東亞地區(qū)漢坦病毒的流行病學特征及其軍事意義

韓 松，王雪萍，王軍紅

漢坦病毒（hantavirus，HV）是一種有包膜、分節(jié)段的負鏈RNA病毒，總大小約11.8 kb，呈球形或近球形，直徑平均為80～120 nm，由4種蛋白質(zhì)組成：核囊膜蛋白（N），表面糖蛋白（G1和G2）及RNA聚合酶［1］，屬于蟲媒病毒中布尼亞病毒科（Bunyavirales）漢坦病毒屬（Hantaviridae）。 2017 年國際病毒分類委員會ICTV第10次分類報告發(fā)布的漢坦病毒屬共包括 41 個種（Species）［2］，血清學調(diào)查證實全球范圍均有分布，是重要的人獸共患病病原體。筆者僅就東亞地區(qū)漢坦病毒的流行病學特征及其對軍事行動的影響做一論述。

1 漢坦病毒的流行病學特征

1.1 HV的傳播媒介及其演化關(guān)系嚙齒動物是漢坦病毒的主要自然宿主。2012年以來，世界各地先后發(fā)現(xiàn)9種蝙蝠漢坦病毒，宿主涉及6個科，分別來自非洲、亞洲和歐洲，呈現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性和生態(tài)性，引發(fā)了學界對蝙蝠是否是漢坦病毒自然宿主的關(guān)注。從嚙齒動物體外寄生蟲中分離漢坦病毒的嘗試是失敗的，但實驗證據(jù)表明，各種血螨可能在嚙齒動物宿主之間傳播該病毒。

HV對宿主動物造成感染不致病，不影響宿主的生存和繁殖，但宿主動物長時間甚至終生攜帶并排出病毒。HV通過宿主動物排泄物（尿、糞便、唾液）氣溶膠傳播或由被感染的嚙齒類動物咬傷等感染人類。患者的血液和尿液中能夠分離出病毒。1997年，Wells等提出了漢坦病毒可發(fā)生人際傳播的可能性［3］，但是目前仍未被明確證實。

研究發(fā)現(xiàn)，漢坦病毒屬各成員與其脊椎動物宿主存在一種共同演化的關(guān)系，即每一種漢坦病毒有一種（或僅有一種）主要鼠類宿主。在遠東地區(qū)和中國檢測到黑線姬鼠 （Apodemus agrarius.）（朝鮮亞種）攜帶漢坦病毒 （Hantaan virus，HTNV）；歐洲棕背平鼠（C.glareolus）棲息于林地或森林草原環(huán)境，是普馬拉病毒（puumala virus，PUUV）的主要宿主。在黃喉姬鼠（A.flavicollis）中分離出多布拉伐病毒（dobrova-belgrade virus，DOBV）。世界范圍內(nèi)褐家鼠（R.norvegicus）是漢城病毒（seoul virus，SEOV）的宿主。普通田鼠 （Microtus arvalis）是圖拉病毒（tula virus，TULV）的主要宿主。 深入研究證實，這種一對一的關(guān)系是相對的、可能是不斷發(fā)展變化的［4］。

1.2 漢坦病毒感染引發(fā)的人類疾病人類感染HV可引發(fā)兩種嚴重的自然疫源性疾病，即腎綜合征出血熱 （hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS）。

HFRS，我國習慣性稱為流行性出血熱（epdemic hemorrhagic fever，EHF），主要以發(fā)熱、疼痛（頭痛、腰痛、眼眶痛）、出血、少尿或多尿等腎功能損害為特征，恢復需要幾周到幾個月。全球每年HFPS發(fā)病約 150，000 例［5］，我國是受漢坦病毒危害最嚴重的國家，世界上90%以上的HFRS病例發(fā)生在我國［6］，且以青壯年人群為主。

HPS是HV導致的急性呼吸道疾病，可由幾種漢坦病毒引起，臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱 、間質(zhì)性肺炎，進展迅速，可發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征 （ARDS）。存活患者可出現(xiàn)不同程度的后遺癥，主要表現(xiàn)為肺功能異常。HPS主要發(fā)生于北美和中南美洲 ，近年來歐洲地區(qū)也有相關(guān)病例報告［7］。我國已有HPS的臨床診斷與治療的相關(guān)報道［8，9］。

