)則，長、短徑區(qū)別不大，大小一般在mm級，較網狀OMA密實，較纖維狀OMA松散，不易破碎，熒光性強，捕獲的石油量較多。受水動力等其他因素的影響，由于OMA形態(tài)的易碎性，其形態(tài)會相互轉變。

在細菌作用下，當足夠多的高嶺土黏附到油表面時會有一層油膜分離下來，形成尺寸較大的OMA，OMA是由固體顆粒物混合在油里形成，所以其大小、形態(tài)變化很大。絲狀OMA和網狀OMA看起來就像是膜一樣，通常是漂浮或是懸浮在水中，寬度可以達到數(shù)mm，這種絲狀OMA很容易被強剪切作用破壞。纖維狀OMA和球狀OMA結構緊湊，熒光性強，多沉降于錐形瓶底部。

在加入青島大扁藻藻液的錐形瓶內取少許液體置于倒置熒光顯微鏡下觀察。與無菌條件和細菌作用下形成的OMA相比，大扁藻作用下形成的絮體以絲狀OMA（見圖3）為主。由于礦物顆粒表面黏附石油，在明場下不易觀察。形成的OMA對石油的捕獲比較均勻，且微藻之間的孔隙，可能為分散石油、黏性物質及高嶺土提供較好的反應場所。與前兩種條件下形成的OMA相比，大扁藻作用下形成的OMA尺寸大，包裹油滴多，形態(tài)也不規(guī)則。實驗觀察到有一些死亡大扁藻包裹在OMA中，一定程度上增大了OMA的尺寸，還有一些大扁藻圍繞在絮體周圍，可能在OMA的聚集過程中發(fā)揮重要作用。

圖4為石油烴降解菌與青島大扁藻作用下形成的OMA在顯微鏡下的圖片。OMA表面黏附少量油滴，周圍分散著一些小絮體。與無菌條件、細菌和大扁藻單獨作用下相比，細菌與大扁藻混合作用下OMA形成速率快，3 h內即可生成。OMA尺寸更大，顯微鏡明場條件下觀察到OMA結構更緊湊，在水動力條件下不易破碎。在熒光條件下觀察到，OMA內裹挾的油滴較多且油滴尺寸大小不一。

細菌與微藻混合作用下形成的OMA絮體尺寸較大，一方面原因可能是細菌和微藻都會生成TEP，TEP的高黏性有助于大尺寸OMA的形成。另一方面，RieBeSle等人[7]認為，高的浮游植物濃度是大型絮狀物形成的必要條件。當微藻暴露在陽光下，光合作用產生的多余有機碳會以溶解有機物的形式釋放到周圍水體中[8]，供細菌生長繁殖并生成更多的TEP，進而形成更大尺寸的OMA。此外，Eenennaam等人[9]發(fā)現(xiàn)，當只存在微藻及其與菌混合作用下，都可生成TEP，但后者生成量更多。因此，細菌與微藻共同作用下有助于OMA的形成。

無菌、細菌、大扁藻及菌藻混合作用下OMA的生成速率逐步加快，生成時間由最初的12 h減為3 h，原因可能是細菌與微藻的加入加大了石油與礦物顆粒的碰撞機率，且菌藻分泌的胞外聚合物進一步促進了絮體的聚集。

對OMA形成時間的機理探討：

油滴與礦物顆粒二者碰撞（損失）可由下式描述[10]：

由于微藻和細菌釋放的胞外聚合物的存在，絮凝效率（α）將具有更高的價值[12]。活性基團的存在使TEP表現(xiàn)出膠狀特征，為聚集體提供了黏著的基質，有利于OMA的絮凝。

2.2?平均沉降速率

如圖5所示，無菌、細菌、青島大扁藻及菌藻混合條件下生成OMA的沉降速率隨時間延長而增大，在第12天取得最大沉降速率，分別為0.70、5.33、6.13和6.17 mm/s，與第1天相比，沉速分別增大29.63%、38.80%、28.51%和26.58%。無菌條件下生成的OMA絮體的沉降速率較小，與其他3種條件相比，OMA沉速相差一個數(shù)量級。

OMA形成初期，絮體結構比較松散，沉速較小，在水動力條件下，OMA清除和捕獲礦物顆粒，密度變大，沉速加快。OMA的沉降速度可用改進的Stokes方程描述[13]。

其中g是重力加速度;ρa是聚集體的密度;ρw是海水密度;V是聚合體積;CD是阻力系數(shù);A是垂直于沉降方向的聚集體的最大橫截面積。阻力系數(shù)通常與形狀和雷諾數(shù)有關，在實驗過程中，OMA為自由沉淀，則可考慮其狀態(tài)為層流沉淀。層流狀態(tài)對應到圖6所示的關系中，所處范圍雷諾數(shù)Re<1，則此時阻力系數(shù)與雷諾數(shù)的關系式為：

因此，OMA的沉降速率與其形狀和尺寸有關。OMA體積越大，結構密實，沉降速率越大。同時期，無菌條件下生成的OMA尺寸較小，且OMA中油滴尺寸相對較大，OMA密度小，其沉降速率最小。細菌及微藻單獨作用下，OMA沉速加快，原因可能是細菌和微藻分泌了一定量的TEP，TEP的高黏性使得OMA黏附了更多的礦物顆粒，同時使絮體更加密實，不易破碎，密度增大，沉降速率加快。細菌和微藻共同作用下形成OMA的沉速最大，但并非二者單獨作用下OMA沉速之和，原因可能是細菌與微藻間存在一定的競爭關系，TEP生成量變化不大，即OMA聚合力相差不大。

