紅棕杜鵑（原變種）葉提取物體外抗3種皮膚真菌活性的研究

莫 全 楊勇勛

（西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615000）

皮膚癬菌病是由皮膚癬菌引起的毛發(fā)、皮膚和指（趾）甲的淺部感染，其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高，并可以在動物之間、動物與人之間傳播，造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，且部分屬為親動物性皮膚癬菌，特別是須毛癬菌、犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌對犬、貓有重要意義，可引起斑狀脫毛癬、輪狀脫毛癬、水皰性和結(jié)痂性脫毛癬、毛囊炎[1]。臨床上表現(xiàn)極度瘙癢，脫毛形成鱗屑、毛囊破裂、潰瘍性及結(jié)節(jié)性皮炎、指甲干燥開裂質(zhì)脆且變形，3種真菌均為人蓄共患病原，人由接觸感染的犬、貓而被傳染，用西藥進行治療價格相對較貴，并具有一定的毒副作用，臨床上現(xiàn)有的抗真菌藥物如兩性霉素B、唑類抗真菌藥等在高效低毒、抗真菌譜和耐藥性方面評價尚不太令人滿意。真菌感染的治療受到藥物安全性、真菌耐藥性及藥物效能等方面的局限[2]，因此急需研發(fā)有效的、安全無毒的、純天然的、對環(huán)境友好的植物源抑真菌劑替代化學(xué)藥劑，有利于治愈各種頑固性真菌疾病。

杜鵑花（Rhododendron simsii Planch），又稱山躑躅、山石榴、映山紅，全世界的杜鵑花約有900種，中國杜鵑花種類多、分布廣，四川涼山地區(qū)杜鵑花科植物種類多，分布范圍廣，物種資源豐富，且涼山紅棕杜鵑（原變種）還具有一些其他中醫(yī)藥不具備的獨特功能，部分種類還為特殊種[3]。目前對于杜鵑花的研究主要集中于止咳、平喘、治療慢性支氣管等疾病，據(jù)資料記載杜鵑花毒素具祛風(fēng)除濕，降低血壓，減慢心率的功效[4]，對于紅棕杜鵑（原變種）對皮膚真菌的治療暫無記錄，屬于研究的空白。從植物與微生物中研究新的生物天然抗真菌物質(zhì)是當(dāng)前開發(fā)、研制新型殺菌劑的熱點之一，現(xiàn)階段有關(guān)植物提取物對抗皮膚真菌的研究不多，但植物仍被認(rèn)為是化學(xué)藥劑最好的替代品，Wilkins等（1989）曾報道有1389種植物有可能作為殺菌劑[5]，植物中的抗毒素、類黃酮、有機酸以及酚類化合物均具有殺菌或抗菌活性，而杜鵑花（原變種）中富含黃酮等酚酸類成分，因此將紅棕杜鵑（原變種）提取物作用于皮膚真菌的研究與開發(fā)具有很高的價值。

1 材料

1.1 試驗菌種

犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌三種皮膚真菌，由西昌學(xué)院攀西動物疫病檢測與防控重點實驗室提供。

1.2 材料與試劑

紅棕杜鵑（原變種）葉2016年6月采集于涼山州昭覺縣七里壩，經(jīng)西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院楊勇勛副教授鑒定。葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、蒸餾水、正丁醇、二甲基亞砜、石蠟，以上藥品均由西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院實驗室提供。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 紅棕杜鵑（原變種）葉各提取物的制備

將采集的涼山紅棕杜鵑（原變種）葉1kg，用清水沖洗兩遍并用蒸餾水沖洗兩遍，自然條件下通風(fēng)干燥后，用電動粉碎機粉碎成粉末，室溫下用95%的乙醇、乙酸乙酯、石油醚分別浸泡兩次，每次約24h，浸泡完成后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑，分別得到乙醇、乙酸乙酯、石油醚浸劑提取物，各取20g提取物標(biāo)記備用[6]。

2.1.2 紅棕杜鵑（原變種）葉乙醇提取物各萃取相的制備

乙醇提取物除部分直接用于活性測定外，余者全部混懸于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按3比1的比例進行萃取。萃取液分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器后，分別得到石油醚相浸膏、乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏，各取20g浸膏標(biāo)記備用[7]。

2.1.3 紅棕杜鵑（原變種）葉各提取物及乙醇提取物各萃取相溶液的配制

取紅棕杜鵑（原變種）葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液及乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相浸膏各2g，然后用水及適量的二甲基亞砜配制成濃度為1g/L的藥液，做好標(biāo)記供生物活性測定時使用。