人類感染癥狀的嚴重程度部分取決于由何種漢坦病毒導致，嚴重疾病與HTNV有關(guān)，輕中度疾病與漢城病毒有關(guān)，但具體某種漢坦病毒能夠引起何種特定臨床疾病仍然需要精確地定義。

2 漢坦病毒在東亞地區(qū)的流行病學特點

全世界每年至少報告20萬例HFRS住院病例。HFRS是東亞地區(qū)急性腎功能衰竭最常見的原因。

2.1 在中國每年有5～10萬HV感染者。HFRS全國范圍內(nèi)發(fā)病，主要發(fā)生在500 m以下的丘陵地區(qū)和東經(jīng)100°以東，地跨南部的云南省到東北部的黑龍江省。在海拔2000 m以上的山區(qū)和高原地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)該病。1997年，全國除青海省和新疆維吾爾自治區(qū)外均有病例報告。HTNV和SEOV病毒造成的發(fā)病率幾乎相等。HTNV感染與農(nóng)業(yè)、露營和軍事演習等野外活動有關(guān)。SEOV感染與城市環(huán)境中大量的褐家鼠相關(guān)，最近江蘇省的一項研究發(fā)現(xiàn)HFRS發(fā)病率與室內(nèi)褐家鼠密度有顯著相關(guān)性。浙江省農(nóng)村地區(qū)由HTNV病毒引起的HFRS發(fā)病率在每年十一月呈高峰，六月呈小高峰，這兩個流行季節(jié)與黑線姬鼠種群高峰和當?shù)剞r(nóng)業(yè)活動相一致。SEOV感染主要發(fā)生在每年的十二月至五月，在中國其他地區(qū)也有類似的傳播模式。

2.2 在韓國嚙齒動物在韓國境內(nèi)傳播四種漢坦病毒：HTNV致病最嚴重，最佳治療條件下仍有5%～10%的病死率；SEOV通常致輕度至中度疾病，病死率<1%；韓國還發(fā)現(xiàn)漢坦病毒近源種Soochong病毒（soov）和茂朱（mujv）病毒，關(guān)于 soov 和 mujv 病毒的嚴重性幾乎沒有有效信息，對患者流行病學調(diào)查罕見，因此目前將后兩者歸為新的漢坦病毒還不夠嚴謹。韓國從兩種蝙蝠中分離出一種與HTN病毒密切相關(guān)的病毒，證明在東亞，蝙蝠也是漢坦病毒的宿主。1991年，韓國首次報道了PUU病毒導致的HFRS，該病毒與歐洲棕背鼠種屬有關(guān)。

近幾年，韓國每年約報告1000例HFRS病例，所有病例的已知病原體幾乎均為HTNV和SEOV。Ryou 等［10］（2011）報道，2007 年在流行期間收集的感染HTNV的野生嚙齒動物來自韓國在京畿道華城、禮山省陜川、慶尚南道??；求禮、全羅南道省和全州省，全羅北道等地區(qū)。黑線姬鼠是捕獲的最常見的嚙齒動物，占752只受檢動物的98.2%。5個省的嚙齒動物抗體陽性率從全州的4%（2/56）到京畿道華城的28.6%（52/182）不等；研究期間HTNV病例在京畿道華城最多。

黑線姬鼠的HTNV抗體陽性率有兩個季節(jié)性高峰，一個在4月，另一個是9～12月，韓國大多數(shù)HFRS病例發(fā)生在第二次高峰季節(jié)，與褐家鼠和黑線姬鼠接觸導致SEOV感染相關(guān)。朝鮮也存在類似的疾病流行模式。韓國CDC每年有大約400例HV感染發(fā)病報告。2003年之后的病例數(shù)較多，約70%的病例由 HTNV引起，30%由 SEOV、SOOV和MUJV感染所致。

2.3 在日本HFRS發(fā)病率低，日本人感染的漢坦病毒多是SEOV，宿主為褐家鼠和黑線姬鼠，在主要港口城市嚙齒動物中感染率最高。1983年從東京口岸收集的褐家鼠中血清陽性率為35%。1995年在北海道地區(qū)8個采樣點中有7個在棕背平鼠（Clethrionomys rufocanus）中分離出PUU病毒株。

2.4 在蒙古蒙古確診的所有HFRS病例均歸因于HTN，并與黑線姬鼠的直接接觸有關(guān)。然而，鄰近的中國家鼠SEOV感染很普遍，鄰近的俄羅斯和哈薩克斯坦PUU病毒感染與鼠平鼠（Clethrionomys spp.）相關(guān)，這些病毒都有可能在蒙古出現(xiàn)。

