大菱鲆源殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）的分離鑒定

尚琨 王斌 劉欣 高萍 曲凌云

摘?要：從患腹水病大菱鲆Scophthalmus maximus的肝臟中分離到一株優(yōu)勢細(xì)菌G1，經(jīng)人工感染實(shí)驗(yàn)表明G1為引發(fā)大菱鲆腹水病的致病菌，且半致死濃度為LD50=1.21×105CFU·g-1。采用常規(guī)的生理生化鑒定方法及分子生物學(xué)方法對G1進(jìn)行分析，結(jié)果表明，G1的16S rRNA基因序列與殺魚愛德華氏菌Edwardsiella piscicida的同源性達(dá)100%，系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株G1與殺魚愛德華氏菌分支聚為一支，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果確定G1為殺魚愛德華氏菌。藥敏試驗(yàn)表明菌株G1對頭孢曲松、環(huán)丙氟哌酸、左氧氟沙星等8種抗菌藥物高度敏感。

關(guān)鍵詞：大菱鲆Scophthalmus maximus;殺魚愛德華氏菌Edwardsiella piscicida;鑒定;藥敏試驗(yàn)

愛德華氏菌屬腸桿菌科，廣泛存在于水體環(huán)境中，一定條件下可使不同重要經(jīng)濟(jì)魚類致病[1-3]。2012年以前，世界公認(rèn)的愛德華屬有3種，分別為遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、?？茞鄣氯A氏菌（Edwardsiella Hoshinae）、鯰魚愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）。Abayneh等人對13株魚類遲緩愛德華分離株按照表型和遺傳表征進(jìn)行歸類劃分，其中12株重新定義為殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）[4]。研究發(fā)現(xiàn)，殺魚愛德華氏菌常引起加州鱸（Micropterus salmoides）[5]、白鮭魚（Whitefish）[6]、尖吻鱸魚（Lates calcarifer）[7]、斑點(diǎn)叉尾鮰（Channel catfish）[8]等魚類病害的發(fā)生。自2013年殺魚愛德華氏菌從遲緩愛德華氏菌中分離出來重新歸類為愛德華氏菌新種屬以來，國內(nèi)殺魚愛德華氏菌引起大菱鲆Scophthalmus maximus腹水癥暴發(fā)的報(bào)道較少。

2017年，青島膠南養(yǎng)殖場大菱鲆腹水癥暴發(fā)。本實(shí)驗(yàn)從患腹水癥大菱鲆肝臟中分離出疑似病原菌G1，通過對菌株G1形態(tài)、生理生化特征、分子特征的研究確定其分類學(xué)地位，同時(shí)對其致病力進(jìn)行初步研究，以期為后續(xù)養(yǎng)殖大菱鲆腹水病病原的檢測和防治提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?病原菌分離

取具有典型腹水病癥狀的瀕死大菱鲆，無菌條件下，用常規(guī)方法取瀕死的病魚的肝臟、腸道，研磨稀釋后涂布于2216E培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等，挑取不同形態(tài)的優(yōu)勢菌落，對挑選的優(yōu)勢菌落進(jìn)行三次以上的純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)24 h，將純培養(yǎng)物保藏至含有30%（V/V）甘油的2216E液體培養(yǎng)基中，于-80 ℃長期保存。

1.2?人工回感實(shí)驗(yàn)

健康大菱鲆購自青島膠南養(yǎng)殖場，體長（13.4±1.0）cm，體重（31.7±1.0）g。挑選270尾健康大菱鲆暫養(yǎng)2周后進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。目標(biāo)菌株接種于2216E液體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水制成菌懸液，利用比濁法將菌液濃度調(diào)整為107cfu/mL。實(shí)驗(yàn)共分5個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度 （103cfu/mL，104cfu/mL，105cfu/mL，106cfu/mL，107cfu/mL）和1個(gè)對照組（0.9%生理鹽水）。每組處理15尾魚，各設(shè)3個(gè)平行，采用腹腔注射，注射劑量為0.3 mL/尾，對照組注射等體積無菌生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間換水量為總體積的1/3，連續(xù)觀察7 d，每天觀察并記錄實(shí)驗(yàn)魚的發(fā)病情況及瀕死癥狀。采用寇氏法[9]計(jì)算菌株G1的半致死量，公式如下：

Xg為死亡率為 100%組的對數(shù)劑量，d對數(shù)組距，∑P為各組死亡率之和。

1.3?病原菌鑒定

1.3.1?生理生化特征分析?按照梅里埃API 20E生理生化鑒定說明書，將適量新鮮菌液懸液加入API 20E鑒定管中，37 ℃靜置，24 h內(nèi)觀察生化鑒定管中變化。

1.3.2?分子生物學(xué)鑒定?將目標(biāo)菌株純化培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落放入含有無菌水的PCR管中沸水浴煮沸20 min后獲得模板DNA。采用16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492rrrr（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應(yīng)體系為60 μL： 10 μmol/L的正/反向引物各3 μL，DNA模板3 μL，2×Taq mix 30 μL，無菌水補(bǔ)至60 μL。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性 45 s，55 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸90 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。所得16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工公司。

將目標(biāo)菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增序列通過EzBio Cloud 數(shù)據(jù)庫 （http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）進(jìn)行序列同源性分析。用Clustal W軟件將NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的相似度較高的序列和其他種屬的序列進(jìn)行多序列匹配（Multiple Alignments）， 采用MEGA 6.0中的鄰接法（neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉分析（boot strap）進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.4?藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片擴(kuò)散法對目標(biāo)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取100 μL新鮮菌液涂布于2216E瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將藥敏紙片（購于杭州微生物試劑有限公司）貼于培養(yǎng)基表面，恒溫30 ℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)胡大勝[10]等人的方法測定抑菌圈直徑。

