腫瘤干細胞的耐藥機制研究進展

王露瑤，呂娟，阮紅杰

(南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院/南京市婦幼保健院，南京210004)

盡管目前的手術和放化療能夠減小腫瘤的體積和延長患者的生命，但腫瘤復發(fā)和多藥耐藥的發(fā)生仍是目前腫瘤治療的兩大障礙。腫瘤干細胞(CSCs)理論認為，腫瘤是異質性細胞群體，存在著一小部分類似于胚胎干細胞、具有無限自我更新和分裂能力的類干細胞，調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1～3]。常規(guī)的放化療主要是針對普通的腫瘤細胞，而CSCs對此并不敏感。同時，隨著放化療的刺激作用及普通腫瘤細胞的清除，改變了CSCs的微環(huán)境，CSCs得到富集，增殖侵襲轉移的能力進一步增強，并且對化療藥物表現(xiàn)出更強的耐藥性，對藥物的敏感性降低，甚至無反應，導致腫瘤的復發(fā)，說明CSCs在腫瘤耐藥中發(fā)揮了重要作用。對CSCs耐藥機制的研究將有助于腫瘤治療新思路的開拓。研究[4]發(fā)現(xiàn)，CSCs主要通過自身的生物學特性和腫瘤微環(huán)境的保護作用而在腫瘤耐藥中發(fā)揮作用，現(xiàn)將相關研究進展綜述如下。

1 CSCs的生物學特性

美國癌癥研究協(xié)會(AACRl3)定義CSCs為：腫瘤中能夠自我更新，并產生異質性腫瘤細胞的細胞。研究[2,6]顯示，將少量的CSCs種植于小鼠體內能重塑整個腫瘤的表型，因此常常導致腫瘤的復發(fā)、耐藥和轉移。和正常的干細胞一樣，CSCs高表達干性基因NANOG、OCT4、SOX2等，還有干性信號通路的激活，以此維持CSCs的干性，調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CSCs的生物學特性決定了CSCs不同于普通的腫瘤細胞。CSCs通常隱匿在癌巢中，處于靜止狀態(tài)，DNA復制不活躍，能夠逃避化療藥物誘導的DNA損傷作用，對DNA損傷的修復能力增強，保持基因的穩(wěn)定遺傳。CSCs的這些生物學特性受到胞內和胞外復雜的調控網絡的控制。

1.1 細胞周期阻滯 CSCs通常處于休眠狀態(tài)，增殖不活躍。大部分的化療藥物主要是針對分裂中的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞通常處于G2/S期，而CSCs處于G0/G1期，對化療藥物并不敏感。因放化療的作用，消除了普通腫瘤細胞，使CSCs得到富集。同時，也因化療藥物的刺激作用，靜止的CSCs迅速蘇醒，進入細胞周期，迅速增殖分裂，重構整個腫瘤的表型，導致腫瘤復發(fā)。CSCs休眠狀態(tài)需要自身特性和外部環(huán)境因素的共同作用的維持。在對胰腺癌CSCs的研究[7]中發(fā)現(xiàn)，耐藥的腫瘤球體細胞中，細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑P21和腫瘤抑制因子P53的表達升高，而細胞周期蛋白D1的表達降低，細胞周期停滯于G0/G1期，對普通化療藥物不敏感，常常導致腫瘤的復發(fā)。乙醛脫氫酶1(ALDH1)常常作為CSCs分選標志,可以將醛類氧化成羧酸類，抵抗烷化劑的損傷作用，高表達于CSCs表面。Meng等[8]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌CSCs中，ALDH1表達陽性的CSCs對化療藥物的敏感性明顯降低，ALDH1A通過調節(jié)KLF4和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑P21蛋白調整細胞周期，細胞停滯于對化療藥物不敏感的G0/G1期，從而抵抗藥物的殺傷作用。此外，糖原合成酶激酶-3(GSK-3)通過Wnt/β-catenin促進β-catenin泛素化，阻斷下游靶標細胞周期蛋白-1、c-Myc等的激活，抑制細胞周期的進程。Haraguchi等[9]發(fā)現(xiàn)，生長分化因子15(GD15)可以通過AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路增加肝CSCs在G0/G1期的細胞比例，增強肝CSCs的成球能力及對化療藥物的抵抗力。因此，細胞周期阻滯可以保護CSCs抵抗化療藥物的損傷，打破CSCs的休眠狀態(tài)可以作為新的治療方向。