2.5 在中國臺灣地區(qū)腎綜合征出血熱報告病例較少。臺灣首次確診的腎綜合征出血熱病例發(fā)生在1995年，但被證實是外來病毒。臺灣地區(qū)嚙齒類動物的血清學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國際海港漢坦病毒抗體的檢出率明顯高于島內(nèi)港口。

血清學研究表明，漢坦病毒在臺灣的傳播可能比以前認為的更廣泛。臺灣部分地區(qū)黑線姬鼠中HTNV抗體的陽性率可達20%。隨著時間的推移，臺灣HV感染的發(fā)病率在拾荒者、動物密切接觸者和不明原因發(fā)熱患者中有所升高，在這些易感人群中，HV抗體的檢出率隨著年齡增加而上升。

3 軍事斗爭中漢坦病毒暴發(fā)流行的典型事件回顧

在第一次世界大戰(zhàn)期間，在西部戰(zhàn)線兩側(cè)，“戰(zhàn)壕熱腎炎”的流行極可能是HV感染引起的，發(fā)病數(shù)千例，當時被認為是一種全新的疾病。第二次世界大戰(zhàn)前，日本和蘇聯(lián)的作家描述了沿滿洲里阿穆爾河區(qū)域的腎綜合征出血熱疫情。1951年，聯(lián)合國駐朝鮮半島部隊發(fā)現(xiàn)腎綜合征出血熱病例；根據(jù)美國陸軍部1956年的報告，朝鮮戰(zhàn)爭中美軍有近2500例感染漢坦病毒病例的記錄，病死率達5.5%，其中245例患者的血清回顧性研究證實，這些病例是由HV導致的。

1990年，在德國南部烏爾姆地區(qū)宿營訓練野外演習期間，參訓美國陸軍人員發(fā)生20多例急性PUUV感染；1995年，前南斯拉夫內(nèi)戰(zhàn)中發(fā)生過幾次HV暴發(fā)，超過300例患者因急性HV感染在圖茲拉地區(qū)（波斯尼亞東北）住院，大部分是暴露在野外的士兵。薩拉熱窩和澤尼察也暴發(fā)了疫情，黑山北部有超過100例報告?？扑魑謶?zhàn)爭期間也發(fā)生HV感染。

過去駐韓美軍每年都有病例報道，1986秋季參加聯(lián)合訓練的3754名美國海軍陸戰(zhàn)隊士兵中有14例患HFRS，2例病死。這是朝鮮戰(zhàn)爭以來駐韓美軍中最大集群的HFRS。從該訓練區(qū)收集的嚙齒動物中高達30%表現(xiàn)為HV血清陽性。Sachar等［11］在2003年報道了駐扎在Yongsan Garrison（韓國首爾）的一名美軍士兵患HFRS，但沒有野外暴露史。2005年10月下旬和11月上旬，三名美國軍人在三橋訓練區(qū)感染HFRS，一項為期3年的研究發(fā)現(xiàn)在黑線姬鼠中3年的HTNV抗體總體陽性率為14.5%（122/842）。Kim 等［12］2007 年報道了 2001 年—2005年在永山駐地進行的一項嚙齒動物調(diào)查，在395只褐家鼠的檢測中，38只（9.6%）被發(fā)現(xiàn)感染了SEOV。2006年后駐韓美軍再未見HFRS病例報道。

4 病毒快速檢測技術(shù)發(fā)展對軍事衛(wèi)勤保障的啟示

漢坦病毒的快速檢測主要通過病毒滴度測定、抗原檢測、抗體檢測和核酸檢測等手段來實現(xiàn)。以下分別列舉幾種比較成熟的，可能應(yīng)用于軍隊的快捷方法。

4.1 病毒培養(yǎng)與滴度測定細胞感染HV病毒后，滴度一般在7～14 d達到高峰。經(jīng)典的病毒滴度測定方法是通過空斑實驗（PA）來計算，該方法能真實反映病毒的毒力強弱，是確定病毒感染性大小的“金標準”［13］。目前更多的是用ELISA、IFA及流式細胞術(shù)等方法來檢測感染細胞質(zhì)內(nèi)存在的病毒抗原作為病毒增殖的指標。