2.2 抗菌活性試驗

準(zhǔn)確吸取1.5ml藥液加入到13.5ml融化的沙氏培養(yǎng)基中（50℃左右），混勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿（直徑9.0cm）內(nèi)，制成含藥培養(yǎng)基平板，不同含藥培養(yǎng)基平板做好標(biāo)記，對照混入相同體積的二甲基亞砜與水混合物加入到13.5ml融化的沙氏培養(yǎng)基，混合均勻后倒入規(guī)格一致的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制成不含藥培養(yǎng)基平板，作為空白對照組[8-9]。在已培養(yǎng)4～5d的供試菌平板上，用直徑為0.4cm的打孔器制成若干菌餅，用接種環(huán)挑取菌餅分別輕放于含藥培養(yǎng)基和非含藥培養(yǎng)基平面上（有菌絲的一面朝下），每個培養(yǎng)皿放置兩個菌餅，每組重復(fù)3次，25℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周后測定各試驗組的菌落直徑。

2.3 計算紅棕杜鵑（原變種）葉提取物抑菌率

按下式計算紅棕杜鵑（原變種）葉提取物對供試菌的菌絲生長抑制率。

2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS 20. 0 軟件對數(shù)據(jù)進行整理，并進行單因素方差分析和多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅棕杜鵑（原變種）葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液抗3種皮膚真菌活性結(jié)果

從表1可以明顯看出不同極性的有機溶劑所得杜鵑（原變種）葉粗提液對3種皮膚真菌均有抑制作用，且抑制效果差別明顯，乙酸乙酯粗提液抑菌效果最佳，對石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌和須毛癬菌抑菌率分別為43.3%、49.3%、53.6%，石油醚粗提液抑菌效果最差，對抑菌率分別為28.3%、29.6%、32.4%。

表1 紅棕杜鵑（原變種）葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液抑菌率

3.2 紅棕杜鵑（原變種）葉乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相抗3種皮膚真菌活性結(jié)果

從表2可以觀察出紅棕杜鵑（原變種）葉各萃取相對3種皮膚真菌均有不同程度的抑制作用，對犬小孢子菌來說，乙酸乙酯萃取相抑菌效果最佳，抑菌率為42%，正丁醇萃取相抑菌效果最弱，抑菌率為18.5%。

表2 紅棕杜鵑（原變種）葉乙酸乙酯萃取相、石油醚萃取相、正丁醇萃取相抑菌率

以上結(jié)果表明紅棕杜鵑（原變種）葉提取物對于3種皮膚真菌均有抑制作用，經(jīng)95%乙醇浸泡后正丁醇萃取所得的粗提液抑菌效果最差，乙酸乙酯粗提取液抑菌效果最佳，根據(jù)相似相溶的原理，紅棕杜鵑（原變種）葉的抗真菌成分主要存在于乙酸乙酯當(dāng)中。

4 結(jié)果與討論

皮膚癬菌可分為親動物型與親人型，均可直接或間接引起人的皮膚癬菌病，潮濕、溫暖、不潔、擁擠的環(huán)境是造成皮膚癬菌病的主要因素，皮膚癬菌病呈世界性分布，且對動物特別是犬、貓皮膚造成了重要傷害[10-12]。植物源藥物由于不易產(chǎn)生耐藥，是當(dāng)前抗菌藥物研究的熱點，現(xiàn)階段對于通過植物源藥物治療皮膚真菌的記錄逐年增加，如科學(xué)家已通過提取洋蔥、竹、大蒜、大蔥、韭菜及若干種中藥中的有效成分作用于皮膚真菌，且研究結(jié)果表明有抑制作用[13]。目前杜鵑（原變種）葉的研究前景主要集中于扦插繁育方面，關(guān)于治療皮膚真菌暫無記錄。植物粗提取物成分復(fù)雜，通過不同的提取方法、提取溶劑可得到不同的有效成分，藥理作用復(fù)雜，抗真菌成分也多樣，并且受各種因素影響，因此對于植物源藥物的開發(fā)與研究需要深入且系統(tǒng)地研究[14]。

本試驗用不同極性的紅棕杜鵑（原變種）葉提取物及萃取相對犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌三種皮膚癬菌進行體外抗真菌活性的研究，試驗結(jié)果顯示紅棕杜鵑（原變種）葉具有抑菌作用，在同一種有機溶劑中，浸泡所得粗提液抑菌效果優(yōu)于萃取相；同種提取方法中，乙酸乙酯粗提取液效果較好，乙醇粗提取液效果次之，石油醚粗提取液效果最弱。楊勇勛等人從紅棕杜鵑（原變種）乙酸乙酯粗提液中分離純化得到的植物單體─東莨菪內(nèi)酯[15]，研究表明該單體主要存在于紅棕杜鵑（原變種）當(dāng)中，具有良好的殺蟲、抗菌殺菌、殺螨、化感等生物活性[16]，這與本次試驗當(dāng)中乙酸乙酯粗提液抗皮膚真菌效果最佳的結(jié)果相一致，且提示試驗中主要的抗真菌成分可能為東莨菪內(nèi)酯，說明從紅棕杜鵑（原變種）中提取抗真菌活性藥物具有研究價值。此次試驗結(jié)果為植物源抗菌藥物的研發(fā)提供了一定的參考價值，但杜鵑（原變種）葉中具有抗真菌作用的具體成分是什么，何種提取溶劑何種提取方法所得提取物的何種濃度的抑菌效果最佳，還需要進一步研究和開發(fā)利用。