宮頸癌組織中SALL3、DNMT3A、甲基化SALL3基因表達(dá)觀察

趙娟，魏星，楊婷，趙敏伊，楊筱鳳

(1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安710061；2 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。研究[1]顯示，我國(guó)每年新發(fā)病例數(shù)達(dá)13.1萬(wàn)，死亡例數(shù)達(dá)5.3萬(wàn)，占所有女性惡性腫瘤的18%。近年來(lái)，宮頸癌新的診斷和治療技術(shù)得到不斷發(fā)展，但患者的5年總體生存率僅在40%左右，因此明確宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找宮頸癌早期診斷指標(biāo)及治療方案具有重要的臨床意義[2]。研究[3]表明，表觀遺傳學(xué)調(diào)控如甲基化、乙?；?、糖基化等，參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。DNA甲基化修飾在基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，使CpG島中5′端胞嘧啶甲基化，而CpG島多位于基因啟動(dòng)子附近，因此DNA甲基化后將抑制基因轉(zhuǎn)錄。DNMT家族包括DNA甲基化維持酶(DNMT1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)3個(gè)成員，在DNA甲基化的啟動(dòng)和維持中發(fā)揮重要作用。研究[4]顯示，DNMT3A在多種腫瘤中高表達(dá)，可通過(guò)直接或協(xié)同作用導(dǎo)致抑癌基因異常甲基化而沉默其表達(dá)。spalt樣轉(zhuǎn)錄因子3(SALL3)是SAL基因家族的成員，位于染色體18q23，SALL3基因編碼產(chǎn)生含有4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。研究[5]顯示，SALL3基因啟動(dòng)子在腫瘤發(fā)生時(shí)存在異常甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致SALL3基因表達(dá)水平降低。研究[6]發(fā)現(xiàn)，SALL3能通過(guò)雙鋅指結(jié)構(gòu)域與DNMT3A的PWWP結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制DNMT3A，而在腫瘤發(fā)生時(shí)SALL3表達(dá)降低，導(dǎo)致抑制DNMT3A能力下降，DNMT3A活性增強(qiáng)后進(jìn)而抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前有關(guān)宮頸癌中SALL3及DNMT3A表達(dá)的研究較少。本研究觀察了宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA及甲基化SALL3基因表達(dá)情況，分析SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達(dá)的相關(guān)性及其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年12月～2018年12月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院診治的宮頸癌患者200例，患者年齡27～56歲，平均(42.9±7.1)歲，其中宮頸鱗癌161例、子宮腺癌39例，腫瘤高分化57例、中分化65例、低分化78例，腫瘤分期Ⅰ期112例、Ⅱ期88例[7]，淺肌層浸潤(rùn)81例、深肌層浸潤(rùn)119例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移117例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移83例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)宮頸活檢病理或術(shù)后病理檢查確診為宮頸癌；②均為初次診治，既往未接受其它抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整，患者及家屬均知情同意并已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它器官系統(tǒng)的惡性腫瘤；②合并急性感染性疾病，如上呼吸道感染等；③合并嚴(yán)重的臟器功能不全，如心功能衰竭、肝功能衰竭等。選取同期接受手術(shù)治療的子宮肌瘤患者40例，患者年齡34～56歲，平均(42.1±6.8)歲。本研究中，200例宮頸癌患者與40例子宮肌瘤患者年齡間無(wú)顯著差異(P>0.05)?；颊呔邮苁中g(shù)切除治療，宮頸癌患者術(shù)中留取宮頸癌組織，子宮肌瘤患者術(shù)中留取正常宮頸組織，留取的組織標(biāo)本迅速置于凍存管內(nèi)，液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存。