1.2 DNA損傷耐受及DNA損傷修復 目前一部分化療藥物是通過誘導腫瘤細胞DNA損傷來發(fā)揮殺傷腫瘤細胞作用的，而CSCs不但處于休眠期，還具有極強的DNA損傷耐受及DNA損傷修復能力。其主要機制為，一方面通過切除修復去掉DNA受損部分，另一方面通過增強重組修復稀釋損傷的DNA鏈。腫瘤化療藥物順鉑主要是抑制腫瘤細胞的DNA復制與轉錄，誘導細胞的凋亡。Srivastava等[10]發(fā)現(xiàn)，卵巢CSCs中高表達DNA聚合酶Polη，通過促進跨損傷DNA合成，跳過損傷的DNA復制點，可以逃避順鉑的損傷作用。此外，對DNA損傷的修復還可通過增強對DNA雙鏈斷裂(DSBs)的修復來完成。Gold等[11]發(fā)現(xiàn)，新型抗癌藥物螺內酯抗腫瘤的作用機制，就是通過抑制腫瘤細胞的DSBs修復來完成的。因為螺內酯對完好的CSCs并不起作用，僅對發(fā)生DSBs的CSCs的DNA修復有抑制作用，解除CSCs的DNA損傷耐受、抑制CSCs的DNA修復，可以干擾CSCs的正常分裂，從而消除CSCs，抑制腫瘤的復發(fā)及耐藥，提高腫瘤清除率。

1.3 藥物外排 化療藥物發(fā)揮殺傷作用需要一定的藥物濃度，CSCs與普通腫瘤細胞相比，細胞內的藥物濃度較低，這與CSCs表面高表達多藥耐藥蛋白(MDR)有關。ABC轉運蛋白家族是一類MDR，即ATP結合盒蛋白，能夠利用ATP水解釋放的能量將治療藥物排出胞外，從而降低細胞內有效的藥物濃度，導致腫瘤的耐藥及復發(fā)。此外，ABC轉運蛋白還可作為腫瘤的預后因子，ABC亞家族C成員2(ABCC2)、ABCC3和ABC亞家族G成員2(ABCG2)作為CSCs的標志物，其表達與結腸癌患者的預后相關，可以作為結腸癌預后的預測因子。由于一種藥物可由多種轉運蛋白排出，單獨抑制某一種特定的轉運蛋白，無法阻礙藥物的外排，這也是阻礙靶向藥物成功運用于臨床的一大障礙。Wu等[12]發(fā)現(xiàn)，靶向藥物酪氨酸酶抑制劑tepotinib可以抑制ABCB1介導的藥物外排，但是不能阻斷ABCG2、ABCC1的外排作用。因此，進一步探究ABC轉運蛋白的調控機制，對恢復抗腫瘤藥物殺傷作用來說至關重要。