白露等［14］用 HTNV76-118株感染 Veri-E6細胞，建立ELISA法和IFA法檢測細胞中的HV抗原；結(jié)果顯示 ELISA法檢測HV滴度的靈敏度顯著高于IFA法。蔣偉等［15］用HTNV76-118株感染Veri-E6細胞，建立了一種用流式細胞術(shù)（FCM）檢測陽性細胞率，進而推算出病毒滴度的新方法，直觀準確、快速簡便、靈敏度高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，已經(jīng)應(yīng)用到多種病毒的檢測。陳瓊等［16］利用新技術(shù)合成了水溶性量子點熒光納米顆粒，在顆粒上偶聯(lián)G蛋白和HV抗體制成量子點熒光探針，建立起一種檢測HV重組抗原的新方法，其標記簡便、單色性較好、信噪比高，抗猝滅性強，操作簡便、快速，靈敏度和特異性高，在檢測領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣泛。

4.2 抗原檢測由于HV的核衣殼NP蛋白具有很強的抗原性，可用于疾病的早期診斷。檢測抗原的方法中，ELISA法較為成熟。程林峰等［17］制備抗HV的mAb1A8及HRP-1A8抗體，以ELISA法檢測HV感染C57BL/6小鼠組織中特異性病毒抗原；該抗體可識別HV特異抗原位點，具有較高的結(jié)合活性；接種不同濃度的HV后第3天，在各感染組小鼠的肝組織中均可檢出病毒抗原。

4.3 抗體檢測常用的抗體檢測方法包括免疫熒光試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印記試驗、血凝抑制試驗等。由于抗體容易在不同漢坦病毒之間出現(xiàn)交叉反應(yīng)，故抗體檢測多用于疾病的診斷，而不能用于HV的分型檢測。HV感染后，血清中HV抗體IgM抗體出現(xiàn)早，發(fā)熱1～2 d即可檢出，7～10 d達高峰；IgG抗體則要5～7 d方可檢出，14～20 d達高峰；故IgM多用于臨床早期診斷，IgG多用于流行病學調(diào)查。 蘇旭等［18］利用重組菌株 E.coli BL21（DE3）/Pet32-a-L99S誘導表達SEOV重組核蛋白（Rnp），以純化rNP為抗原，建立免疫磁性微球（IMMS）ELISA檢測方法，更為簡單、準確，設(shè)備條件要求較低，宜于在基層單位推廣使用。

4.4 核酸檢測目前HV核酸主要通過PCR及其衍生的相關(guān)技術(shù)進行檢測。PCR法因其具有快速、簡便、靈敏、特異等優(yōu)點，近年來已廣泛應(yīng)用于臨床患者早期診斷及HV的分型和檢測，并取得了良好的效果。Mohamed等［19］則以不同型別的HV的L片段序列設(shè)計通用引物，建立了一種SYBR熒光實時定量PCR方法，適用于廣譜HV的檢測診斷。該方法幾乎可檢測目前已經(jīng)出現(xiàn)的所有型別的HV。胡丹等［20］根據(jù)S片段基因的序列設(shè)計引物，以含有目標基因的重組質(zhì)粒制作標準曲線，建立檢測HV的實時熒光定量PCR方法，靈敏度高，重復性好，結(jié)果顯示最低檢測限為101拷貝/μl；對HFRS的早期診斷和流行病學調(diào)查有較好的應(yīng)用價值。

用于HV檢測的方法中，免疫層析法具有簡便、廉價等優(yōu)點，適于基層單位和現(xiàn)場檢測，但其只能定性，不能定量檢測；免疫熒光試驗雖操作簡單，但結(jié)果判斷受主觀因素影響很大，定量不夠準確；酶標法則具有較高的靈敏度，操作簡單，便于臨床日常檢測與大規(guī)模的血清學流行病調(diào)查；PCR系列檢測技術(shù)具有快速、靈敏和特異等優(yōu)點，但其需要昂貴的儀器設(shè)備，不便于在基層推廣。

上述幾種方法，目前在HV的臨床診斷與疾病防控領(lǐng)域的應(yīng)用都非常廣泛，可根據(jù)不同的工作實際與檢測目的來選擇一種合適的檢測方法。ELISA和ICS具有方法操作簡便、檢測時間較短、費用廉價的特點，適用于基層檢測，楊致亭［21］、陳秀海［22］等利用抗體檢測方法發(fā)明了更加方便適用的流行性出血熱快速試劑盒，可用于我國軍隊HV監(jiān)測工作和病例的初步診斷。