2.3?TEP含量

如圖7所示，細菌、微藻及二者共同作用下經阿爾新藍染色的TEP數(shù)量分別為10個、10個和15個，TEP面積為3.4×108、5.0×108、6.2×108 μm2。

TEP是EPS的部分糖性成分[14]，EPS是由海洋生物分泌，呈凝膠狀的有機高分子量天然聚合物[15]，具有一定的黏性，在OMA的形成過程中具有重要作用。

大扁藻在培養(yǎng)至第7天時產生的TEP含量比石油烴降解菌產生的TEP含量高，表明大扁藻在TEP的產生中發(fā)揮重要作用。細菌與微藻具有復雜的相互關系。微藻在新陳代謝過程中產生并分泌于水體的有機物質，被細菌攝取后，一部分經細菌代謝后以礦物或其他形式釋放回海洋中，又為微藻提供營養(yǎng)及必須的生長因子[16]，因此微藻與細菌共存情況下可能更有利于TEP的生成。TEP與絮體的凝聚有關，TEP含量低，不易形成較大尺寸的OMA，這與菌藻共同作用下TEP生成量高，OMA尺寸更大的實驗結果相符。

TEP含量不僅對形成OMA的尺寸有影響，也影響著OMA的沉降速率。細菌與微藻作用下TEP含量高，OMA沉降速率大;細菌作用下TEP含量較低，OMA沉速較小，即TEP含量越高，OMA結構密實，沉降速率越大，而TEP含量低，生成的OMA較松散，沉降性能差。

在海洋中，大量的TEP通過改變凝聚動力學，影響著OMA的動態(tài)變化，為海洋環(huán)境的生物化學組成（包括細菌、浮游植物、碳以及活性微量元素）提供了重要媒介[17]。

3?結論

與無菌條件下生成的油滴狀OMA相比，菌、藻作用下生成的OMA有絲狀、纖維狀、網狀和球狀，OMA生成速率加快，最快3 h內即生成OMA。

無菌、細菌、青島大扁藻及菌藻混合條件下生成OMA的沉降速率隨時間延長而增大，在第12天取得最大沉降速率，分別為0.70、5.33、6.13和6.17 mm/s，與第1天相比，沉速分別增大29.63%、38.80%、28.51%和26.58%。

細菌、微藻及二者共同作用下經阿爾新藍染色的TEP數(shù)量分別為10個、10個和15個，TEP面積為3.4×108、5.0×108、6.2×108 μm2。

參考文獻：

[1] 劉陳立，邵宗澤.海洋石油降解微生物的分離鑒定[J].海洋學報，2005，27（4）：114-120.

[2] Guillard R R，Ryther J H.Studies of marine planktonic diatoms.I.Cyclotella nana（Hustedt） and DetonuLa confervacea（Cleve）Gran[J].Can J Microbiol，1962，8：229-239.

[3] 華汝成.單細胞藻類的培養(yǎng)與利用[M].北京：農業(yè)出版社，1986：315-322.

[4] 曹國珍，繆建順，張苗苗，等.分光光度法測定釀酒酵母細胞懸液濃度研究[J].中國釀造，2014，33（4）：129-133.

[5] Ploug H，Terbrüggen A，Kaufmann A，et al.A novel method to measure particle sinking velocity in vitro，and its comparison to three other in vitro methods[J].Limnology & Oceanography Methods，2010，8（8）：386-393.

[6] Passow U.Transparent exopolymer particles （TEP） in aquatic environments[J].Progress in Oceanography，2002，55（3-4）：287-333.

[7] Riebesell U.The formation of large marine snow and its sustained residence in surface waters[J].Limnology & Oceanography，1992，37（1）：63-76.

[8] Dash P，Kashyap D，Mandal S G.Marine snow：its formation and significance in fisheries and aquaculture[J].World Aquacult.2012，6：59-61.

[9] Eenennaam J S，Wei Y，Grolle K C，et al.Oil spill dispersants induce formation of marine snow by phytoplankton-associated bacteria[J].Marine Pollution Bulletin，2016，104（1-2）：294-302.

[10] Payne J R，Kirstein B E，Clayton J R，et al.Integration of Suspended Particulate Matter and Oil Transportation Study[J].Final report.Minerals Management Service，Alaska，1987，10：234-241.

[11] Zhao L，Boufadel M C，Geng X，et al.ADROP：a predictive model for the formation of oil particle aggregates （OPAs）[J].Mar.Pollut.Bull，2016，106：245-259.

[12] Tansel B.Morphology，composition and aggregation mechanisms of soft bioflocsin marine snow and activated sludge：a comparative review[J].J.Environ.Manag.，2018，205：231-243.

[13] Mcanally W H，Mehta A J.Collisional aggregation of fine estuarial sediment[J].Proceedings in Marine Science，2000，3（00）：19-39.

[14] Alldredge A L，Passow U，Logan B E.The abundance and significance of a class of large，transparent organic particles in the ocean[J].Deep Sea Research Part I Oceanographic Research Papers，1993，40（6）：1131-1140.

[15] Sheng G P，Yu H Q，Li X Y.ExtraceluLar polymeric substances （EPS） of microbial aggregates in biological wastewater treatment systems：a review[J].Biotechnology Advances，2010，28（6）：882.

[16] 荊紅梅.海洋微藻胞外產物的實驗研究[D].廈門：廈門大學，2001.

[17] Azetsu-Scott K，Passow U.Ascending marine particles：significance of transparent exopolymer particles （TEP） in the upper ocean[J].Limnology and Oceanography，2004，49（3）：741-748.