體外受精－胚胎移植中移植不同培育時(shí)間、單雙胚胎的不孕癥患者受孕及妊娠結(jié)局觀察

李翔，曾莠蔓，羅宇迪，張炬光，羅博文，何娟，賈俊龍

(1玉林市婦幼保健院，廣西玉林，537000;2中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院)

不孕不育是與工作壓力和生活環(huán)境等因素相關(guān)的疾病。近年，不孕不育發(fā)病率逐漸升高，且發(fā)病年齡趨于年輕化。迄今為止，體外受精－胚胎移植技術(shù)(IVF－ET)是治療不孕不育最有效的醫(yī)療手段，但是使雙胎妊娠及多胎妊娠等不良妊娠結(jié)局發(fā)生的概率增加，產(chǎn)婦及新生兒并發(fā)癥發(fā)病率升高［1]。因此，選擇移植胚胎的發(fā)育天數(shù)和減少胚胎移植的數(shù)量，在不影響患者受孕率的同時(shí)降低多胎妊娠的發(fā)生率受到越來越多的關(guān)注。部分研究者認(rèn)為延長(zhǎng)體外培養(yǎng)天數(shù)至囊胚移植，其受孕率優(yōu)于卵裂期胚胎［2]，但是有研究者認(rèn)為卵裂期胚胎移植也可以達(dá)到良好的妊娠效果［3]。對(duì)于移植胚胎數(shù)量的選擇，研究者認(rèn)為采用單胚胎移植可以有效減少多胎妊娠的發(fā)生［4，5]。本研究通過分析移植胚胎的發(fā)育天數(shù)和數(shù)量對(duì)妊娠結(jié)局的影響，以期為臨床應(yīng)用提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年7月～2018年2月間于本院生殖醫(yī)學(xué)中心行常規(guī)體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射—胚胎移植(IVF/ICSI－ET)助孕治療的不孕不育患者1 719例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜38歲;無遺傳性及家族性病史;不孕原因?yàn)榕枨惠斅压芤蛩睾湍蟹揭蛩亍Ｅ懦龢?biāo)準(zhǔn)：存在習(xí)慣性流產(chǎn)史;存在子宮畸形、合并子宮肌瘤、子宮腺肌癥;卵巢功能減退者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，納入者均簽署知情同意書。

1.2 IVF/ICSI－ ET方法 ①促排卵：納入者均行黃體期長(zhǎng)方案或卵泡期長(zhǎng)方案，B超檢測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)主導(dǎo)卵泡2個(gè)＞18 mm或3個(gè)＞18 mm，雌二醇＞150 mg/卵時(shí)，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 000 IU，注射36 h經(jīng)陰道超聲采卵。②授精及胚胎培養(yǎng)：將取卵+受精日記為第0日(D0)、胚胎培養(yǎng)第1天記為D1。D3挑選1～2個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎移植或冷凍、剩余3級(jí)以上的胚胎轉(zhuǎn)至預(yù)先平衡好的囊胚培養(yǎng)液微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。D5、D6分別觀察囊胚形成情況及形態(tài)。③胚胎質(zhì)量觀察：D3觀察胚胎發(fā)育情況，胚胎評(píng)級(jí)1、2級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。D5、D6按照Gardner評(píng)分系統(tǒng)對(duì)囊胚進(jìn)行質(zhì)量評(píng)級(jí)，可利用胚胎定義為3期以上，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞不同時(shí)為C級(jí)。④胚胎移植新鮮胚胎移植移植D3期卵裂胚和D5期囊胚，凍融胚胎移植移植D3期卵裂胚、D5期和D6期囊胚。新鮮胚胎移植選擇1～2枚3級(jí)以上D3期胚胎進(jìn)行移植或者冷凍;選取1～2枚D5可用囊胚以上的囊胚新鮮移植或者冷凍，D6形成囊胚只冷凍不進(jìn)行新鮮移植。胚胎冷凍和解凍均采用玻璃化快速冷凍解凍方法，胚胎冷凍液和胚胎解凍液購(gòu)于日本加藤(10101、10102)。單胚胎移植可進(jìn)行新鮮胚胎移植(D5囊胚、D3胚胎)、凍融胚胎移植(D3胚胎、D5胚胎、D6胚胎)移植，雙胚胎移植可進(jìn)行新鮮胚胎移植(D5囊胚、D3胚胎)、凍融胚胎移植(D3兩枚胚胎、D5兩枚胚胎、D6兩枚胚胎)移植。新鮮胚胎移植胚胎移植標(biāo)準(zhǔn)：獲卵數(shù)較多且有卵巢過度刺激綜合征(OHSS)傾向不移植。年齡＜38歲，獲卵數(shù)不多且無卵巢過度刺激綜合征(OHSS)傾向，移植1～2枚D3胚胎或者D5囊胚。凍融胚胎移植優(yōu)先移植優(yōu)質(zhì)囊胚，然后D3優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.3 受孕及妊娠結(jié)局觀察 移植后觀察各組妊娠結(jié)局(生化妊娠、臨床妊娠)：移植后14、18檢測(cè)外周血B－h(huán)CG陽(yáng)性［5]可判定為生化妊娠。臨床妊娠：移植后第35天行腹部B超觀察子宮腔內(nèi)孕囊數(shù)目和心管搏動(dòng)情況，測(cè)算臨床受孕率、種植率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、多胎率。臨床受孕率=臨床妊娠周期數(shù)/移植胚胎周期數(shù)×100%，種植率=B超下見到孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，多胎率=多胎妊娠周期/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPASS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。多組計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn);定性資料中 %比較采用χ2檢驗(yàn)，若有一個(gè)格子的理論頻數(shù)＜5則用 Fisher’s確切概率法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

