改良SDS法提取書虱總RNA的效果評(píng)估

盧瑩 黃文雨 黃夢蕊 王波 陳潛 劉嘯 汪書然 孫恩濤

書虱(book lice)體長約1 mm，隸屬于嚙目、虱嚙科，是一類廣泛存在于多種儲(chǔ)藏物中的害蟲，呈世界性分布[1]。該屬昆蟲已知種類近110種，我國現(xiàn)已報(bào)道該屬昆蟲16種，其中最常見和最具經(jīng)濟(jì)意義的是嗜卷書虱[2]。書虱高質(zhì)量RNA提取是進(jìn)行下游分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，然而目前的RNA提取方法存在著完整性差、產(chǎn)率低、操作繁雜、試劑價(jià)格昂貴等問題，如異硫氰酸胍苯酚法[3]、酚-SDS法[4]、CTAB法[5]和試劑盒法等[6]難以提出高質(zhì)量的RNA。本實(shí)驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)SDS法[7]進(jìn)行優(yōu)化，并與傳統(tǒng)SDS和TRIzol法的提取效果進(jìn)行比較，以建立一種適用于書虱總RNA的提取方法。

材料和方法

一、書虱

書虱采集于學(xué)生宿舍、校園圖書館、面粉廠的臟面粉和戶外地表的枯枝落葉。

二、主要試劑

TRIzol試劑盒(Invitrogen)、RT-PCR試劑盒(TIANGEN)、β-巰基乙醇(Solarbio)、SDS(Solarbio)、醋酸鉀、水飽和酚(TIANGEN)、三氯甲烷、異丙醇、乙二醇丁醚、無水乙醇、2×Taq Master Mix(TIANGEN)。

三、三種方法提取書虱RNA效果比較

取300只書虱成蟲隨機(jī)分為三組，每組100只，分別采用改良SDS法、傳統(tǒng)SDS法和TRIzol法進(jìn)行書虱總RNA提取。3種方法各重復(fù)進(jìn)行15次。

1.TRIzol法 參照TRIzol試劑盒說明方法進(jìn)行。

2.傳統(tǒng)SDS法 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]中步驟方法進(jìn)行。

3.改良SDS法

(1)配置實(shí)驗(yàn)試劑：①核酸萃取液Ⅰ：200μL DEPC水、500 μL水飽和酚、100 μL 10% SDS；②β-巰基乙醇；③核酸萃取液Ⅱ：水飽和酚/氯仿/異戊醇=125/24/1；④乙二醇丁醚；⑤75%乙醇

(2)實(shí)驗(yàn)步驟：① 取100只書虱樣本于1.5 mL 離心管中，向其加入15 μL核酸萃取液Ⅰ和5 μL β-巰基乙醇；② 由于書虱個(gè)體較小，易于離心管中懸浮影響研磨效果，將RNase-Free槍頭在酒精燈上燒軟輕輕按壓使管口閉合，直接于RNase-Free離心管中研磨，于冰盒上小心研磨直至研磨充分，再將180 μL核酸萃取液Ⅰ加入到RNase-Free離心管中，充分混勻得到勻漿液。室溫孵育3 min；③ 向勻漿液中加入200 μL 2 mol/L KAc緩沖液，輕輕吹打混勻。根據(jù)KAc緩沖液的最適pH值探究試驗(yàn)得出最佳的pH值。室溫孵育5 min；④ 4℃ 12000 r/min離心15 min；⑤ 取上層水相，加入等體積的核酸萃取液Ⅱ吹打混勻，振蕩30 s后室溫孵育5 min；⑥ 4℃ 12 000 r/min離心15 min；⑦ 取上層清夜，加入等體積的乙二醇丁醚，吹打混勻，-20℃靜置40 min；⑧ 4℃ 12 000 r/min離心15 min；⑨ 吸取上清，保留沉淀，加入500 μL 75%乙醇洗滌沉淀；⑩ 去除乙醇，將沉淀室溫自然晾干后加入20 μL RNase-Free水，充分溶解沉淀。

四、改良SDS法KAc緩沖液最適pH值

設(shè)計(jì)pH梯度試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.3～3.9不同pH值的KAc緩沖液，濃度均為2 mol/L。每個(gè)梯度書虱數(shù)量100只，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最適的pH值。

五、改良SDS法書虱最低適宜數(shù)量

分別取1、10、20、30、50、100只書虱成蟲，隨機(jī)分為六組，采用改良SDS法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

六、RNA提取效果鑒定

1.RNA電泳檢測：用1%的瓊脂糖凝膠電泳(110 V、180 m A電泳35 min)跑膠，然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察以檢測RNA的完整性。

2.RNA濃度與純度測定：用核酸蛋白分析儀(Eppendorf Mastercycler nexus GSX1)測定RNA溶液的濃度和純度，每組樣品重復(fù)3次，求平均值。根據(jù)A260/A280、A260/A280比值結(jié)果做純度分析。