2?結(jié)果與分析

2.1?病癥表現(xiàn)與病原菌分離

患病大菱鲆表現(xiàn)為食欲減退，病魚行動(dòng)遲緩，攝食能力減弱;魚體肝臟、腎臟腫大，腹部膨脹，腸道有白便，解剖后見微黃或無色的腸積液，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)腸道擠出肛外，鰭部、吻部有出血點(diǎn)，后期內(nèi)臟團(tuán)萎縮使腹部凹陷（見圖1）。病魚肝臟、腸道組織器官涂布板上出現(xiàn)的細(xì)菌數(shù)量較多且菌落特征一致，經(jīng)純化從病魚肝臟獲得一株疑似病原菌株G1。

2.2?人工感染實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組大菱鲆在注射目標(biāo)菌株G1 20 h后均出現(xiàn)不同程度的腹水癥狀。高濃度組5～6 d達(dá)到死亡高峰期，對照組7 d內(nèi)未見死亡。人工感染的試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株G1能夠誘發(fā)大菱鲆產(chǎn)生典型的腹水癥狀并導(dǎo)致死亡，是大菱鲆腹水病發(fā)病原。

根據(jù)半致死量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用寇氏法計(jì)算LD50為1.21×105 CFU·g-1（見表1）。

2.3?生化鑒定結(jié)果

目標(biāo)菌株G1為革蘭氏陰性桿菌，在2216E瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征為圓形、表面濕潤光滑、邊緣整齊、不透明（見圖2）。

2.3.1?生化鑒定結(jié)果?生化鑒定結(jié)果表明，目標(biāo)菌株G1不能發(fā)酵肌醇、山梨糖醇，鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖和甘露醇;精氨酸雙水解酶、尿素酶、鄰硝基苯-半乳糖苷、VP結(jié)果均為陰性，可以進(jìn)行賴氨酸脫羧、鳥氨酸脫羧、葡萄糖發(fā)酵、H2S產(chǎn)氣，生化鑒定結(jié)果見表2。

2.3.2?分子生物學(xué)鑒定?將測序獲得的目標(biāo)菌株G1的16S rRNA基因片段序列結(jié)果輸入到EzBio Cloud 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)菌株G1與殺魚愛德華氏菌同源性為100%。利用MEGA6.0軟件采用鄰接法（neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖3所示，菌株G1與殺魚愛德華氏菌聚為一支。

2.4?藥敏試驗(yàn)

菌株G1對23種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表3，藥敏實(shí)驗(yàn)表明病原菌對頭孢曲松等8種抗菌藥物高度敏感;對呋喃妥因等8種抗菌藥物中度敏感;對復(fù)方新諾明等7種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。

3?討論

資料表明，引起我國魚類腹水病的愛德華氏菌有鮰愛德華氏菌、遲緩愛德華氏菌[11-13]。不同愛德華氏菌引起的腹水病共同癥狀為魚體腹部腫脹，肛門紅腫，腹腔內(nèi)有膿狀或帶血樣腹水。但是，不同愛德華氏菌引起的腹水癥狀仍存在一定程度差異。例如，吳杰[11]等人報(bào)道的以鮰愛德華氏菌為病原的患病魚體表現(xiàn)為眼球外凸，肝臟、脾臟和腎臟腫大并有出血點(diǎn);李筠[12]和丁正峰[13]等人發(fā)現(xiàn)遲緩愛德華氏菌引起的患病魚體表現(xiàn)為不同體表部位出血現(xiàn)象，后期伴有部分皮膚潰爛。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殺魚愛德華氏菌可以致使大菱鲆患腹水病，其癥狀與愛德華氏菌病共同特征相似，但腸道內(nèi)有白便，后期內(nèi)臟團(tuán)萎縮使腹部凹陷等癥狀與前人報(bào)道存在差異。

本實(shí)驗(yàn)采用API 20E腸道菌試紙鑒定條對菌株G1進(jìn)行生理生化鑒定，并與Abayneh等人[4]研究的殺魚愛德華氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化鑒定結(jié)果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)本研究分離的G1除檸檬酸鹽與吲哚兩個(gè)指標(biāo)有所差異，其余生化指標(biāo)都與殺魚愛德華氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株一致，表明菌株G1具有典型的愛德華氏菌屬的生化特征。殺魚愛德華氏菌與遲緩愛德華氏菌是兩個(gè)密切相關(guān)的物種，僅僅通過傳統(tǒng)的生理生化鑒定無法準(zhǔn)確的區(qū)分[7]。因此，需要利用16S rRNA基因?qū)闓1進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示，由16S rRNA基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹與殺魚愛德華氏菌聚類為一支。綜合生理生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確定菌株G1為殺魚愛德華氏菌。

目前，抗生素治療仍是魚類細(xì)菌性疾病有效的措施之一。本實(shí)驗(yàn)選取23種抗菌藥物檢測菌株G1的耐藥情況，結(jié)果表明菌株G1對頭孢曲松、環(huán)丙氟哌酸等8種抗菌藥物高度敏感，對呋喃妥因、丁胺卡那等8種抗菌藥物中度敏感，對磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明等7種抗菌藥物耐藥。國內(nèi)大菱鲆養(yǎng)殖方式多是采用開放式循環(huán)流水養(yǎng)殖模式S[14]，在實(shí)際養(yǎng)殖過程中，需要謹(jǐn)慎使用抗菌藥物，切記勿過量使用抗菌藥物，以防養(yǎng)殖水體中的病原菌對抗菌藥物產(chǎn)生多重耐藥性，不利于魚類細(xì)菌性疾病的綜合防控。

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