肺泡灌洗液高通量測序檢測在肺部疾病診療中的作用研究進展*

付 慧,陳 鵬,龐健健

1.西安醫(yī)學院基礎醫(yī)學部生化與分子教研室(西安 710021)；2.西安市胸科醫(yī)院肺結(jié)核二科(西安 710100)

肺部疾病以肺部感染性疾病及肺癌常見。肺部感染指包括終末氣道、肺泡腔及肺間質(zhì)在內(nèi)的肺實質(zhì)炎癥，肺部感染一直位于各類感染的首位,急性呼吸道感染造成的死亡人數(shù)為總疾病造成死亡數(shù)的第3位。病因以細菌及病毒感染最為常見(80%)，還可由理化、免疫及藥物引起。病原體診斷是治療方案的基礎，預后判斷的依據(jù)。資料顯示，50%的肺癌患者確診時已進展至晚期。對肺癌患者采取早期診斷及治療不僅有助于提高生存率，在改善患者的預后方面也有積極作用。肺癌確診常通過細胞學與病理組織學，但標本獲取的難度大。

在支氣管鏡應用的基礎上發(fā)展起來的支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)技術(shù)可以獲得氣管鏡所不能探及的下氣道的細胞和溶質(zhì)，能更全面的反映肺部的整體情況，有“液性肺活檢”之稱[1]?；诟咄繙y序的支氣管肺泡灌洗液的研究可以準確全面地反應下呼吸道微生物群的存在，對肺部感染的診斷具有重要的意義，而檢測支氣管肺泡灌洗液腫瘤標志物成為了肺癌輔助診斷的關(guān)鍵措施。

高通量測序(High-throughput sequencing)或深度測序(Deep sequencing)，通量高是其技術(shù)最大的特征，同時測定幾百萬甚至上億條DNA或者RNA序列，大大加快了宏基因組測序的速度，從而可以極大地降低單個堿基測序的成本，又稱之為下一代測序(NGS)[2]。大量科研工作表示，基于16S擴增子及微生物的全基因組測序，在診斷病原微生物方面，具有快速、不用培養(yǎng)的優(yōu)點，并在腫瘤相關(guān)DNA與RNA的檢測方面也有著其他基因?qū)W手段無法比擬的優(yōu)勢。

近年來，應用高通量測序檢測BALF在肺部疾病的診斷與治療方面有突破性的應用。

1 明確正常肺部菌群及各種肺部疾病的微生物群

由于檢測技術(shù)的受限，人們長久以來以為肺部是無菌環(huán)境。最近，使用新的與培養(yǎng)無關(guān)的基于NGS的微生物鑒定技術(shù)已經(jīng)證實，在健康和疾病狀態(tài)，肺部具有不同的微生物群落。這一啟示挑戰(zhàn)了許多關(guān)于呼吸系統(tǒng)健康以及傳染性和非傳染性肺病發(fā)病機制的假設。人們認識到呼吸道是一個動態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，它為肺微生物學領域注入了新的假設和疾病發(fā)病機制的新模型概念。

基于大量的NGS檢測的結(jié)果，上呼吸道有大量厭氧菌和好氧菌定植 。在使用NGS技術(shù)分析來自健康成人的BALF中的細菌后顯示，肺中最常見的細菌門是擬桿菌、厚壁菌和變形桿菌。肺中的優(yōu)勢屬包括普氏菌、韋氏菌、假單胞菌、梭桿菌和鏈球菌[3]。通過分析口腔清洗液、BALF、鼻拭子和胃吸出物樣品中微生物群的組成，發(fā)現(xiàn)呼吸道含有均勻的微生物群，從上呼吸道到下呼吸道的生物量逐漸減少。肺部微生物群更接近口腔和鼻拭子微生物群，提示肺部微生物群可能通過呼吸來自上呼吸道[4]。尚未確定健康受試者的肺微生物組在地理上是否有變化。一項分析來自美國8個城市的健康受試者的肺微生物群的研究未發(fā)現(xiàn)地理聚類的證據(jù)，英國志愿者中檢測到的最豐富的微生物群落與健康的美國受試者相似。

隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，肺微生物組的發(fā)現(xiàn)顛覆了我們對肺炎發(fā)病機制的理解。肺炎不是反映病原體對無菌空間的侵襲，而是一種微生物多樣性和豐度的變化，人們對患病肺部的微生物組及其與疾病的關(guān)系也有了更加深刻的理解。

