• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    致病菌金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌代謝產(chǎn)物及菌體成分對(duì)人呼吸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響

    2019-02-12 07:05:28秦嘯峰楊義然杜曉楠
    關(guān)鍵詞:菌體培養(yǎng)基細(xì)菌

    張 鑫,秦嘯峰,黃 瓊,楊義然,杜曉楠,李 琴,呂 喆,陳 彥,王 煒,孫 英

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)與肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia,S.pneumonia)為呼吸道常見(jiàn)定植菌和條件致病菌。當(dāng)機(jī)體免疫功能出現(xiàn)異常時(shí),兩種細(xì)菌的多種致病成分可突破機(jī)體免疫防御第一道防線進(jìn)而誘發(fā)多種呼吸道常見(jiàn)疾病,如慢性鼻-鼻竇炎、肺炎等疾病的發(fā)生[1-4]。

    上皮細(xì)胞是發(fā)揮機(jī)體黏膜免疫防御功能的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞,其中肺泡上皮細(xì)胞是細(xì)菌等病原微生物感染肺部時(shí)最主要的靶細(xì)胞,其在接受細(xì)菌不同成分刺激后表現(xiàn)出不同程度的損傷及損傷后效應(yīng),包括緊密連接的破壞、炎癥因子分泌的增加、趨化因子、抗菌肽的釋放等[5],進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,在肺部病原微生物的清除中發(fā)揮重要作用。

    本研究以人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)為研究對(duì)象,探討S.aureus與S.pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞、細(xì)菌來(lái)源:人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞), 金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)于美國(guó)ATCC官網(wǎng),2種菌株編號(hào)分別為ATCC29213、ATCC49619。

    1.1.2 金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌細(xì)菌培養(yǎng)上清、細(xì)菌裂解物及滅活菌體的制備:于生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室將金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株按照要求進(jìn)行復(fù)蘇,鑒定后挑取單個(gè)典型菌落于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~16 h(肺炎鏈球菌需培養(yǎng)24~36 h),隨后按照1∶100~1∶200的體積比將兩種細(xì)菌分別轉(zhuǎn)接至500 ml新鮮培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。金黃色葡萄球菌經(jīng)14~16 h,肺炎鏈球菌經(jīng)24~36 h的培養(yǎng)后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,通過(guò)平板接種法計(jì)算菌落形成單位(colony forming unit,CFU)。利用空白細(xì)菌培養(yǎng)基將兩種細(xì)菌的CFU調(diào)至相同數(shù)量(1×109CFU/ml)后12 000 rpm離心20 min收集兩種細(xì)菌的培養(yǎng)上清;一部分細(xì)菌沉淀經(jīng)0.1%甲醛重懸,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行滅活處理,去甲醛殘液后離心獲得細(xì)菌滅活菌體;另一部分菌體沉淀采用含蛋白酶抑制劑的PBS溶液重懸,采用超聲破碎的方法獲得兩種細(xì)菌裂解物并經(jīng)過(guò)BCA方法對(duì)其中的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。

    1.2 主要試劑與儀器

    1.2.1 試劑:CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本同仁公司;ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京四正柏生物科技有限公司;人源IL-6、IL-8 ELISA試劑盒、Claudin1兔多克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)abcam公司;ZO-1兔多克隆抗體,Occludin鼠單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;山羊抗小鼠熒光二抗(488-)、山羊抗兔熒光二抗(594-)、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗購(gòu)于北京中杉金橋公司。

    1.2.2 儀器:全波長(zhǎng)光吸收酶標(biāo)儀購(gòu)于PerkinElmer公司;流式細(xì)胞儀BD LSRFortessaTM購(gòu)于BD Biosciences公司;電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀購(gòu)于Bio-Rad公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司;臺(tái)式高速低溫離心機(jī) 購(gòu)自Beckman Coulter公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與刺激:A549細(xì)胞參照說(shuō)明書(shū)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中,置于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合率約80%時(shí)使用0.25%胰酶進(jìn)行細(xì)胞的消化及傳代接種操作。