1 179例患者中，單胚胎移植的新鮮胚胎移植中D3胚胎者66例、D5囊胚者29例，凍融胚胎移植移植中D3胚胎者56例、D5胚胎者23例、D6胚胎者40例。雙胚胎移植的新鮮胚胎移植中D3胚胎者747例、D5囊胚者31例，凍融胚胎移植移植中D3胚胎者561例、D5胚胎者121例、D6胚胎者45例。

新鮮胚胎移植D3單胚胎移植者的年齡(33.03±4.00)歲，BMI(22.59 ± 3.13)Kg/m2，不孕(5.15±3.95)年，既往胚胎移植(1.23 ±0.46)周期，基礎(chǔ)FSH(5.91 ± 1.61)IU/L、Gn 總量 (2 310.61 ±713.34)IU、Gn 使用(10.70 ±2.36)d、獲卵數(shù)(9.73±4.03)個(gè)、內(nèi)膜厚度(10.36 ±2.10)mm、臨床受孕率25.76%(17/66)、種植率 25.76%(17/66)、流產(chǎn)率29.41%(5/17)、異位妊娠率 5.88%(1/17)、多胎率0;新鮮胚胎移植D5單胚胎移植者的年齡(31.41 ±4.32)歲，BMI(22.43 ±3.12)Kg/m2，不孕(3.69 ±2.52)年，既往胚胎移植(1.17 ±0.54)周期，基礎(chǔ) FSH(5.30 ±1.80)IU/L、Gn 總量(2 337.93 ±399.14)IU、Gn 使用(10.90 ±2.70)d、獲卵數(shù)(10.10 ±2.60)個(gè)、內(nèi)膜厚度(10.33 ±1.96)mm、臨床受孕率 51.7%(15/29)、種植率 51.7%(15/29)、流產(chǎn)率 6.67%(1/15)、異位妊娠率 0、多胎率0。與新鮮胚胎移植D3單胚胎移植者比較，新鮮胚胎移植D5單胚胎移植者臨床受孕率、種植率升高，流產(chǎn)率降低(P均＜0.05)。凍融胚胎移植D3單胚胎移植者的年齡(32.68 ±3.87)歲，BMI(22.35±2.80)Kg/m2，不孕(3.79 ±2.15)年，既往胚胎移植(1.85 ±0.49)周期，基礎(chǔ) FSH(5.64 ±2.50)IU/L、內(nèi)膜厚度()mm、臨床受孕率21.43%(12/58)、種植率21.43%(12/58)、流產(chǎn)率 16.67%(2/12)、異位妊娠率0、多胎率0;凍融胚胎移植D5單胚胎移植者的年齡(32.09 ± 4.59)歲，BMI(21.66 ± 5.55)Kg/m2，不孕(4.13 ±1.91)年，既往胚胎移植(1.83±0.58)周期，基礎(chǔ)FSH(6.06 ±2.81)IU/L、內(nèi)膜厚度(9.65+1.62)mm、臨床受孕率60.08%(32/53)、種植率54.24%(32/59)、流產(chǎn)率0、異位妊娠率0、多胎率10.08%(3/30);凍融胚胎移植D6單胚胎移植者的年齡(33.25 ±3.33)歲，BMI(22.48 ±2.55)kg/m2，不孕(4.68 ±2.68)年，既往胚胎移植(1.95±0.50)周期，基礎(chǔ)FSH(5.81 ±1.59)IU/L、內(nèi)膜厚度(9.98 ±2.02)mm、臨床受孕率30.00%(12/40)、種植率 30.00%(12/40)、流產(chǎn)率 25.00%(3/12)、異位妊娠率0、多胎率0。與凍融胚胎移植D3、D6單胚胎移植者比較，凍融胚胎移植D5單胚胎移植者臨床受孕率、種植率升高(P均＜0.05)。

