血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因素研究進展

胡艷紅，楊靜，修成奎，王雪，方靖漪，王佳麗，劉奕清，雷燕

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心/北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室，北京100700；2 廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院/廣東省代謝性疾病中西醫(yī)結(jié)合研究中心)

血管平滑肌細胞(VSMCs)是一種來自胚胎發(fā)育時期中胚層的多功能性間葉細胞，周圍由細胞外基質(zhì)包圍。VSMCs是大、中動脈中膜的主要組成部分，是保持血管壁的完整性以及維持血管張力的重要因素，可調(diào)節(jié)血壓、血流量。研究[1]顯示，VSMCs異常增殖和遷移造成的表型轉(zhuǎn)化在心腦血管疾病中起著關(guān)鍵作用，是動脈粥樣硬化、高血壓、心衰、腦梗和血管動脈瘤等疾病的重要病理過程之一。選擇適宜的誘導(dǎo)因素是探討VSMCs表型轉(zhuǎn)化的分子機制、研發(fā)相關(guān)血管保護作用藥物的重要支撐。VSMCs表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因素眾多，如氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、高糖、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)等，已被成功應(yīng)用于建立VSMCs表型轉(zhuǎn)化模型。但不同模型的分子機制和病理因素各不相同，本研究通過整理目前較常用的VSMCs表型轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因素，深入探討其分子機制，為以后靶向VSMCs的藥物篩選以及具有相關(guān)抑制作用的中草藥的研究和開發(fā)提供參考。

1 VSMCs表型

1989年，Baumbach等首次提出“血管重塑”，發(fā)現(xiàn)血管的病理生理過程不僅是血管壁形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，還有細胞的改變?nèi)鏥SMCs表型轉(zhuǎn)化，從此VSMCs表型轉(zhuǎn)化開始進入人們的視野[2]。與骨骼肌和心肌細胞不同，VSMCs是一種非終末分化的高度特異性細胞，其表型具有可調(diào)控性，通過分化或去分化可實現(xiàn)表型和功能的轉(zhuǎn)化。根據(jù)VSMCs形態(tài)、功能及細胞標(biāo)志蛋白的不同，VSMCs表型分為收縮表型(又叫分化表型)和合成表型(又叫去分化表型)兩種。生理狀態(tài)下，VSMCs處于分化程度較高的收縮表型，當(dāng)血管內(nèi)膜受損或VSMCs受到生長因子、機械作用、血管活性物質(zhì)等因素刺激時，VSMCs從收縮表型轉(zhuǎn)化為分化程度較低的合成表型，這一轉(zhuǎn)化過程被稱之為表型轉(zhuǎn)化。VSMCs表型轉(zhuǎn)化的過程十分復(fù)雜，機制尚未完全闡明清楚，現(xiàn)大量證據(jù)表明其受多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，如MAPK、PI3K/AKT、TGFβ/Smad、RhoA/Rock、Raf/MEK/ERK1/2以及cAMP/PKA通路等等。

1.1 收縮表型VSMCs 正常情況下，VSMCs分化為不同的細胞群并獲得具有成年特征的收縮表型，處于終末分化階段，是一種穩(wěn)定性表現(xiàn)。收縮表型VSMCs增殖、遷移活性較低，是保持血管的完整性及維持血管張力的重要因素，多出現(xiàn)在胚胎初期和正處于生長發(fā)育的器官。收縮表型VSMCs處于高分化狀態(tài)，一般呈紡錘形，長度變異較大，其胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的肌纖維，并可見致密體及致密斑，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體等細胞器較少，僅產(chǎn)生極微量的細胞外基質(zhì)，胞膜外環(huán)繞一層基底膜。收縮表型VSMCs有一些特異性標(biāo)志物，如平滑肌22α(SM22α)[3]、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)[4]、調(diào)寧蛋白1(CNN1)、平滑肌特異性蛋白(smoothelin)以及鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(caldesmon)等。血清應(yīng)答因子(SRF)是VSMCs收縮表型的主要調(diào)節(jié)因子，與MyoC、MRTF轉(zhuǎn)錄共激活因子一起負責(zé)維持VSMCs的收縮表型。此外，小G蛋白超家族的亞家族成員如RhoA，可增加MRTF的肌動蛋白依賴性核轉(zhuǎn)位，在調(diào)節(jié)VSMCs收縮表型中也發(fā)揮重要作用。

