嗜水氣單胞菌高免血清的制備及效價測定

崔 旭 黃春華

（1.重慶市石柱縣下路街道畜牧獸醫(yī)站，重慶 409100；2.重慶市石柱縣動物疫病預防控制站，重慶 409100）

嗜水氣單胞菌屬于弧菌科，氣單胞菌屬。氣單胞菌屬根據有無運動力可分為兩類；一類是嗜冷性、非運動性的氣單胞菌，另一類為嗜溫性、運動性的氣單胞菌。嗜水氣單胞菌屬第二類，在氣單胞菌屬中是最重要的，它是氣單胞菌的模式種。非運動性氣單胞菌主要是對鮭鱒魚等致病的殺鮭氣單胞菌及其亞種。嗜水氣單胞菌在過去有不同的名稱，主要的名稱有點狀氣單胞菌和斑點氣單胞菌。嗜水氣單胞菌廣泛存在于淡水、污水及土壤。有很多資料記載，嗜水氣單胞菌對水產動物、家畜和人均有致病性，在動物疾病學和食品衛(wèi)生學研究上都具有重要意義。它能廣泛地被分離到，如在淡海水魚，淡水蝦類，淡水蟹類中和養(yǎng)殖蛙體內，也能引起爬行類疾病。有許多報道證明它也能感染人類發(fā)病，最常見的是嗜水氣單胞菌引起急性霍亂。同時，它廣泛分布于人類的食物鏈，供水系統(tǒng)和土壤中。

嗜水氣單胞菌既是恒溫動物與變溫動物的條件致病菌，又是原發(fā)致病菌。但是，AUSTIN等報道嗜水氣單胞菌通常在自然界是條件致病菌，充當繼發(fā)病原而不是原發(fā)病原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：嗜水氣單胞菌XS9141。

1.1.2 培養(yǎng)基：普通肉湯培養(yǎng)基，鮮血平板培養(yǎng)基。

1.1.3 藥品：甲醛 1%疊氮鈉

1.1.4 試驗動物：1.5～2㎏/只。

1.2 方法

1.2.1 菌種復壯：將菌種接種巧克力培養(yǎng)基中，在28℃的條件下培養(yǎng)24h，形成單個菌落。

1.2.2 疫苗的制備：挑取單個菌落到5ml普通肉湯培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)24h，再倒入100ml普通肉湯培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)24h。涂片鏡檢、OD值的測定。然后加0.4%的甲醛溶液于37℃條件下滅活24h，每100ml加入1ml 1%疊氮鈉防腐，不加佐劑，制成非佐劑疫苗，4℃條件下保存。

1.2.3 免疫：取1.5kg左右的非免疫家兔四只，隨機分成兩組，每組兩只，實驗組和對照組。實驗組分五次免疫，耳靜脈注射，每次間隔7d，第一次注射0.5ml/只；第二次注射0.5ml/只；第三次注射1 ml/只；第四次注射1.5 ml/只；第五次注射2 ml/只；空白對照組不注射，同樣條件下飼養(yǎng)。

1.2.4 血清的分離與保存：每次免疫后間隔7d耳靜脈采血，五次免疫完后間隔14d采取心臟采血，常溫下靜置，待血液完全凝固后置4oC冰箱過夜析出血清，按0.01%的比例加入1%疊氮鈉防腐，充分混勻后按3ml每瓶分裝到無菌青霉素瓶子，放置-20℃冰柜中保存?zhèn)?/p>

1.2.5 檢測抗原的制備：將嗜水氣單胞菌，接種于5ml普通肉湯，在28℃的條件下震蕩培養(yǎng)24h后，將菌液轉入盛裝有50ml普通肉湯的三角燒瓶中，在28℃的條件下震蕩培養(yǎng)24h，取出。將上述菌液在4000r/min 離心20min，取上清液，裝入無菌青霉素瓶子，放置-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 抗體效價的測定：采用凝集試驗檢測抗體效價。參照Roberson的方法做微量板凝集試驗。在96孔u型板上用PBS緩沖液倍比稀釋待檢血清，使終容量為100μl/孔，并以PBS緩沖液孔作陰性對照；然后加入抗原，50μl/孔，4℃ 過夜，判斷結果如圖1。

2 試驗結果

本試驗主要是通過將嗜水氣單胞菌接種到巧克力培養(yǎng)基里復壯后制成非佐劑疫苗，采用耳靜脈注射，免疫非免疫家兔誘發(fā)產生免疫力制備高免血清，采用凝集試驗檢測抗體效價。第7天凝集效價為1：16，第14天凝集效價為1：64，第21天凝集效價為1：512，第28天凝集效價為1：1024，第35天凝集效價為1：2048，第42天凝集效價為1：2048，結果顯示最高凝集效價是1：2048。對照組沒有檢測到嗜水氣單胞菌的抗體。

3 分析討論

（1）實驗結果顯示，家兔在第一次免疫后的第7天就能檢測到凝集效價，第二次、第三次、第四次的凝集效價都比前一次的要高，在第四次、第五次和第六次檢測時結果顯示已經保持平衡，不在增加，最高凝集效價也就在第四次檢測出為1：2048。而對照組沒有檢測到凝集效價。

在注射劑量的選擇時第一次和第二次都是用0.5ml，以后每次遞增0.5ml，因為注射途徑是耳靜脈注射，直接進入血液，如果第一次的注射劑量過大，會造成實驗動物無法適應，從而引起一些不適應癥或死亡，要有一個過渡階段，這樣免疫效果才會更佳。

通過結果顯示，28d的效價高于21d，21d的效價又高于14d，14d的效價又高于7d，而每次的劑量和時間都在原有的基礎上有所增加，應此我們可以推測凝集效價的高低與劑量和時間有關。28d、35d和42d的效價都為1：2048，第五次注射的劑量比第四次的要高時間要長，但效價卻沒有增加，這可以說明效價達到一定高度的時侯凝集效價就不在增加。

（2）目前，對其他菌的高免血清的研究較多，但是對嗜水氣單胞菌高免血清的研究的文獻報道還沒有，本試驗所產生的數據可為嗜水氣單胞菌高免血清研究提供參考、依據。

（3）目前，檢測抗體的方法有很多，如：瓊脂雙向擴散試驗、免疫熒光試驗、血清中和試驗等。但凝集試驗所需設備簡單，操作方便、易行，現象明顯，易于觀察。于是本次試驗采用了凝集試驗檢測血清抗體效價。

4 結論

從本試驗看，嗜水氣單胞菌中含有可以使機體產生抗體的物質，而本試驗采用的免疫方法可以使這些物質刺激機體產生抗體。