許多關(guān)于哮喘患者的研究已經(jīng)確定患者肺部微生物群的組成與健康對照不同[5]。哮喘患者中部分存在慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，即使患有輕微疾病也可檢測到氣道微生物群的改變，一旦COPD嚴重程度提高，氣道微生物群就會持續(xù)改變[6]。大多數(shù)對晚期COPD患者的研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道微生物組從擬桿菌門常常變?yōu)樽冃尉T，如假單胞菌、嗜血桿菌等。高豐度的變形菌和較高豐度的擬桿菌，可能是該疾病的準確預測因子。特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性致死性重塑肺病，其特征在于肺功能的進行性下降。有許多證據(jù)支持IPF的病因和進展與肺微生物群和細菌感染的變化有關(guān)[7]。與對照組相比，在IPF患者的BALF中可檢測到細菌負荷增加，并且在人和小鼠模型中發(fā)現(xiàn)鏈球菌、肺炎球菌或葡萄球菌分類群的豐度相對增加[8]。最近的兩項研究表明，肺微生物組與IPF預后之間存在關(guān)聯(lián)，觀察到特定微生物群落成員(葡萄球菌屬和鏈球菌屬)的相對豐度與疾病進展之間的正相關(guān)。發(fā)現(xiàn)BALF中的總細菌負荷與病死率呈正相關(guān)，高細菌負荷與6個月的肺功能下降的風險增加相關(guān)，這是目前IPF的預后標準之一。肺囊性纖維化(Cysticfibrosis，CF)是一種遺傳性疾病。肺部CF綜合征表現(xiàn)為支氣管擴張和阻塞性肺病的逐漸發(fā)展。肺微生物群與CF的發(fā)病機制之間的關(guān)系仍存在爭議。但在臨床穩(wěn)定性和急性加重期間，幾乎所有年輕CF患者的肺中都可以檢測到特定的呼吸道病原體，如金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。因此，CF的惡化一直被認為是細菌感染的結(jié)果。Edith T.Zemanick等用16S測序的方法從13個CF中心檢查了191個BALF樣本，其中傳統(tǒng)的CF分類群(例如假單胞菌、葡萄球菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌)占優(yōu)勢[9]。Lee等對肺癌患者和良性腫塊樣病變患者的BALF中微生物組進行了表征和比較，Veillonella屬和Megasphaera屬顯示出作為預測肺癌的生物標志物的潛力[10]。

2 確定肺部疾病的特殊病原菌

除了確定微生物構(gòu)成外，高通量測序在病原菌檢測方面有以下優(yōu)勢與應用：不用培養(yǎng)可以通過DNA的檢測快速協(xié)助臨床明確病原體；發(fā)現(xiàn)新的病原體；獲得更多病原體信息；宏基因組測序可以精確到菌種的水平。除此之外，可以對毒力及耐藥進行預測；實現(xiàn)對病原體的定量研究等。已經(jīng)有大量肺部感染病例基于NGS的方法檢測BALF明確致病菌并指導治療。