新鮮胚胎移植D3雙胚胎移植者的年齡(31.35±3.80)歲，BMI(21.85 ± 3.03)Kg/m2，不孕(4.45±3.06)年，既往胚胎移植(1.15 ±0.45)周期，基礎(chǔ)FSH(5.58 ±1.41)IU/L、Gn 總量 (2267.49 ±764.64)IU、Gn 使用(11.27 ± 2.15)d、獲卵數(shù)(10.73 ±4.42)個(gè)、內(nèi)膜厚度(10.15 ±1.75)mm、臨床受孕率 56.49%(422/747)、種植率 38.22%(571/1494)、流產(chǎn)率 2.09%(46/422)、異位妊娠率2.84%(12/422)、多胎率 34.36%(145/422);新鮮胚胎移植D5雙胚胎移植者的年齡(31.90±3.72)歲，BMI(22.37 ± 3.06)Kg/m2，不孕(4.35 ± 3.32)年，既往胚胎移植(1.23±0.56)周期，基礎(chǔ) FSH(5.31 ±1.86)IU/L、Gn 總量 (2174.73 ±774.79)IU、Gn 使用(11.13 ±2.20)d、獲卵數(shù)(10.48 ±2.93)個(gè)、內(nèi)膜厚度(10.04 ±1.69)mm、臨床受孕率74.19%(23/31)、種植率 59.68%(37/62)、流產(chǎn)率4.35%(1/23)、異位妊娠率 0、多胎率 30.43%(7/23)。與新鮮胚胎移植D3雙胚胎移植者比較，新鮮胚胎移植D5雙胚胎移植者種植率、受孕率升高(P均 ＜0.05)。