1.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA檢測(cè)方法 采用qRT-PCR法。取約30 mg組織標(biāo)本，TRIzol法提取總RNA，溶于80 μL無(wú)RNA酶的ddH2O中，核酸蛋白測(cè)定儀上檢測(cè)RNA濃度。以2 μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，總反應(yīng)體系為20 μL，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列如下：SALL3正向引物為5′-CCAATGTGTCGGTGTTCGAG-3′，反向引物為5′-CCGGGTAAGGGTTCATCTGG-3′；DNMT3A正向引物為5′-CCGATGCTGGGGACAAGAAT-3′，反向引物為5′-CCCGTCATCCACCAAGACAC-3′；內(nèi)參基因GAPDH正向引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物為3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均在ABI實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次。以2-ΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 宮頸癌組織及正常宮頸組織中甲基化SALL3基因表達(dá)觀察 應(yīng)用酚-氯仿法提取、純化組織DNA，實(shí)驗(yàn)步驟按照TaKaRa Mini DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。應(yīng)用亞硫酸氫鈉修飾提取的500 ng基因組DNA，以將DNA中尚未甲基化的胞嘧啶(C)修飾為尿嘧啶(U)，操作步驟按照EZ DNA Methylation-Gold Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，然后進(jìn)行甲基化特異PCR擴(kuò)增。引物序列如下：SALL3基因甲基化正向引物：5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTCGTC-3′,反向引物：5′-ATAACCTCCTAAAACTTCCCCGAA-3′；SALL3基因非甲基化正向引物：5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTTGTTG-3′,反向引物：5′-AAATAACCTCCTAAAACTTCCCCAAA-3′。PCR反應(yīng)體系根據(jù)PCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，程序?yàn)?5 ℃變性30 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸8 min，4 ℃保溫。PCR反應(yīng)結(jié)束后取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以去離子水為陰性對(duì)照，應(yīng)用成像分析系統(tǒng)照相，根據(jù)DNA條帶判斷結(jié)果。甲基化陽(yáng)性結(jié)果判斷方法：甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶；甲基化陰性結(jié)果判斷方法：甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶。用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算受檢標(biāo)本的甲基化條帶密度值，即為標(biāo)本的相對(duì)甲基化程度。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織與正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達(dá)比較 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.253±0.051、0.272±0.055，正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.050±0.062、0.093±0.016，兩者相比，P均<0.05。

2.2 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達(dá)的相關(guān)性 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.679，P=0.000)。

2.3 SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見(jiàn)表1。表1顯示，SALL3、DNMT3A mRNA表達(dá)與宮頸癌患者FIGO分期、分化程度有關(guān)(P均<0.05)。

2.4 宮頸癌組織及正常宮頸組織中甲基化SALL3基因比較 宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率為60.5%(121/200)，相對(duì)甲基化程度為1.72±0.61；正常宮頸組織中SALL3基因甲基化率為30.0%(12/40)，相對(duì)甲基化程度為0.26±0.07；兩者相比，P均<0.05。

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的最常見(jiàn)形式，通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控，參與各種分化發(fā)育、炎癥、自身免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究[8]表明，啟動(dòng)子區(qū)域特別是CpG島異常的DNA甲基化與許多癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌研究[9]中發(fā)現(xiàn)，β-環(huán)連蛋白抑制基因2(DACT2)為一種抑癌基因，其基因啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化的現(xiàn)象，DACT2表達(dá)降低可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展,而DNA高甲基化是DACT2的重要表達(dá)調(diào)控機(jī)制。此外，研究[10]發(fā)現(xiàn)，谷胱甘S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)保護(hù)細(xì)胞避免DNA損傷和癌細(xì)胞形成,GSTP1基因啟動(dòng)子甲基化可能造成GSTP1基因低表達(dá)，GSTP1活性降低導(dǎo)致DNA損傷的敏感性增強(qiáng)和癌變發(fā)生的概率增加。因此，腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化在致癌過(guò)程中起重要作用，研究宮頸癌中特異性基因甲基化具有重要意義。