    將細(xì)胞分別接種至12孔、24孔、96孔培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)60%時(shí),更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12~16 h后,細(xì)胞融合率達(dá)80%, 更換含兩種細(xì)菌不同成分的完全培養(yǎng)基對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行刺激,觀察不同刺激物對(duì)其炎癥細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞凋亡與壞死、細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)以及細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)一共分為7個(gè)組別:S.aureus/S.pneumonia培養(yǎng)上清刺激組(刺激用細(xì)菌培養(yǎng)上清量:DMEM培養(yǎng)基1∶5)、兩種細(xì)菌裂解物刺激組(裂解物刺激濃度:20 μg/ml)、兩種細(xì)菌滅活菌體刺激組(菌體刺激量:1×107CFU/ml)以及陰性對(duì)照組(無(wú)額外刺激物)。

    1.3.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:各組細(xì)胞按照1.3.1方法于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行刺激培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl CCK8檢測(cè)液,將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h后,于全波長(zhǎng)光吸收酶標(biāo)檢測(cè)儀中測(cè)定各反應(yīng)孔在450 nm處的吸光度。

    1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死:各組細(xì)胞按照1.3.1方法于12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行刺激培養(yǎng)24 h后,使用0.25%的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化,預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后,利用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入Annexin V-FITC和PI混合后,室溫避光孵育15 min,于流式細(xì)胞儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死的比例。

    1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞IL-6、IL-8分泌水平:收集上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清,利用雙抗體夾心法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8含量的變化。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照人IL-6/IL-8 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。加入辣根過(guò)氧化物酶的反應(yīng)底物至各反應(yīng)孔后,避光孵育10~15 min,加入50 μl終止液,將反應(yīng)板置于全波長(zhǎng)光吸收酶標(biāo)檢測(cè)儀中檢測(cè)各反應(yīng)孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度并根據(jù)試劑盒所提供的的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)而對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6/IL-8的含量進(jìn)行定量分析。

    1.3.5 Western Blot方法檢測(cè)A549細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1,Claudin1,Occludin蛋白表達(dá)水平:各組細(xì)胞按照1.3.1方法于12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行刺激培養(yǎng)24 h后,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次, 每孔加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液于冰上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解,時(shí)間約30 min。收集裂解細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至EP管進(jìn)行超聲破碎處理。4 ℃離心,將含蛋白的上清液轉(zhuǎn)移至一新EP管中, 利用BCA方法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量檢測(cè),并將蛋白樣品于- 80℃冰箱中分裝保存。

    將各實(shí)驗(yàn)組蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液混合后于100 ℃條件下煮10 min對(duì)蛋白進(jìn)行變性處理,加至10% SDS-PAGE凝膠樣品孔內(nèi)進(jìn)行電泳分離(濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為120 V),將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜條件:電流150 mA,時(shí)間 90 min)并用含3% BSA的TBST(含5% Tween-20的TBS緩沖液)室溫封閉1 h,PVDF膜在含ZO-1(按1∶500稀釋), Claudin1(按1∶200稀釋)、Occludin(按1∶200稀釋)和GAPDH(按1∶10 000稀釋)的抗體反應(yīng)液中4 ℃孵育過(guò)夜,次日經(jīng)TBST洗滌3次后,于室溫條件下與相應(yīng)種屬來(lái)源的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(按1∶10 000稀釋)反應(yīng)1 h,洗膜后加入化學(xué)發(fā)光液于成像儀中進(jìn)行顯影。利用Image J對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行定量分析(內(nèi)參為GAPDH)。

    1.3.6 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)A549細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1,Claudin1,Occludin的表達(dá):于細(xì)胞接種前,將預(yù)處理的細(xì)胞爬片置于24孔培養(yǎng)板中,按照1.3.1中的細(xì)胞培養(yǎng)及刺激條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。完成刺激24 h后棄去培養(yǎng)基,無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞爬片2次,4%多聚甲醛(PFA)處理10 min以完成對(duì)玻片上細(xì)胞的固定。PBS洗去多余PFA,將爬片置于含1% BSA的PBST(含0.3%Trition X-100的PBS緩沖液)封閉液中室溫封閉1 h后,將細(xì)胞爬片置于含ZO-1(按1∶200稀釋), Claudin1(按1∶200稀釋)、Occludin(按1∶200稀釋)的抗體反應(yīng)液中4 ℃孵育過(guò)夜,次日經(jīng)PBST洗滌后的細(xì)胞與相應(yīng)種屬來(lái)源的熒光標(biāo)記IgG二抗(488-山羊抗小鼠熒光二抗1∶600,594-山羊抗兔熒光二抗1∶200)室溫反應(yīng)1 h,PBST洗去殘余二抗后加入含DAPI的封片劑進(jìn)行封片,一周內(nèi)于激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal)下進(jìn)行觀察和圖像的拍攝。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 S. aureus/S. pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