凍融胚胎移植D3雙胚胎移植者的年齡(31.93±3.70)歲，BMI(21.85 ± 3.06)Kg/m2，不孕(3.98±2.04)年，既往胚胎移植(2.13 ±0.50)周期，基礎(chǔ)FSH(5.80 ±2.27)IU/L、內(nèi)膜厚度(9.48 ± 1.49)mm、臨床受孕率47.59%(267/561、種植率 32.80%(368/1122)、流產(chǎn)率16.48%(44/267)、異位妊娠率6.35%(17/267)、多胎率 36.33%(97/267);凍融胚胎移植D5雙胚胎移植者的年齡(31.63±3.25)歲，BMI(22.58 ±3.22)Kg/m2，不孕(3.92 ±1.92)年，既往胚胎移植(2.16 ±0.56)周期，基礎(chǔ) FSH(5.95±2.08)IU/L、內(nèi)膜厚度(9.51+1.50)mm、臨床受孕率 76.03%(92/121)、種植率 59.92%(145/242)、流產(chǎn)率 4.35%(4/92)、異位妊娠率 3.26%(3/92)、多胎率55.43%(51/96);凍融胚胎移植D6雙胚胎移植者的年齡(31.20 ±4.12)歲，BMI(22.59±2.85)kg/m2，不孕(3.81 ±2.46)年，既往胚胎移植(2.20 ±0.73)周期，基礎(chǔ) FSH(5.53 ±1.32)IU/L、內(nèi)膜厚度(9.56 ±1.36)mm、臨床受孕率 51.11%(23/45)、種植率 41.11%(37/90)、流產(chǎn)率 0、異位妊娠率0、多胎率8.69%(2/23)。與凍融胚胎移植D3、D6雙胚胎移植者比較，凍融胚胎移植D5雙胚胎移植者臨床受孕率、種植率、多胎率升高(P均＜0.05);與凍融胚胎移植D3雙胚胎移植者比較，凍融胚胎移植D6雙胚胎移植者臨床受孕率、種植率升高，多胎率、流產(chǎn)率降低(P均＜0.05);與凍融胚胎移植D3雙胚胎移植者比較，凍融胚胎移植D5雙胚胎移植者異位妊娠率升高(P＜0.05)。

3 討論

近年來，隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展和胚胎培養(yǎng)條件的成熟，IVF中心傾向于對(duì)患者胚胎行囊胚培養(yǎng)，在胚胎發(fā)育到第5或6天移植1～2枚優(yōu)質(zhì)囊胚［2，4]。但是，囊胚培養(yǎng)延長(zhǎng)了胚胎在體外暴露的時(shí)間，胚胎質(zhì)量、卵母細(xì)胞質(zhì)量及培養(yǎng)環(huán)境等均可影響囊胚形成，可能會(huì)造成無胚胎可用的情況［6]。因此，選擇在受精后第3天移植1～2枚8細(xì)胞以上的優(yōu)質(zhì)胚胎，可以減少取消移植周期的風(fēng)險(xiǎn)。有研究報(bào)道，卵裂期胚胎移植期受孕率和種植率與囊胚移植無明顯差異［3]。本研究中，我們新鮮胚胎移植選擇移植1～2枚第3天優(yōu)質(zhì)期卵裂期胚胎或者選擇移植第5天1～2枚可用囊胚;凍融胚胎移植優(yōu)先選擇D5囊胚移植，D6和D3優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植。結(jié)果顯示，在新鮮胚胎移植和凍融胚胎移植中，囊胚移植其受孕率和種植率均高于卵裂期胚胎移植，其中D5囊胚優(yōu)于D6囊胚，這與國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究［4，7]結(jié)果一致。可能的原因：①在正常生理狀態(tài)下，4～8細(xì)胞的卵裂期胚胎處在輸卵管中，而囊胚期胚胎才遷移至子宮內(nèi)著床，所以移植囊胚符合內(nèi)膜容受性［8];②發(fā)育速度較快的胚胎其存活能力更高，胚胎的發(fā)育速度較快其發(fā)育潛能可能更高，所以D5囊胚受孕率更高［9];③發(fā)育潛能較差的胚胎可能停滯在基因組激活的卵裂期階段，體外繼續(xù)培養(yǎng)后能夠形成的囊胚，其染色體異常的比例更低，D3卵裂胚可能部分停滯發(fā)育［10];同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，移植2枚D3卵裂期胚胎可以獲得高達(dá)53%的受孕率和較高種植率，但是存在較高的多胎率。因此，對(duì)于獲卵數(shù)較多的患者胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，優(yōu)先選擇D5囊胚進(jìn)行移植，對(duì)于獲卵數(shù)較少的患者可以選擇2枚D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎移植，獲得較好的臨床效果。