1.2 合成表型VSMCs 分化成熟后的VSMCs在血流動力學(xué)變化、血管活性物質(zhì)改變、炎性介質(zhì)和細胞因子等刺激下可以去分化，成為分化程度低的合成表型[5]。合成表型VSMCs形態(tài)上類似成纖維細胞，呈扁平形，主要表現(xiàn)為細胞體積增大、肌絲含量少、結(jié)構(gòu)蛋白少、收縮功能明顯減弱，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及游離核蛋白體等細胞器增多，并獲得異常增殖[6]、遷移[7]、凋亡的能力。合成表型VSMCs大量合成和分泌細胞外基質(zhì)如基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等活性物質(zhì)，促使內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，誘導(dǎo)血管炎性改變，可導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄、血管重構(gòu)、血管老化，進而引起終末器官血流灌注不足、功能異常甚至衰竭[8，9]。合成表型VSMCs主要位于胚胎中期血管或病理血管中，可表達一些成骨分化的標(biāo)記物，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、Runt-相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2(Runx2)、msh同源異型盒基因2(MSX-2)、堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)、骨保護素(OPG)、基質(zhì)Gla蛋白(MGP)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)、上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin)以及骨鈣素(OCN)等[10～12]。

2 VSMCs表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因素

2.1 ox-LDL ox-LDL是血漿中低密度脂蛋白被氧化后的產(chǎn)物。當(dāng)細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平升高，或者在二價過渡金屬陽離子存在的情況下，均會發(fā)生低密度脂蛋白(LDL)氧化。ox-LDL可損傷血管內(nèi)皮細胞，增加多種細胞黏附分子的表達，促進單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞的黏附、遷移和浸潤。研究[13]發(fā)現(xiàn)，ox-LDL通過清道夫受體被單核細胞等大量吞噬轉(zhuǎn)化成泡沫細胞，可增加斑塊粥樣脂質(zhì)含量，從而提高斑塊的不穩(wěn)定性；ox-LDL還可提高VSMCs內(nèi)ROS的水平，降低超氧化物歧化酶(SOD)活性，刺激VSMCs增殖及向內(nèi)膜遷移，促進細胞成骨樣分化和鈣化，從而干擾其表型，是導(dǎo)致動脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病發(fā)生的重要因素。研究[14]顯示，ox-LDL可以濃度依賴性方式增加核心結(jié)合因子a1(CBFA1)mRNA表達，降低SM22α mRNA表達，增加茜素紅S染色，促進VSMCs的鈣化，加速VSMCs表型轉(zhuǎn)化；可通過增加骨相關(guān)蛋白mRNA表達，降低VSMCs中收縮蛋白的表達，刺激NK-κB p65的核轉(zhuǎn)位，促進VSMCs表型轉(zhuǎn)化；ox-LDL還可使MMP-2和MMP-9合成增加，上調(diào)pERK1/2表達，促使VSMCs遷移并向合成表型轉(zhuǎn)化；ox-LDL可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)途徑，降低miR-148b表達，干擾其表型[15]；ox-LDL可通過干擾細胞周期，增加S期VSMCs百分比，降低G1和G2期細胞百分比，下調(diào)Wnt、β-連環(huán)蛋白和細胞周期蛋白D1的蛋白表達水平，促進VSMCs增殖和遷移，誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化[16]。最近，也有研究[17]發(fā)現(xiàn)，p38、ERK1/2/MAPK和核因子κB(NF-κB)等信號通路的激活，也影響細胞周期，還可調(diào)節(jié)增殖細胞核抗原(PCNA)和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達，參與ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