    與陰性對(duì)照組相比:不同體積S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清可顯著抑制A549細(xì)胞增殖,兩種細(xì)菌其他成分僅S.pneumonia裂解物對(duì)A549細(xì)胞表現(xiàn)出增殖抑制作用(圖1)。

    2.2 S. aureus/S. pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞凋亡與壞死的影響

    與陰性對(duì)照組相比:S.aureus及S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清均可顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及壞死現(xiàn)象,而兩種細(xì)菌其他成分僅S.pneumonia裂解物可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死現(xiàn)象,該部分結(jié)果與兩種細(xì)菌各成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用相一致(圖2)。

    2.3 S. aureus/S. pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子功能的影響

    與陰性對(duì)照組相比:S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清均可促進(jìn)A549細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8,以S.pneumonia尤為顯著,且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性(圖3A、B);兩種細(xì)菌裂解物刺激A549細(xì)胞可增加其IL-6的分泌水平,S.pneumonia裂解物亦可增加IL-8的分泌,其余細(xì)菌成分的刺激對(duì)于這2種炎癥細(xì)胞因子的分泌功能未表現(xiàn)出明顯影響(圖3C、D)。

    2.4 S. aureus/S. pneumonia不同成分對(duì)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

    與陰性對(duì)照組相比:A549細(xì)胞在經(jīng)過(guò)S.aureus滅活菌體刺激后,緊密連接蛋白ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),另兩種緊密連接相關(guān)蛋白Occludin,Claudin1蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),其余細(xì)菌成分刺激均未明顯表現(xiàn)出對(duì)A549細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響(圖4A、B)。利用細(xì)胞免疫熒光染色方法對(duì)上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行觀察,盡管目前尚無(wú)適用于此條件下緊密連接蛋白表達(dá)的量化指標(biāo),圖像中所示不同刺激物對(duì)于3種緊密連接蛋白表達(dá)的影響趨勢(shì)與前述一致(圖4C~E)。

    3 討論

    細(xì)菌感染在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其中S.aureus、S.pneumonia所致的肺炎、慢性鼻-鼻竇炎等呼吸系統(tǒng)疾病在各地區(qū)廣泛流行,給家庭和社會(huì)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6-7]。治療過(guò)程中抗菌藥物的濫用引發(fā)耐藥菌株的出現(xiàn)進(jìn)一步加大了治療難度[8],因而明確細(xì)菌感染過(guò)程中主要的致病成分,進(jìn)而針對(duì)其發(fā)揮作用的主要環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)和針對(duì)性的治療成為臨床上亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

    細(xì)菌自身的代謝在維持細(xì)菌存活、毒力與致病作用的發(fā)揮方面至關(guān)重要,但目前對(duì)于細(xì)菌感染機(jī)體后其確切的代謝途徑、代謝產(chǎn)物及其作用的研究并不明確[9]。本研究利用S.aureus、S.pneumonia兩種細(xì)菌培養(yǎng)上清模擬細(xì)菌的代謝產(chǎn)物,觀察其對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞因子分泌及緊密連接蛋白表達(dá)等功能的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):2種細(xì)菌的培養(yǎng)上清(代謝產(chǎn)物)均可有效抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)壞死和凋亡現(xiàn)象,增加炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8的分泌,提示某些細(xì)菌基礎(chǔ)代謝,如糖代謝、氨基酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物亦或終產(chǎn)物可能在其中發(fā)揮一定作用。Leonard等[9]利用代謝組學(xué)的方法分析發(fā)現(xiàn)不同菌株S.pneumonia培養(yǎng)上清(即體外代謝分泌物)中含有大量細(xì)菌基礎(chǔ)代謝相關(guān)產(chǎn)物,如甲酸、乳酸、乙醇等物質(zhì),其中甲酸等有機(jī)酸可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]。本研究中,上述2種細(xì)菌培養(yǎng)上清刺激組的A549細(xì)胞培養(yǎng)基與未刺激組細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)酸堿度未出現(xiàn)明顯改變(結(jié)果未展示),故此可基本排除因酸堿度改變所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制及凋亡效應(yīng),同時(shí)提示甲酸等代謝產(chǎn)物可能通過(guò)復(fù)雜機(jī)制誘發(fā)細(xì)胞凋亡。另有報(bào)道S.aureus代謝過(guò)程中產(chǎn)生的丙酮酸可引起細(xì)菌整體代謝通量的變化進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)菌致病性[11]。細(xì)菌培養(yǎng)上清中除含有細(xì)菌代謝過(guò)程的中間產(chǎn)物與終產(chǎn)物外,還包括細(xì)菌合成并分泌到胞外的蛋白類(lèi)等物質(zhì),其中S.aureus分泌的多種毒素,如葡萄球菌腸毒素和α-毒素等被報(bào)道可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死的發(fā)生,促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的分泌[12-13]。文獻(xiàn)報(bào)道S.aureus胞外分泌蛋白V8以及特定S.aureus菌株細(xì)胞培養(yǎng)上清可分別降低A549細(xì)胞,原代人鼻上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1,Claudin1的表達(dá),破壞上皮細(xì)胞緊密連接完整性[14-15],細(xì)菌培養(yǎng)上清經(jīng)過(guò)超濾濃縮后可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)下調(diào)[16]。本實(shí)驗(yàn)中未明顯觀察到兩種細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響可能原因?yàn)榧?xì)菌培養(yǎng)上清未進(jìn)行超濾濃縮,相關(guān)作用蛋白濃度不足所致。