劉金榮等回顧性分析675例兒童期難治性肺炎支原體肺炎兒童的病歷，分別用傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和下一代測序(NGS)檢測675例患者和18例患者的支氣管肺泡灌洗液中的細菌，NGS結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果一致[11]。侵襲性肺曲霉病(IPA)是一種嚴重的傳染病，病死率很高。然而，IPA的臨床診斷很困難，因為很難獲得微生物學證據(jù)。賀醫(yī)生報導利用NGS(BGISEQ-500/100測序平臺)的方法，檢測3例侵襲性肺曲霉病患者的BALF，檢測出煙曲霉的DNA。這3例病例的臨床試驗均為陰性，因此強烈建議NGS可以作為替代診斷方法或補充方法，以幫助臨床醫(yī)生做出適當?shù)臎Q定[12]。Ricna等報道使用靶向不同真菌rDNA區(qū)域的兩種方法，并且直接或在克隆后對獲得的PCR產(chǎn)物進行測序?？偣矞y試了104例患者的106個BALF樣本，結(jié)果顯示直接測序法具有優(yōu)越性[13]。黃等利用NGS技術(shù)對 2 例可疑肺結(jié)核病及肺非結(jié)核分枝桿菌病的肺部感染患者進行明確診斷[14]。除了診斷細菌之外，在病毒的診斷方面，NGS也具有自己的優(yōu)勢。浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院普通重癥監(jiān)護室的魏等人報告了首例通過下一代支氣管肺泡灌洗液測序檢測到的急性造血功能衰竭患者的肺部皰疹病毒的病例。入院時收集的用于細菌培養(yǎng)的血液和痰樣品顯示在2 d后沒有細菌生長。采用NGS作為輔助診斷方法，最終該患者被診斷患有侵襲性肺皰疹病(Sapiospermum)和急性造血功能衰竭[15]。2018年有人報道，1例22歲的男子逐漸出現(xiàn)發(fā)燒，咳嗽，下肢無力，黃疸和皮疹，為期3個月的臨床全面檢查未能得出診斷結(jié)果。入院后，實驗室和放射學檢查顯示患者的大腦、脊髓和肺部有多處病變。對患者的皮膚組織、骨髓、血液和腦脊液進行了NGS，這些測序均鑒定出大量的馬爾尼菲氏鐵桿菌核苷酸序列，從而進行了診斷和治療[16]。及早明確感染微生物，對治療有更積極的意義。邢等對重癥監(jiān)護室120例重癥下呼吸道感染患者進行分析,將患者分成實驗組和常規(guī)組各60例患者,常規(guī)組采用美羅培南降階梯經(jīng)驗性廣譜抗菌治療,實驗組采用NGS技術(shù)測定BALF和痰液明確病原微生物后選用相應的抗菌藥物進行治療。對比兩組治療效果、不良反應發(fā)生情況。結(jié)果顯示，實驗組治療效果明顯好于常規(guī)組，實驗組不良反應發(fā)生率顯著低于常規(guī)組。綜上，在重癥下呼吸道感染病例治療中采用NGS技術(shù),可以及早明確病原，指導抗菌藥物應用，降低耐藥菌株的耐藥性。

3 檢測BALF中的非編碼RNA用來協(xié)助診斷疾病及判斷疾病的發(fā)生發(fā)展

最近的許多證據(jù)表明miRNA和lncRNA在調(diào)節(jié)肺發(fā)育并維持平衡起重要作用。在小鼠和人肺發(fā)育期間，已經(jīng) 觀察到miRNA表達的廣泛變化。還已知miRNA和lncRNA表達模式在病理狀態(tài)中改變，例如肺癌、肺部炎癥和各種肺病。

RNA可以容易地從肺組織中提取，例如活組織檢查或刷洗，并且在BALF中RNA也以相對高的濃度存在。 Weber JA等檢測了12種液體中miRNA的光譜：血漿、唾液、淚液、尿液、羊水、初乳、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液、腹膜液、胸膜液和來自正常人的精液，確定在BALF中，能檢測出高濃度的microRNA[17]。

有人鑒定與IPF相關(guān)的microRNA生物標志物，來自BALF外泌體中microRNA的表達模式評估了老年IPF患者的情況。使用NGS檢測microRNA的表達，結(jié)果表明miR-125b、miR-128、miR-21、miR-100、miR-140-3p和miR-374b在IPF患者中上調(diào)，而let-7d、 miR-103、miR-26和miR-30a-5p下調(diào)。進一步檢測miR-30a-5p的表達水平，發(fā)現(xiàn)BALF中miR-30a的表達降低,其靶基因所表達的蛋白TAB3增加可能是IPF進展的關(guān)鍵因素[18]。王梓等對寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院重癥醫(yī)學科收治的30例重癥肺炎患者和10例需要機械通氣的非呼吸道感染患者，收集BALF標本。在兩組的患者進行的miRNA篩選,發(fā)現(xiàn)BALF中的 miR-127-5p 可用作診斷重癥肺炎的新生物標志物。甲型流感病毒能引起嚴重的呼吸道感染和肺泡上皮損傷，導致急性呼吸窘迫綜合征。Nicoletta Scheller等的實驗顯示細胞外囊泡(Extracellular vesicles，EV)通過miRNA的轉(zhuǎn)移介導炎癥。Scheller等發(fā)現(xiàn)甲流誘導的呼吸窘迫綜合征患者的支氣管肺泡灌洗液中EV的miRNA組成發(fā)生了顯著變化。在9種顯著失調(diào)的microRNA中，miR-17-5p在患者的BALF和IAV感染的肺上皮細胞(A549)的EV中上調(diào)。在這些細胞中，miR-17-5p的轉(zhuǎn)移強烈下調(diào)抗病毒因子Mx1的表達并顯著增強IAV復制[19]。H Burke等從14名健康戒煙者和17例年齡匹配的輕度至中度COPD患者中分離出BALF，使用Illumina Next Seq500對EV miRNA進行測序，發(fā)現(xiàn)miRNA靶向基因是促炎癥和凋亡途徑的核心基因。通過遞送包裝在EV中的差異表達的miRNA，AEC與肺泡巨噬細胞之間存在新的相互作用[20]。 除此之外,黃等使用支氣管刷標本中的microRNAs，還能區(qū)分小細胞肺癌和非小細胞肺癌，以及進一步區(qū)分鱗狀細胞癌和腺癌。