早期IVF－ET通常選擇移植2～3枚優(yōu)質(zhì)胚胎，以便增加患者受孕率。但是，這種片面追求受孕率的提高，已不適應(yīng)當(dāng)前輔助生殖技術(shù)發(fā)展的需要。有研究報(bào)道，多胚胎移植顯著增加多胎妊娠發(fā)生的概率，而多胎妊娠增加了產(chǎn)婦高血壓、不足月產(chǎn)和早產(chǎn)的概率，低體重兒和腦癱患兒的概率也隨之增加，降低多胎妊娠的最佳手段是單胚胎移植，可明顯降低雙胎率的同時(shí)獲得更好的產(chǎn)科結(jié)局［11，12]。黃志輝等［13]對(duì)D3選擇性單胚胎移植的圍產(chǎn)結(jié)局分析發(fā)現(xiàn)，D3雙胎移植受孕率顯著高于單胎移植，但是兩組間種植率無差異，單胎移植明顯降低多胎妊娠的發(fā)生，獲得更好的妊娠結(jié)局。本研究通過對(duì)D3卵裂期單胚胎和多胚胎移植進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，D3雙胚胎移植受孕率可達(dá)47%～54%，單胚胎移植受孕率僅為21%～26%，但是D3雙胚胎移植多胎率高達(dá)30%以上，單胚胎移植未發(fā)現(xiàn)多胎妊娠。可能的原因有：卵裂期胚胎內(nèi)在質(zhì)量可能直接決定其發(fā)育潛能，從而影響胚胎移植后的臨床結(jié)局［14];胚胎發(fā)育到4～8細(xì)胞期存在明顯阻滯現(xiàn)象，雙胚胎移植增加了突破阻滯的機(jī)率。

單囊胚移植臨床受孕率和活產(chǎn)率較高，且多胎率、異位妊娠率及卵巢過度刺激發(fā)生率較低，但是選擇不同發(fā)育階段(D5和D6)和數(shù)量的囊胚移植，臨床妊娠結(jié)局存在差異。Yang等［15]研究發(fā)現(xiàn)，D5囊胚臨床受孕率和著床率高于D6囊胚，但是D5和D6優(yōu)質(zhì)囊胚臨床結(jié)局差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陳清汾等研究發(fā)現(xiàn)D5囊胚受孕率高于D6囊胚，滋養(yǎng)層評(píng)分高的D5囊胚可以提高受孕率，降低流產(chǎn)率［16]。Gardner等［4]研究發(fā)現(xiàn)單囊胚與雙囊胚移植的臨床受孕率分別為60.9%、76.0%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是單囊胚移植患者的多胎受孕率為0，顯著低于雙囊胚移植組的雙胎率47.4%。Henman等［17]通過對(duì)單囊胚與雙囊胚移植進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組間受孕率分別為 65.3%、64.2%，雙胎率為7.0%、34.0%。本研究發(fā)現(xiàn)D5期囊胚移植受孕率和種植率顯著高于D6期囊胚移植，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;雙囊胚移植受孕率顯著高于單囊胚移植，但是雙囊胚移植多胎率(30% ～55%)顯著高于單囊胚(0～10%)(缺乏新鮮胚胎移植D6囊胚移植的數(shù)據(jù));D5單囊胚移植受孕率可以達(dá)到(51% ～56%)，多胎率僅為10%。因此，選擇D5單囊胚移植，可以穩(wěn)定受孕率的同時(shí)，降低多胎率的發(fā)生。

玻璃化冷凍雖然是可行的技術(shù)，但是冷凍因素導(dǎo)致透明帶變硬，將會(huì)影響胚胎的孵化和著床［18]。文曉鳳等研究報(bào)道，刺激周期給予全胚冷凍后行解凍移植能夠增加患者的臨床受孕率及種植率［19]。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮胚胎移植和凍融胚胎移植選擇D5單囊胚移植，均可以獲得良好的臨床效果。

綜上所述，無論新鮮胚胎移植或凍融胚胎移植，IVF－ET中胚胎發(fā)育D5囊胚移植后妊娠結(jié)局最佳，可以獲得穩(wěn)定受孕率，減少多胎妊娠的分險(xiǎn)。對(duì)于獲卵數(shù)較少的患者可以選擇2枚D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎移植，也可以獲得較好的臨床效果。