2.2 高糖 在糖尿病患者中，長期高糖血癥是導(dǎo)致心腦血管并發(fā)癥發(fā)生、危害人體健康的重要因素，其中VSMCs表型轉(zhuǎn)化是糖尿病心腦血管并發(fā)癥的重要細胞生物學(xué)基礎(chǔ)。長期高血糖除可引起內(nèi)皮損傷、血小板黏附，導(dǎo)致血栓形成外，受損處也可聚集大量炎性細胞，從而釋放大量炎性因子，刺激VSMCs出現(xiàn)異質(zhì)性變化，發(fā)生增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化與分泌性改變，合成釋放大量細胞基質(zhì)，促使血管功能失調(diào)與血管炎性改變，最終可導(dǎo)致動脈粥樣硬化等血管性疾病的發(fā)生。VSMCs表型轉(zhuǎn)化的機理非常復(fù)雜，多種生長因子和細胞因子以旁分泌/自分泌的方式參與了此過程，促進VSMCs增殖，進一步促進VSMCs表型由收縮表型轉(zhuǎn)為合成表型，形成一個復(fù)雜的因子網(wǎng)絡(luò)。高糖可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，影響VSMCs的功能，誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化。比如激活PKC、STAT3/Pim-1信號通路[18]；促使p38MAPK/JNK ERK磷酸化，提高SOD和丙二醛(MDA)水平，促使ROS大量產(chǎn)生，引起VSMCs過度增殖和遷移[19]；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運蛋白(TSPO)高表達，加速VSMCs增殖和遷移，干擾細胞表型；通過促使多功能蛋白聚糖(VCAN)大量產(chǎn)生，調(diào)節(jié)線粒體膜電位或線粒體功能，也可顯著增加乳酸脫氫酶(LDH)活性以及MDA含量，刺激VSMCs氧化應(yīng)激[20]，導(dǎo)致VSMCs表型轉(zhuǎn)化，加速血管鈣化、衰老；激活ROCK1通路，促使miR-145表達逐漸減少，增殖、遷移逐漸增多，干擾VSMCs表型分化；增加瞬時受體電位M7(TRPM7)蛋白表達和TRPM7全細胞電流，并通過活性氧-TRPM7-ERK1/2軸影響VSMCs分化標(biāo)志物如α-SMA、SM22α和OPN的蛋白表達；和牙齦卟啉單胞菌一起作用于人主動脈血管平滑肌細胞(HASMCs)[21]，可上調(diào)由toll樣受體4和ERK1/2-p38信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的骨形成蛋白-4(BMP4)的表達，繼而通過自分泌作用繼續(xù)上調(diào)骨形成蛋白-4(BMP4)特異性下游smad1/5/8-runx2信號傳導(dǎo)，增加骨相關(guān)基質(zhì)蛋白的表達，促使HASMCs表型轉(zhuǎn)化，加速血管鈣化；激活通路如Ras/Raf/MEK/MAPK、NADPH氧化酶途徑[22]介導(dǎo)ROS產(chǎn)生。相較于持續(xù)性高糖，波動性高糖更能增強MMP-2活性、OPN的表達，干預(yù)細胞周期，對caspase-3等凋亡蛋白加以調(diào)控，促進VSMCs不斷增殖，逐漸誘導(dǎo)其進入表型轉(zhuǎn)化狀態(tài)。

2.3 Ang Ⅱ Ang Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中的主要活性物質(zhì)，生理條件下可以維持血管管壁緊張度來穩(wěn)定血壓，也可以刺激醛固酮的合成和分泌，維持水電質(zhì)平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但Ang Ⅱ的異常增高參與了高血壓、動脈粥樣硬化、血管纖維化、血管狹窄等的病理進程，Ang Ⅱ可以誘導(dǎo)血管平滑肌細胞的炎癥、遷移、增殖、細胞外基質(zhì)合成，使細胞從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚汀ng Ⅱ與Ang Ⅱ 1型受體(AT1R)結(jié)合后，可進一步激活下游通路如Wnt4/DVL-1/β-catenin導(dǎo)致VSMCs表型發(fā)生改變，從而促進VSMCs的增殖、分泌及遷移活性。Ang Ⅱ還可作為一種生長因子，降低抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2(PRMT2)的mRNA和蛋白水平，誘導(dǎo)其他促炎性細胞因子如IL-6和IL-1β的表達，為Ang Ⅱ介導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化提供了一種新機制。Ang Ⅱ通過多種途徑誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化：通過AT1R/RhoA/Rho激酶依賴性機制，增加Beclin-1、Vps34、Atg-12-Atg5、Atg4和Atg7蛋白水平，減少α-SMA表達[23]；激活RhoA/ROCK通路，誘導(dǎo)F-肌動蛋白細胞骨架重塑[24]；通過Ca2+內(nèi)流介導(dǎo)的Pyk2-ERK1/2-Elk-1途徑，提高TRPM7的表達，降低收縮標(biāo)志物SM22α的表達，誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化；激活JAK/STAT3通路，通過干擾細胞周期，促進增殖和遷移；通過增加線粒體氧化應(yīng)激介導(dǎo)線粒體功能障礙，刺激酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(Nox1)激活，最終導(dǎo)致VSMCs表型轉(zhuǎn)化，加速細胞衰老；通過調(diào)節(jié)Rac1激活和Nox1表達促進二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)的激活，也可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，從而激活MAPK(Erk1/2、p38和Jnk)途徑，干擾血管表型。

