膠體金免疫層析法快速定量檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1殘留

李 明 張振宇 柴 磊

（1.濟(jì)源市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南濟(jì)源 459000；2.焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心，河南焦作 454001）

黃曲霉毒素B1是迄今為止人類所知的毒性和致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，其急性毒性約為三氧化二砷的68倍、氰化鉀的10倍。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)，為了保證食品安全，保障消費(fèi)者的健康，需要檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1。目前國內(nèi)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂貴，不利于進(jìn)行廣泛推廣，并且限制了很多檢測(cè)單位高效、廣泛地開展檢測(cè)工作。膠體金免疫層析法快速定量法檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1殘留具有檢測(cè)快速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

PBS 清洗緩沖液（Charm公司）；AFB1標(biāo)準(zhǔn)液（Romer公司）；AFB1免疫親和柱（Romer公司）；玻璃纖維濾紙（Whatman公司）；ROSA黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測(cè)條（Charm公司）。

Waters 2695高效液相色譜儀（Waters公司）；孵育器、讀數(shù)儀（Charm公司）。

1.2 快速定量膠體金免疫層析法

準(zhǔn)確稱取樣品5.0g試樣于50ml具塞錐形瓶中，加入20ml試樣提取液，密閉，振蕩10min，8000 r/min離心5min，取離心后上清液100μl于另一離心管中，加 入1.0 ml稀釋緩沖液，充分混勻待測(cè)。將檢測(cè)條平放在分別準(zhǔn)確量取300μl待測(cè)樣品、陰性質(zhì)控樣品、陽性質(zhì)控樣品加入膠體金檢測(cè)試紙條的加樣孔中，放入已預(yù)熱孵育器中孵育，孵育8 min后取出檢測(cè)試紙條觀察C線（質(zhì)控線）和T線（檢測(cè)線）顯色情況。選擇讀數(shù)儀調(diào)為檢測(cè)模式，把檢測(cè)條放入讀數(shù)儀，讀數(shù)儀自動(dòng)顯示樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

1.3 免疫親和柱凈化HPLC法

稱取樣品4 g于50ml離心管中，加入10ml甲醇，振蕩后靜置20min，渦旋10min。置于5000r/min離心10min，過玻璃纖維濾紙后，取10 ml濾液至離心管，加入40ml PBS緩沖液，免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后，將上述樣液移至50ml注射器筒中，待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入10ml水淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱，在親和柱下放置10ml刻度試管，取下50ml的注射器筒，加入5ml乙腈洗脫親和柱，收集全部洗脫液至刻度試管中。在50℃下氮?dú)獯抵两?，用初始流?dòng)相溶解殘留物，0.22μm濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶，液相色譜進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)限

取空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料補(bǔ)充料樣品各10份，添加濃度為0、2、5、10、20μg/kg，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：樣品添加濃度為10μg/kg時(shí)，本檢測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果均為陽性，因此可以確定該方法檢測(cè)限為10μg/kg。

2.2 假陽性率

取空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料補(bǔ)充料樣品各10份，5μg/kg AFB1添加濃度，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)假陽性數(shù)，檢測(cè)陰性樣品結(jié)果顯示：本檢測(cè)方法樣品檢測(cè)的假陽性率為0。

2.3 假陰性率

取10μg/kg AFB1添加的豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料補(bǔ)充料樣品各10份，20μg/kg AFB1添加各10份，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)陽性樣品結(jié)果顯示：本檢測(cè)方法對(duì)樣品檢測(cè)的假陰性率為0。

2.4 特異性

選擇飼料中常檢出的真菌毒素，對(duì)空白樣品進(jìn)行添加測(cè)定，通過陰陽性來判斷檢測(cè)方法的特異性。在空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料補(bǔ)充料樣品中分別添加2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、500μg/kg黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、T-2毒素、伏馬毒素，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行檢測(cè)，樣品中黃曲霉毒素B1添加濃度≥10μg/kg時(shí)，檢測(cè)結(jié)果呈陽性，其他真菌毒素的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。說明本檢測(cè)方法可特異性地檢測(cè)黃曲霉毒素B1，而對(duì)其他真菌毒素?zé)o特異性反應(yīng)。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)中兩種方法比對(duì)

抽取花生粕、奶牛精料補(bǔ)充料樣品共20份，用膠體金免疫層析法和儀器方法分別進(jìn)行檢測(cè)。儀器方法參考GB/T 30955-2014《飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜》，結(jié)果表明其中17個(gè)樣品呈陰性，兩種方法檢測(cè)黃曲霉毒素B1含量均未檢出，另3個(gè)樣品呈陽性，兩種方法均有檢出，相對(duì)偏差的計(jì)算是以高效液相色譜測(cè)定值為參考值，兩種方法的最大相對(duì)偏差為15.1%，其結(jié)果具有一致性。

3 結(jié)論

用膠體金免疫層析方法初步篩查飼料原料中黃曲霉毒素B1的方法滿足對(duì)黃曲霉毒素B1滿足對(duì)黃曲霉毒素B1限量要求。膠體金免疫層析法快速定量法檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1殘留具有檢測(cè)快速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種快速篩查方法，當(dāng)篩查出高于檢測(cè)限的陽性樣品時(shí)，須采用相關(guān)液相、液質(zhì)分析方法進(jìn)行確證。