3.RT-PCR擴(kuò)增β-actin基因：參照RT-PCR試劑盒(TIANGEN)說明書合成cDNA模板并進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系：cDNA模板1.0 μL；上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；無酶水4.25 μL、6.25 μL 2×TaqMaster Mix。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸1 min，循環(huán)34次；72℃終末延伸10 min；4℃保存。引物參照文獻(xiàn)[9]的β-actin基因引物序列：上游引物5′-ATGATGGGCTCAGCGATGTCC-3′；下游引物5′-CTCCATCTAAGCTGCAGTCATGAT-3′?；蚱伍L度為457 bp。

結(jié) 果

一、三種方法提取書虱總RNA比較

1.瓊脂糖凝膠電泳分析

對(duì)改良SDS法、傳統(tǒng)SDS法、和TRIzol法提取的RNA產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示。改良SDS法提取的書虱RNA完整性較好，電泳結(jié)果顯示28s rRNA、18s rRNA和5s rRNA條帶完整，條帶之間無明顯彌散現(xiàn)象；而傳統(tǒng)SDS法提取結(jié)果可見有明顯的gDNA污染；TRIzol法提取書虱RNA未見28s rRNA條帶。

2.RNA濃度與純度分析

改良SDS法、傳統(tǒng)SDS法、TRIzol法提取書虱總RNA的濃度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.874，P<0.001)。經(jīng)SNK法每組互比，改良SDS法濃度較高，其次為TRIzol法，傳統(tǒng)SDS法較低(表1)。

M：DNA marker；泳道1-3：改良SDS法、傳統(tǒng)SDS法、TRIzol法

改良SDS法及傳統(tǒng)SDS法提取RNA的A260/A280均在理想值范圍1.8～2.0內(nèi)，說明存在蛋白質(zhì)污染；TRIzol法的A260/A280高于2.0。改良SDS法提取RNA 的A260/A230在理想值范圍2.0～2.2內(nèi)，說明該方法可去除脂類、多糖等成分。TRIzol 法的A260/A230低于2.0，說明存在有機(jī)物質(zhì)等污染。

表1 三種方法提取書虱RNA的濃度和純度

二、改良SDS法KAc緩沖液最適pH值

KAc緩沖液最適pH值探究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)pH值在3.5～3.8范圍內(nèi)，提取的RNA質(zhì)量較高，無gDNA污染，無彌散帶。最后根據(jù)書虱總RNA濃度和完整性(表2、圖2)建議改良SDS法采用pH3.7的KAc緩沖液。

表2 不同pH值的KAc緩沖液提取的書虱總RNA濃度和純度

M：DNA marker；泳道1～7 pH值：3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9

三、改良SDS法書虱最低適宜數(shù)量

改良SDS法提取書虱樣本，當(dāng)書虱的樣本量低至30只時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)微弱條帶(表3、圖3)。

表3 不同書虱數(shù)量提取的總RNA濃度和純度

M：DNA marker；泳道1-6書虱數(shù)量(只)：1、10、20、30、50、100

四、RT-PCR擴(kuò)增β-actin基因

改良SDS法(pH=3.7，書虱數(shù)量為30只)提取的書虱RNA 經(jīng)RT-PCR后擴(kuò)增出的β-actin基因片段長度約457 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，且條帶單一整齊，沒有拖帶(圖4)。

M:DNA marker

討 論

隨著Northern blot、RT-PCR、qPCR等[10]生物技術(shù)的發(fā)展，下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵在于高質(zhì)量 RNA 的獲取。采用傳統(tǒng)SDS法提取書虱的RNA中往往存在嚴(yán)重的gDNA污染[11]，本實(shí)驗(yàn)用pH值更低的KAc緩沖液代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中的酸性NaAc緩沖液，KAc緩沖液中的K+可與 SDS結(jié)合成不溶性PDS(十二烷基硫酸鉀)沉淀，同時(shí)沉淀了絕大多數(shù)的gDNA及蛋白質(zhì)[12]；水相pH值較低時(shí)，大量核酸會(huì)分配到酚相中；反之，水相pH值過高，gDNA會(huì)被抽提出來。降低KAc緩沖液的pH使偏酸性的KAc緩沖液可以創(chuàng)造酸性的水相環(huán)境，使部分核酸被酚抽提液吸附。同時(shí)，使gDNA在加入酚/氯仿離心分層時(shí)更易進(jìn)入酚相，從而與RNA分離[13]。在提取書虱RNA過程中，RNA酶無處不在且狀態(tài)不穩(wěn)定，因此，防止RNA降解是成功提取RNA的前提。實(shí)驗(yàn)研磨過程中，將內(nèi)源RNA酶抑制劑β-巰基乙醇與SDS聯(lián)合使用可有效抑制內(nèi)源性RNase及酚類氧化酶，防止RNA的降解，保證高質(zhì)量RNA的提取[14]。另外，本實(shí)驗(yàn)還將傳統(tǒng)方法中49∶1的酚/氯仿改為125∶24∶1的酚/氯仿/異戊醇，避免因苯酚過量難以洗滌而造成RNA污染。用乙二醇丁醚代替異丙醇沉淀RNA，使所得RNA沉淀提取效果更佳[15]。