1.4 上皮間質轉化(EMT) EMT，即上皮細胞失去上皮細胞的特性而表達間質細胞的特性，并獲得侵襲轉移的能力。EMT在產生CSCs中起著關鍵作用，與CSCs的生物學特性及耐藥現(xiàn)象緊密相關。目前認為，一部分CSCs由已分化的腫瘤細胞去分化產生。Li等[13]研究表明，調控EMT過程的轉錄因子的上調，如snail、slug等，可以誘導已分化的腫瘤細胞去分化轉化為CSCs，并介導化學抗性。Shuang等[14]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT的惡性腫瘤細胞，干性基因的表達有所增強，表明發(fā)生EMT能使腫瘤細胞去分化為CSCs，獲得干性特征。與此同時，CSCs高表達間質細胞標志物。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌懸浮球培養(yǎng)的球體細胞高表達干性標志物CD44+、NANOG的同時，snail等EMT轉錄因子的表達也升高。Gao等[16]發(fā)現(xiàn)，在肝CSCs中CD44+的肝CSCs高表達間質細胞標志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白，而低表達上皮細胞標志物；去除CD44+CSCs,可以通過抑制ERK/Snai信號通路，減少肝癌細胞的轉移。越來越多的證據[17,18]表明EMT與CSCs之間的直接聯(lián)系，共同促進腫瘤侵襲、轉移，調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。EMT是一個動態(tài)的、可逆的過程，因此，通過直接靶向作用某個或某幾個EMT相關的轉錄因子，并不能抑制EMT的發(fā)生。探究EMT與CSCs之間的作用機制，對腫瘤的治療來說是至關重要的。

2 CSCs生存的腫瘤微環(huán)境的特點

CSCs的耐藥除了與其干性特征相關外，還受腫瘤微環(huán)境的調節(jié)。單個的CSCs無法獨自存活，需要腫瘤微環(huán)境的支持。腫瘤微環(huán)境不僅包括腫瘤細胞本身，還有與腫瘤相關的基質細胞、微血管、細胞間質和細胞因子。腫瘤微環(huán)境是一種動態(tài)變化的環(huán)境，受腫瘤發(fā)生發(fā)展的調節(jié)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展促腫瘤微環(huán)境的形成，微環(huán)境的低氧、低PH、微量葡萄糖供應進一步維持CSCs的干性和提高耐藥能力。CSCs的休眠狀態(tài)能夠適應微環(huán)境中低能量供應，一旦環(huán)境發(fā)生改變，CSCs能量利用方式隨之改變，進入增殖期擴增腫瘤細胞[19]。所以，CSCs所處的腫瘤微環(huán)境是維持干性、驅動腫瘤發(fā)展、復發(fā)及耐藥的重要因素。同種腫瘤在不同腫瘤微環(huán)境中，其基因表達和生物學行為之間具有顯著的差異性，可能與腫瘤微環(huán)境的差異相關。鑒于CSCs與腫瘤微環(huán)境相互作用關系，腫瘤微環(huán)境可以作為腫瘤治療的新的靶點，改變CSCs生存的環(huán)境，增加對藥物的敏感性。

2.1 低氧環(huán)境 低氧環(huán)境是腫瘤微環(huán)境的一大特點，是維持CSCs的干性的重要條件。低氧環(huán)境可以誘導CSCs的干性、促進EMT的發(fā)生以及產生更強的耐藥。低氧環(huán)境下眾多的信號通路處于激活狀態(tài)，主要是由缺氧誘導因子-1(HIF-1)介導的一系列級聯(lián)反應。HIF-1幾乎參與細胞代謝的每個過程，涉及腫瘤的發(fā)生、轉移、復發(fā)及耐藥。在低氧狀態(tài)下，HIF-1降解途徑被抑制，導致HIF-1及其調節(jié)的靶基因如NANOG等在CSCs中的表達普遍高于非CSCs[20]。Sun等[21]發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境下，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)/ATK信號通路的活化可以激活HIF-1α，提高CSCs抵抗化療藥物的能力。低氧環(huán)境還可以維持CSCs的休眠狀態(tài)，抑制細胞凋亡，抵抗藥物的殺傷作用。Li等[22]發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在神經膠質細胞瘤干細胞中明顯高表達，通過干擾HIF-2α的表達可以促進CSCs的凋亡。