    圖 1S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(n=6)

    Fig1Effects of different components ofS.aureus/S.pneumoniaon the proliferation of A549 cells(n=6)

    A.不同體積S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響,其中細(xì)菌培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組,加入相同體積細(xì)菌空白培養(yǎng)基;B.兩種細(xì)菌裂解物、細(xì)菌滅活菌體對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響;與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

    圖 2S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞凋亡與壞死的影響(n=3)

    Fig2Effects of different components ofS.aureus/S.pneumoniaon apoptosis and necrosis of A549 cells(n=3)

    A.S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞凋亡與壞死的影響,其中陰性對(duì)照組加入相同體積細(xì)菌空白培養(yǎng)基;B:兩種細(xì)菌裂解物、細(xì)菌滅活菌體對(duì)細(xì)胞凋亡與壞死的影響;與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.0001

    圖 3S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)炎癥細(xì)胞因子分泌功能的影響(n=3)

    Fig3Effects of different components ofS.aureus/S.pneumoniaon the secretion of inflammatory cytokines by A549 cells(n=3)

    A.不同體積S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-6的影響;B.不同體積S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-8的影響;C.兩種細(xì)菌裂解物、細(xì)菌滅活菌體對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-6的影響;D.兩種細(xì)菌裂解物、細(xì)菌滅活菌體對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-8的影響; 與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

    細(xì)菌經(jīng)過(guò)超聲破碎處理后獲得細(xì)菌裂解物,其主要成分為細(xì)菌胞內(nèi)的非分泌性蛋白等物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示,S.pneumonia裂解物可顯著抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其壞死和凋亡比例增加。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,S.pneumonia多種毒力因子,如肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin,Ply)作為一種胞內(nèi)蛋白,可以通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)多種宿主細(xì)胞凋亡并促進(jìn)病原菌的感染[17-19],神經(jīng)氨酸酶(microbial neuraminidases, NA)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、損傷方面同樣發(fā)揮重要作用[20]。上述細(xì)菌成分以及S.pneumonia其他胞內(nèi)重要毒力因子,如S.pneumonia肽鏈內(nèi)切酶等均可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8分泌[21-22],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。目前研究較為明確的S.aureus重要毒力因子主要為其分泌的多種外毒素、細(xì)胞壁蛋白成分,上述成分可促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌IL-6[23-24],且前者可一定程度上存在于細(xì)菌胞漿部位(細(xì)菌裂解物),可能在S.aureus裂解物刺激A549細(xì)胞分泌IL-6中發(fā)揮重要作用,其余發(fā)揮作用的胞內(nèi)蛋白仍待進(jìn)一步探究。