2.4 AGEs AGEs是指多種大分子(蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸等)經(jīng)非酶性糖基化反應(yīng)，自發(fā)地與還原單糖作用形成穩(wěn)定且不可逆的非均質(zhì)分子復(fù)合物，是過量的糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物。生理狀態(tài)下，人體內(nèi)AGEs的表達量很低，而糖尿病患者由于機體長期處于高血糖狀態(tài)，促使非酶性糖基化反應(yīng)加快，導(dǎo)致AGEs的生成異常增多，現(xiàn)已成為誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化、加速血管老化的重要因素。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)是一種介于細胞膜與細胞質(zhì)之間的跨膜蛋白。已有研究[25]證實，AGEs可以通過配體-受體結(jié)合方式結(jié)合細胞膜上的RAGE，激活下游wnt/β-catenin、NF-κB、cdc42/rac、JAK/Stat、ERK1/2和p38 MAPK信號通路，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促使VSMCs增殖、遷移，干擾VSMCs的收縮表型，是研究糖尿病相關(guān)血管性疾病的重要機制。AGEs作用于VSMCs，可上調(diào)細胞表面NOX1、NOX4、p22phox、p67phox、LRP1、CD36、RAGE等的表達，誘導(dǎo)細胞促氧化和炎性產(chǎn)生，促使VSMCs增殖；通過HIF-1α/PDK4途徑，可促使堿性磷酸酶(ALP)和RUNX2活性增強，誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化，是改變VSMCs中葡萄糖代謝的新機制。

2.5 TNF-α 血管中的內(nèi)皮細胞受損時，可釋放大量的炎性因子，引起VSMCs增殖、遷移，誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)化，最終形成動脈粥樣硬化。其中TNF-α作為一種重要的前炎性細胞因子，主要由巨噬細胞產(chǎn)生，由細胞表面模式識別分子受體(如Toll樣受體)結(jié)合模式識別分子(如LPS)介導(dǎo)產(chǎn)生，能活化中性粒細胞和單核細胞，從而促進血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子、炎癥遞質(zhì)等多種生物學(xué)活性。TNF-α與VSMCs表面上的受體相結(jié)合可刺激血小板源性生長因子(PDGF)分泌，促使VSMCs增生導(dǎo)致內(nèi)膜增生。TNF-α可提高VSMCs中VCAM-1表達以及單核細胞黏附，刺激MAPK磷酸化和NK-κB活化，增加IL-6和IL-8水平，導(dǎo)致VSMCs表型轉(zhuǎn)化和血管炎癥，加速動脈粥樣硬化[26]。TNF-α可通過NF-κB介導(dǎo)的Syndecan-4的基因和蛋白表達，激活syndecan-4/FGF-2/TGFβ信號軸促進VSMCs增殖、遷移，加速其表型轉(zhuǎn)化。TNF-α刺激VSMCs可顯著增強Krüppel樣因子5(KLF5)啟動子的活性以及mRNA水平，并下調(diào)SM22α和α-SMA的表達，而KLF5過表達可減弱SM22α和α-SMA的下調(diào)，提示TNF-α依賴的KLF5誘導(dǎo)可能在VSMCs的表型調(diào)節(jié)中起重要作用。此外，TNF-α可通過激活p44/42 MAPK誘導(dǎo)VSMCs增殖、遷移；激活PI3Kγ/p-Akt通路，下調(diào)VSMCs收縮基因的表達；還可以通過影響血小板衍生生長因子受體β(PDGFRβ)、ERK1/2和Akt磷酸化，誘導(dǎo)VSMCs向膠原蛋白遷移，加速血管損傷。