表1 SALL3、DNMT3A mRNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

SALL3是SAL家族的成員，其參與人類多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程，該基因表達(dá)缺失患者表現(xiàn)為先天性心臟疾病、精神發(fā)育遲滯、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及肢體畸形等。近年來(lái)研究[11]表明，SALL3表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間關(guān)系密切，在肝細(xì)胞癌中，SALL3基因啟動(dòng)子被DNA甲基化修飾，SALL3高甲基化降低了肝細(xì)胞癌中SALL3的表達(dá)水平，SALL3的異常高甲基化有助于肝細(xì)胞癌的發(fā)生。本研究中，宮頸癌組織中SALL3基因表達(dá)在mRNA水平上明顯低于正常宮頸組織，表明宮頸癌組織中SALL基因表達(dá)降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中SALL3 mRNA表達(dá)與FIGO分期、腫瘤分化程度有關(guān)，F(xiàn)IGO分期越高、分化越低的癌組織中SALL3 mRNA相對(duì)表達(dá)量越低，表明SALL3 mRNA相對(duì)表達(dá)量能夠反映宮頸癌病情嚴(yán)重程度，有望成為新的腫瘤相關(guān)標(biāo)志物。我們認(rèn)為，其機(jī)制可能是隨著腫瘤進(jìn)展，腫瘤微環(huán)境中IL-7等細(xì)胞因子結(jié)合細(xì)胞表面的IL-7Rα，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄因子SALL3的表達(dá)[12]。此外，SALL基因啟動(dòng)子區(qū)域存在表觀遺傳學(xué)修飾的現(xiàn)象，也可降低SALL3基因表達(dá)。Yu等[13]在膀胱癌患者尿液中脫落的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SALL3富含CG的啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化，認(rèn)為SALL3可能是檢測(cè)膀胱癌的新型DNA甲基化標(biāo)記物。本研究進(jìn)一步檢測(cè)SALL3基因甲基化表達(dá)情況，結(jié)果顯示宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率及相對(duì)甲基化程度均顯著高于正常宮頸組織，表明SALL3基因的表觀遺傳學(xué)修飾可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，特別是腫瘤的早期階段，因而檢測(cè)SALL3基因甲基化情況有可能成為宮頸癌的早期診斷方法。目前SALL3基因異常高甲基化的機(jī)制尚不清楚，可能與HPV感染有關(guān)。有研究[14]報(bào)道，在宮頸癌SiHa、HeLa兩種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系中均存在SALL3基因啟動(dòng)子區(qū)域中高甲基化的現(xiàn)象，但在HPV陰性細(xì)胞系C33A中SALL3基因在啟動(dòng)子區(qū)域未出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，因而HPV的感染可能參與誘導(dǎo)SALL3基因甲基化，參與相關(guān)的致癌機(jī)制。

DNMT3A基因編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，是甲基化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，參與從頭甲基化過(guò)程，DNMT3A蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。有研究[15]表明，DNMT3A與異染色質(zhì)的組分相互作用，包括HP1、HDAC和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)中起重要作用。研究[16]發(fā)現(xiàn)，DNMT3A基因突變參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在25%的急性髓性白血病(AML)患者中常發(fā)生DNMT3A基因R882位點(diǎn)突變。本研究中，宮頸癌組織中DNMT3A在mRNA相對(duì)表達(dá)量上表達(dá)明顯高于正常宮頸組織，且宮頸癌組織中DNMT3A mRNA表達(dá)與FIGO分期、腫瘤分化程度有關(guān)，F(xiàn)IGO分期越高、分化越低的癌組織中DNMT3A mRNA相對(duì)表達(dá)量越高，提示宮頸癌組織中DNMT3A mRNA表達(dá)升高可能參與宮頸癌的病情發(fā)展。DNMT3A表達(dá)升高的機(jī)制尚不清楚，可能與宮頸癌組織中SALL3基因高甲基化后SALL3表達(dá)降低，導(dǎo)致SALL3對(duì)DNMT3A的抑制作用減弱，DNMT3A的表達(dá)上調(diào)后促進(jìn)抑癌基因的從頭甲基化，促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生[13]。本研究中，SALL3與DNMT3A mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，表明兩者可能存在相互作用，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，宮頸癌組織中SALL3 mRNA低表達(dá)、DNMT3A mRNA高表達(dá)，兩者負(fù)相關(guān)，SALL3、DNMT3A mRNA表達(dá)與宮頸癌FIGO分期、分化程度有關(guān)，兩者共同參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，有希望成為新的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物。宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率及相對(duì)甲基化程度升高，檢測(cè)甲基化SALL3基因情況有可能成為宮頸癌的早期診斷方法。