    經(jīng)甲醛滅活的兩種細(xì)菌菌體對(duì)于A549細(xì)胞增殖、凋亡與壞死均未表現(xiàn)出明顯影響,但S.aureus滅活菌體可誘導(dǎo)A549細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)水平的下調(diào),輕度抑制其他兩種緊密連接蛋白Claudin1、Occludin的表達(dá)。McLoughlin等[25]報(bào)道,滅活S.aureus菌體可降低人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá),而S.aureus細(xì)胞壁重要致病物質(zhì)葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A,SpA)在其中并未發(fā)揮主導(dǎo)作用。S.aureus及S.pneumonia均為革蘭陽(yáng)性細(xì)菌,其細(xì)胞壁成分中的脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)作為細(xì)菌重要致病物質(zhì),文獻(xiàn)報(bào)道其單獨(dú)作用于角質(zhì)形成細(xì)胞并不能影響其緊密連接蛋白基因表達(dá)水平的改變[26],故對(duì)于S.aureus菌體中引起上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)的主要物質(zhì)仍需新一步明確。另外S.pneumonia細(xì)胞壁成分中另一重要毒力因子為細(xì)菌莢膜,本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)使用S.pneumonia菌體進(jìn)行細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)未引起A549細(xì)胞上述結(jié)構(gòu)和功能的改變,提示細(xì)菌莢膜可能在機(jī)體突破黏膜免疫屏障,進(jìn)入機(jī)體引發(fā)固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答階段發(fā)揮重要作用。

    圖 4S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的影響(n=3)

    Fig4Effects of different components ofS.aureus/S.pneumoniaon tight junction proteins ZO-1, Occludin and Claudin1 expressed by A549 cells(n=3)

    A.Western Blot方法檢測(cè)S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1,Occludin,Claudin1蛋白表達(dá)的影響; B.Western Blot結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析圖,目的蛋白條帶灰度值/對(duì)應(yīng)內(nèi)參灰度值反映各組蛋白相對(duì)表達(dá)的變化; C~E.細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)A549在不同細(xì)菌成分刺激下緊密連接蛋白ZO-1(C),Occludin(D),Claudin1(E)表達(dá)鏡下圖,其中藍(lán)色為DAPI染色,顯示細(xì)胞核成分;紅色、綠色熒光分別為目的蛋白,放大倍數(shù)為×630; 與陰性對(duì)照比較,*P<0.01

    綜上所述,S.aureus和S.pneumonia感染過(guò)程中,不同細(xì)菌及細(xì)菌的不同成分對(duì)上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響并不完全相同。細(xì)菌培養(yǎng)上清、裂解物主要影響上皮細(xì)胞增殖、炎癥因子分泌等功能,在本實(shí)驗(yàn)條件下S.pneumonia裂解物對(duì)于上述功能的影響略強(qiáng)于S.aureus裂解物的作用(對(duì)于IL-6分泌的影響除外);僅S.aureus滅活菌體可降低緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)進(jìn)而影響上皮細(xì)胞間緊密連接的完整性。