2.6 PDGF-BB PDGF是由Ross于1973年在血小板α顆粒中發(fā)現(xiàn)并純化出來，是血管損傷處的巨噬細胞和血小板等釋放的強效細胞因子，是一種重要的促分裂劑[27]。PDGF是由A、B鏈聚合而成3種構(gòu)型的二聚體，即PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB，起到強有絲分裂原和化學(xué)趨化劑的作用，使VSMCs、成纖維細胞、膠質(zhì)細胞和巨噬細胞表達高親和性受體。其中，PDGF-BB在正常血管中無表達，但在動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等引起內(nèi)皮細胞損傷后則明顯上調(diào)，對干擾VSMCs表型轉(zhuǎn)化、血管重構(gòu)起著非常重要的作用。研究[28]發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB可從多種途徑誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化，如產(chǎn)生大量ROS，促使ERK1/2、蛋白激酶B(Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)或JAK2ERK磷酸化增加，使G1期細胞周期停滯，降低SM22α、α-SMA的表達，上調(diào)OPN表達，導(dǎo)致F-肌動蛋白的結(jié)構(gòu)紊亂、不規(guī)則，誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化。PDGF-BB還可刺激LncRNA CRNDE高表達，下調(diào)SM-MHC和α-actin蛋白表達，促使VSMCs增殖和遷移，以干擾VSMCs表型轉(zhuǎn)化。研究[29]顯示，PDGF-BB可誘導(dǎo)miR-26a表達顯著增加，靶向Smad1通過BMP/TGF-β途徑，調(diào)節(jié)VSMCs表型分化標(biāo)志物基因如α-SMA、SM-MHC和鈣調(diào)蛋白的表達。研究[30]顯示，PDGF-BB可顯著下調(diào)miR-320的表達，通過靶向NRP1調(diào)節(jié)VSMCs的增殖和遷移。研究[31]表明，PDGF-BB可通過上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、MMP-9、細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E下調(diào)p27KIP1蛋白表達，刺激VSMCs增殖和遷移，還可誘導(dǎo)黏著斑激酶(FAK)和Src激酶的磷酸化，促使氧化應(yīng)激的發(fā)生，導(dǎo)致線粒體功能障礙，擾亂VSMCs表型。最新研究[32]發(fā)現(xiàn)，miR-1181在大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)中可被PDGF-BB顯著下調(diào)，通過靶向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)影響細胞周期從G0/G1向S期的轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)PASMC的過度增殖，是導(dǎo)致肺動脈高壓發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。

綜上所述，VSMCs表型轉(zhuǎn)化是一個受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程，ox-LDL、高糖、Ang Ⅱ、AGEs、TNF-α、PDGF-BB等因素可誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化。VSMCs表型轉(zhuǎn)化的機制十分復(fù)雜，各種信號通路相互交叉，但目前對其研究尚不是十分明確，且整體動物實驗方面缺乏相應(yīng)的研究數(shù)據(jù)。中藥在心腦血管疾病的防治取得一定療效，如中藥復(fù)方益氣活血湯、補陽還五湯、麝香保心丸，單味中藥黃芪、當(dāng)歸、紅花、郁金，中藥有效組分大豆異黃酮、粉防己堿、甲基蓮心堿、絞股藍總苷、吳茱萸次堿等在抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化方面已得到國內(nèi)學(xué)者越來越多的認識及深入研究。但中藥也由于其成分復(fù)雜及不良反應(yīng)，致使作用機制難以明確，質(zhì)量難以控制，限制了其在臨床上的大量推廣。這就要求我們要加大對VSMCs表型轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因素的探索，從而加強中藥在治療心腦血管疾病動物模型上的相關(guān)研究深度，填補體內(nèi)或臨床試驗空白。從而更加準(zhǔn)確地研發(fā)相關(guān)的候選藥物，最終為心腦血管系統(tǒng)疾病提供新的治療手段。