以上研究很多都是基于RNA-seq的方法。RNA-seq是一種相對較新的轉(zhuǎn)錄組學方法，依賴于下一代測序(NGS)技術(shù)，NGS在檢測ncRNA檢測方面的主要優(yōu)點是不需要先前對靶ncRNA 的了解，也不要特異性引物或探針。一些制造商提供具有不同技術(shù)的高通量NGS平臺。基于NGS的RNA-seq目前是miRNA和lncRNA檢測的最佳平臺。通過單核苷酸分辨率，RNA-seq在全基因組范圍內(nèi)工作，可以精確鑒定和定量RNA。與基于探針的微陣列相比，RNA-seq具有更大的動態(tài)范圍(可能無限， 取決于足夠的測序深度)，并提供檢測具有非常低表達的轉(zhuǎn)錄物的能力[21]。然而，這種方法確實受到一些限制。它相對昂貴，并且下游數(shù)據(jù)分析非常重要。

4 檢測BALF中的cfDNA

宮等評估了BALF在肺癌液體活檢中的潛在用途。納入56例肺癌患者，收集57個BALF(分離的上清液和沉淀物)樣品和56個外周血淋巴細胞樣品，獲得57個福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織。在匹配的組織DNA，BALF上清液cfDNA和BALF沉淀DNA中使用NGS檢測1021個基因，鑒定白細胞DNA作為體細胞突變的對照。總共在腫瘤樣本中鑒定出195個突變，其中在匹配的BALF沉淀樣品中檢測到147個(75.4%)突變，在匹配的BALF上清液樣品中檢測到168個(86.1%)突變，在三種類型的樣品中共享145個(74.4%)的突變。計算腫瘤突變負荷，組織與BALF沉淀物之間的一致性為90%，組織與BALF上清液之間的一致性為94%[22]。作者認為，使用BALF進行液體活檢對分析肺癌患者的基因遺傳改變具有較高的潛力，可實施并標準化應用。腫瘤細胞將大量EV釋放到含有生物活性分子(包括DNA、RNA和蛋白質(zhì))的體液中。與使用cfDNA相比，使用BALF EV DNA的液體活檢是組織特異性的并且極其敏感。在Hur等人最近的一項研究中。通過液體活檢，從血漿和BALF中分離的EV用于對EGFR狀態(tài)進行基因分型，與cfDNA分析相比，具有更高的準確性，表現(xiàn)出更高的特異性和靈敏度[23]。此外，與用于檢測對EGFR-TKI產(chǎn)生抗性的患者中的p.T790 M突變的組織重新檢測相比，使用BALF EV DNA還表現(xiàn)出更高的效率。這些發(fā)現(xiàn)表明使用EV DNA進行液體活檢的可能會取代目前的診斷方法，從而獲得更準確、更便宜和更快速的結(jié)果。

隨著測序技術(shù)的提高及成本的降低，NGS大量被應用于實驗室及臨床中。BALF來源于支氣管，能反映肺部健康及疾病的狀態(tài)，使用NGS技術(shù)檢測BALF中的DNA及RNA，所需時間短，可以反復取材，可以用來診斷、評估、預測肺部疾病，包括各類型感染性疾病及肺部腫瘤。為臨床診療提供了新的實用性的技術(shù)。