    本研究將細(xì)菌致病成分具體化,分為細(xì)菌代謝產(chǎn)物、細(xì)菌裂解物、細(xì)菌菌體3種組分,分別作用于呼吸系統(tǒng)疾病研究中廣泛使用的細(xì)胞株-人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)[27-29],探究對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的影響。傳統(tǒng)的體外活細(xì)菌感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)側(cè)重于感染對(duì)機(jī)體損傷作用結(jié)果的研究,本研究方法在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了對(duì)細(xì)菌致病成分的分析與探究。實(shí)驗(yàn)后續(xù)將通過(guò)細(xì)菌代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)譜等研究方法對(duì)上述不同細(xì)菌成分進(jìn)一步具體化,明確細(xì)菌感染過(guò)程中重要的致病物質(zhì)及其致病機(jī)制。該研究將為臨床S.aureus和S.pneumonia感染的防控、疫苗的制定以及細(xì)菌感染后的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    猜你喜歡
    菌體培養(yǎng)基細(xì)菌
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    偉大而隱秘的細(xì)菌
    東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中菌體的分離與鑒定
    細(xì)菌大作戰(zhàn)
    細(xì)菌大作戰(zhàn)
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    黃芩苷對(duì)一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內(nèi)外抗菌作用的研究
    蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    各種培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個(gè)事項(xiàng)
    細(xì)菌惹的禍
    男人舔女人下体高潮全视频| av片东京热男人的天堂| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜久久久久精精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲av电影不卡..在线观看| 两个人看的免费小视频| 国内精品一区二区在线观看| 在线观看av片永久免费下载| avwww免费| 九色成人免费人妻av| 精品久久久久久久末码| 三级毛片av免费| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产69精品久久久久777片| 国产成人av激情在线播放| 国产伦在线观看视频一区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产真人三级小视频在线观看| 88av欧美| 在线观看午夜福利视频| 1024手机看黄色片| 亚洲av美国av| 精品一区二区三区人妻视频| 757午夜福利合集在线观看| 国产一区二区三区视频了| 97碰自拍视频| 久久亚洲精品不卡| 欧美成人性av电影在线观看| 一本一本综合久久| 免费在线观看日本一区| 免费高清视频大片| 国产精品久久久久久精品电影| 久久久久久国产a免费观看| 国模一区二区三区四区视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 中文字幕久久专区| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲精品色激情综合| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一级作爱视频免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 搡老熟女国产l中国老女人| svipshipincom国产片| 久久久色成人| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美成人a在线观看| 久久久久性生活片| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美激情在线99| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩欧美国产在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一区二区三区激情视频| 1024手机看黄色片| 国产三级黄色录像| 国产男靠女视频免费网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 91久久精品电影网| 99久久精品热视频| 日韩高清综合在线| 日韩欧美在线二视频| 成人精品一区二区免费| 亚洲精品一区av在线观看| 日韩欧美三级三区| 男插女下体视频免费在线播放| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品在线观看二区| 精品免费久久久久久久清纯| 一级作爱视频免费观看| 99热精品在线国产| 国产三级在线视频| av在线天堂中文字幕| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品一区二区免费欧美| 久久国产精品影院| 日本 av在线| 丝袜美腿在线中文| 亚洲人成网站在线播| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲成人久久性| 他把我摸到了高潮在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| svipshipincom国产片| 女同久久另类99精品国产91| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲五月婷婷丁香| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产成人aa在线观看| 欧美乱妇无乱码| 麻豆国产av国片精品| 女警被强在线播放| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲avbb在线观看| 天堂网av新在线| 在线播放无遮挡| 特级一级黄色大片| 欧美日韩黄片免| 神马国产精品三级电影在线观看| 色在线成人网| 宅男免费午夜| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美色视频一区免费| 精品久久久久久成人av| 怎么达到女性高潮| 国产伦在线观看视频一区| 精品福利观看| 手机成人av网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 夜夜爽天天搞| 天美传媒精品一区二区| 日韩欧美免费精品| 成人午夜高清在线视频| 男插女下体视频免费在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 一本精品99久久精品77| 成人欧美大片| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产私拍福利视频在线观看| 天堂√8在线中文| 一个人免费在线观看电影| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 成年女人永久免费观看视频| 久久久久久大精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品久久视频播放| 1024手机看黄色片| 国产v大片淫在线免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 我的老师免费观看完整版| 亚洲,欧美精品.