2.2 腫瘤相關成纖維細胞(CAFs) 腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞及非腫瘤細胞構成，CAFs、巨噬細胞(M2細胞)是其中最重要的兩種間質細胞，這些細胞能夠分泌不同的細胞因子和生長因子，包括VEGF、IL-10和IL-17等，通過調節(jié)CSCs促進腫瘤的進展。CAFs受腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞生長因子、TGF-β的作用而激活，分泌大量的細胞因子，調節(jié)CSCs的增殖、維持CSCc的干性。此外，CAFs分泌的Annexin A1還能夠促進前列腺癌CSCs的增殖。Cazet等[23]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的異種移植實驗中，與單純移植CSCs相比，將CSCs和CAFs共同移植，其成瘤能力顯著增強。此外，CAFs能夠誘導已分化的腫瘤細胞去分化恢復CSCs表型。Vermeulen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，由于CAFs分泌肝細胞生長因子(HGF),通過作用于酪氨酸激酶受體c-Met激活Wnt信號通路，使位于結腸癌邊緣的腫瘤細胞表達更高的干性特征，導致結腸癌的耐藥及復發(fā)。CAFs不僅能夠維持CSCs的干性表型，同時自身高表達ABC轉運蛋白,為CSCs創(chuàng)造相對低藥物濃度的微環(huán)境。CAFs還能夠誘導CSCs代謝的改變，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Renner等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CAF分泌的細胞因子能夠增強CSCs膜上的葡萄糖轉運蛋白的表達，增加細胞對葡萄糖的攝取，供給細胞增殖所需的能量。Su等[26]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，CAFs通過為CSCs提供適宜的微環(huán)境，促進腫瘤發(fā)展及耐藥。通過靶向根除CAFs，破壞CSCs賴以生存的微環(huán)境，可以阻礙乳腺癌的發(fā)展，恢復對化療藥物的敏感性。因此，靶向作用于CAFs可以作為一種有效的治療策略。

2.3 慢性炎癥 雖然早期的炎癥反應能夠聯(lián)合機體的免疫系統(tǒng)抑制腫瘤的形成，慢性炎癥卻是腫瘤擴張的主要誘因。Kim等[27]發(fā)現(xiàn),IL-6作為免疫和炎癥反應的調節(jié)劑，可以通過IL-6-JAK1-STAT3信號通路的激活靶向OCT4基因，導致CSCs增殖，誘導非腫瘤細胞轉化為CSCs。慢性炎癥還會造成低氧的環(huán)境。Manupati等[28]研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子EGFR通過環(huán)氧化酶-2(COX-2)調節(jié)乳腺癌CSCs的自我更新。研究[29]表明，慢性炎癥與CSCs相互促進，如核因子κB-(NF-κB-)介導的炎癥反應增加了腫瘤細胞的干性，而CSCs表達NF-κB-的水平升高，進一步促進炎癥的形成。最新的研究[25,30]表明，腫瘤細胞免疫逃避和糖代謝增強是相互關聯(lián)的，并受腫瘤微環(huán)境的調節(jié)。癌癥相關的免疫細胞，例如巨噬細胞，由于腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀態(tài)，細胞產生大量的乳酸，而過量的乳酸可以使得MI型的巨噬細胞轉化為M2型的巨噬細胞，M2型的巨噬細胞可以分泌TGF-β1、EGF等細胞因子，誘導CSCs的增殖，增強CSCs的侵襲轉移能力，進一步促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此抗腫瘤治療中輔以抗炎治療，可以打破CSCs依賴的生存條件。

綜上所述，細胞周期阻滯、DNA損傷耐受及DNA損傷修復、藥物外排、EMT等CSCs的生物學特性，低氧環(huán)境、CAFs、慢性炎癥等腫瘤微環(huán)境的特點，共同維持CSCs的干性特征,抑制化療藥物對CSCs的刺激作用，加大了腫瘤治療的困難性。通過對CSCs耐藥機制的研究可以指導開發(fā)新的針對CSCs的靶向治療，聯(lián)合傳統(tǒng)的治療策略，同時消除CSCs和腫瘤細胞，提高腫瘤的治療效果。