| 亚洲av一区综合| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美乱色亚洲激情| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 韩国av一区二区三区四区| 国产免费一级a男人的天堂| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜激情福利司机影院| 一个人看视频在线观看www免费 | 91麻豆av在线| 又黄又粗又硬又大视频| 国产一区在线观看成人免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 哪里可以看免费的av片| 美女高潮的动态| netflix在线观看网站| 啦啦啦免费观看视频1| а√天堂www在线а√下载| 久久久国产成人精品二区| 一级黄色大片毛片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老司机午夜十八禁免费视频| 丁香六月欧美| netflix在线观看网站| 久久香蕉精品热| 久久亚洲精品不卡| 亚洲精品色激情综合| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 丝袜美腿在线中文| 日韩有码中文字幕| 亚洲不卡免费看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久国产精品影院| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品一及| 乱人视频在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲av一区综合| 国产中年淑女户外野战色| 午夜视频国产福利| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 老鸭窝网址在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 99久久99久久久精品蜜桃| av欧美777| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产黄色小视频在线观看| 国产熟女xx| 日本熟妇午夜| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品久久久久久,| 国产精品一及| 久久久久国内视频| 国产麻豆成人av免费视频| 日韩高清综合在线| 老汉色∧v一级毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲,欧美精品.| 日本免费a在线| 可以在线观看的亚洲视频| 真人做人爱边吃奶动态| 日本 av在线| 久久九九热精品免费| 欧美乱色亚洲激情| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 热99re8久久精品国产| 最新美女视频免费是黄的| 成人永久免费在线观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 五月伊人婷婷丁香| 成人无遮挡网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日韩欧美精品v在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产一区二区在线观看日韩 | 在线看三级毛片| 国产高清videossex| www日本在线高清视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 两个人视频免费观看高清| 级片在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 男女视频在线观看网站免费| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线观看66精品国产| 国产av不卡久久| 国产精品久久电影中文字幕| 999久久久精品免费观看国产| 免费大片18禁| 观看免费一级毛片| 午夜福利欧美成人| 久久久国产成人免费| 日韩精品中文字幕看吧| 国产91精品成人一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 久久久久精品国产欧美久久久| 国内精品一区二区在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 国内精品久久久久久久电影| 久久精品91蜜桃| 18禁在线播放成人免费| 日本三级黄在线观看| 午夜福利在线在线| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲18禁久久av| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久久免费精品人妻一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 成年免费大片在线观看| 欧美日韩黄片免| 久久精品影院6| 色av中文字幕| 日韩人妻高清精品专区| 性色avwww在线观看| 一级毛片高清免费大全| 久久99热这里只有精品18| av片东京热男人的天堂| 日本黄大片高清| 欧美激情在线99| 国产成人a区在线观看| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品野战在线观看| 深夜精品福利| 99久久综合精品五月天人人| 好男人电影高清在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 免费观看精品视频网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 亚洲av二区三区四区| 免费观看人在逋| 亚洲第一电影网av| 99精品在免费线老司机午夜| 国产极品精品免费视频能看的| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美一级毛片孕妇| 少妇高潮的动态图| 久久久久久大精品| 中文字幕久久专区| 婷婷六月久久综合丁香| 国产成人av教育| 99精品在免费线老司机午夜| 一区二区三区激情视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美日本视频| 宅男免费午夜| aaaaa片日本免费| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 免费观看人在逋| 午夜视频国产福利| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| aaaaa片日本免费| 成人av一区二区三区在线看| 黄色视频,在线免费观看| 窝窝影院91人妻| 黄色女人牲交| 精品日产1卡2卡| 国产乱人视频| 日本 欧美在线| 在线国产一区二区在线| 99热只有精品国产| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 91字幕亚洲| 成年人黄色毛片网站| 99国产精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产美女午夜福利| 免费人成在线观看视频色| 女警被强在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 99久久成人亚洲精品观看| 国产乱人伦免费视频| 搡老岳熟女国产| 丝袜美腿在线中文| 99精品久久久久人妻精品| 日本在线视频免费播放| 亚洲色图av天堂| 美女黄网站色视频| 国内精品久久久久久久电影| 日韩精品中文字幕看吧| 黄色视频,在线免费观看| 国产激情欧美一区二区| 日韩人妻高清精品专区| 精品国产三级普通话版| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 男女下面进入的视频免费午夜| 一夜夜www| 成人欧美大片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 人妻久久中文字幕网| 国产男靠女视频免费网站| 一本一本综合久久| 成年女人看的毛片在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日韩大尺度精品在线看网址| 色噜噜av男人的天堂激情| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久九九热精品免费| 搞女人的毛片| 欧美性感艳星| 真人做人爱边吃奶动态| 中文字幕熟女人妻在线| 国产高清三级在线| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜亚洲福利在线播放| 国产熟女xx| 俄罗斯特黄特色一大片| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品1区2区在线观看.| 90打野战视频偷拍视频| 久久精品国产综合久久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 最新中文字幕久久久久| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 1024手机看黄色片| 欧美3d第一页| 亚洲天堂国产精品一区在线| 在线国产一区二区在线| 无限看片的www在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一级a爱片免费观看的视频| 九九热线精品视视频播放| 美女高潮的动态| av黄色大香蕉| 亚洲av二区三区四区| 午夜福利高清视频| 国产欧美日韩一区二区三| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费看十八禁软件| 国产伦人伦偷精品视频| 有码 亚洲区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜激情欧美在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 99久久99久久久精品蜜桃| 一区二区三区高清视频在线| 中文字幕av在线有码专区| 91久久精品电影网| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 在线观看av片永久免费下载| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美激情在线99| 亚洲人成电影免费在线| 日本黄色片子视频| 天堂影院成人在线观看| 免费av观看视频| 欧美区成人在线视频| 欧美又色又爽又黄视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美日本视频| 免费无遮挡裸体视频| 国产真人三级小视频在线观看| 88av欧美| tocl精华| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲人成伊人成综合网2020| 两人在一起打扑克的视频| 国产亚洲欧美98| 99热这里只有精品一区| 99精品久久久久人妻精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 婷婷亚洲欧美| av天堂中文字幕网| 中文字幕av成人在线电影| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男女视频在线观看网站免费| 69av精品久久久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 真实男女啪啪啪动态图| 中文字幕av在线有码专区| 在线观看舔阴道视频| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 久久这里只有精品中国| 天天添夜夜摸| 国产成人欧美在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产老妇女一区| av国产免费在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 黄色片一级片一级黄色片| 波野结衣二区三区在线 | 丝袜美腿在线中文| 午夜视频国产福利| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品国产高清国产av| 一夜夜www| 国产成+人综合+亚洲专区| 嫩草影院精品99| 看片在线看免费视频| 18禁国产床啪视频网站| 国产视频内射| 男女午夜视频在线观看| 黄片大片在线免费观看| 看黄色毛片网站| 亚洲熟妇熟女久久| svipshipincom国产片| 一进一出抽搐gif免费好疼| av女优亚洲男人天堂| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色吧在线观看| 亚洲人成网站在线播| 精品电影一区二区在线| 国产精品精品国产色婷婷| 91在线精品国自产拍蜜月 | 午夜精品在线福利| 午夜日韩欧美国产| 婷婷精品国产亚洲av| 美女黄网站色视频| 在线观看午夜福利视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 毛片女人毛片| 欧美大码av| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲av成人av| 在线观看午夜福利视频| 亚洲人成网站在线播| 少妇高潮的动态图| 一a级毛片在线观看| 69av精品久久久久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 内射极品少妇av片p| 精品久久久久久,| 午夜福利免费观看在线| 国产精华一区二区三区| 操出白浆在线播放| 一级毛片女人18水好多| 999久久久精品免费观看国产| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产免费av片在线观看野外av| 18美女黄网站色大片免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产高清视频在线观看网站| 午夜激情欧美在线| 久久精品国产综合久久久| 精品久久久久久,| 18禁美女被吸乳视频| 成年免费大片在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 香蕉av资源在线| 午夜精品在线福利| 国产精品野战在线观看| 久久久久久久久大av| 禁无遮挡网站| 99精品在免费线老司机午夜| 人人妻人人澡欧美一区二区| 免费观看人在逋| www.熟女人妻精品国产| 一级黄色大片毛片| 淫秽高清视频在线观看| 在线看三级毛片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 在线观看一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产色婷婷99| 久久欧美精品欧美久久欧美| 男女视频在线观看网站免费| 制服人妻中文乱码| 日韩欧美 国产精品| 黄色视频,在线免费观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 色在线成人网| 一本久久中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 变态另类丝袜制服| 欧美极品一区二区三区四区| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲五月婷婷丁香| 免费看光身美女| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日韩欧美在线二视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 午夜免费激情av| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产av不卡久久| 国产97色在线日韩免费| 国产午夜精品论理片| www.色视频.com| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 香蕉久久夜色| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产真实乱freesex| 国产精品电影一区二区三区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 最近在线观看免费完整版| netflix在线观看网站| av欧美777| 欧美zozozo另类| 精品国内亚洲2022精品成人| 3wmmmm亚洲av在线观看| 一进一出抽搐动态| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产av不卡久久| 老司机午夜福利在线观看视频| av在线蜜桃| 免费观看人在逋| 国产av一区在线观看免费| 此物有八面人人有两片| 日本 欧美在线| 91在线观看av| 五月伊人婷婷丁香| 欧美乱妇无乱码| 国内精品一区二区在线观看| 波多野结衣高清作品| 少妇的丰满在线观看| 精品国产亚洲在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 丁香六月欧美| www.色视频.com| 欧美国产日韩亚洲一区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| av女优亚洲男人天堂| 激情在线观看视频在线高清| 国产三级黄色录像| 色尼玛亚洲综合影院| 99国产极品粉嫩在线观看| 成人无遮挡网站| 国产亚洲精品一区二区www| 日本黄大片高清| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜视频国产福利| 国产精品久久久久久精品电影| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| АⅤ资源中文在线天堂| 内地一区二区视频在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人影院久久av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久久久久久久久黄片| 久久草成人影院| 午夜福利高清视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一本综合久久免费| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲无线观看免费| 天堂√8在线中文| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久欧美精品欧美久久欧美| 黄片大片在线免费观看|