咳特靈片膠囊總黃酮含量和抗氧化活性研究

丁天宇 黃慧學 陳貽威

[摘要]目的 對22批咳特靈片（膠囊）總黃酮含量和抗氧化活性進行研究，探討咳特靈片（膠囊）總黃酮體外抗氧化活性。方法 以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法在510 nm對22（包括1批次過期品）批咳特靈片（膠囊）進行總黃酮含量測定;并以維生素C作為對比，以DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力作為指標，對咳特靈片（膠囊）進行體外抗氧化活性的測定。結果 21批有效期內咳特靈片劑和膠囊的平均總黃酮含量、DPPH自由基、ABTS自由基清除率和Fe3+還原能力分別為12.57%、10.13%、77.44%、83.27%、54.51%、49.93%、0.15、0.13，均有清除DPPH自由基、ABTS自由基作用及對Fe3+的還原能力。結論 咳特靈片（膠囊）在一定濃度范圍內具有較強的抗氧化活性。

[關鍵詞]咳特靈;體外抗氧化活性;總黃酮;片劑;膠囊

[中圖分類號] R284.1 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2019）12（b）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the in vitro antioxidant activity of total flavonoids from Keteling Tablets （Capsules） by a study on total flavonoid content and antioxidant activity of 22 batches of Keteling Tablets （Capsules）. Methods Taking rutin as the reference substance， the total flavonoid content of 22 batches （including 1 batch of expired products） of Keteling Tablets （Capsules） was determined by ultraviolet spectrophotometry at 510 nm. Vitamin C was used as a comparison， DPPH free radical scavenging ability， ABTS free radical scavenging ability， and Fe3+ reducing ability were taken as indicators to determine the in vitro antioxidant activity of Keteling Tablets （Capsules）. Results The average total flavonoid content， DPPH free radical scavenging rate， ABTS free radical scavenging rate and Fe3+ reducing ability of the 21 batches of Keteling Tablets and Capsules within the expiration date were 12.57%， 10.13%， 77.44%， 83.27%， 54.51%， 49.93%， 0.15， and 0.13， respectively， all showing ability of scavenging DPPH free radicals and ABTS free radicals and the ability to reduce Fe3+. Conclusion Keteling Tablets （Capsules） have strong antioxidant activity in a certain concentration range.

[Key words] Keteling; In vitro antioxidant activity; Total flavonoids; Tablets; Capsules

咳特靈片（膠囊）是中西藥復方制劑，由小葉榕干浸膏和馬來酸氯苯那敏組成，具有鎮(zhèn)咳平喘、消炎祛痰的功效，常用于治療咳喘及慢性支氣管炎[1]。小葉榕葉為?？浦参锛毴~榕Ficus microcarpa L.f.干燥葉的提取物，在嶺南地區(qū)民間多用于治療咳嗽、痢疾、小兒夜啼等[2]。小葉榕干浸膏含有葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷等多種黃酮類成分[3]。當呼吸道受到異物刺激時容易引發(fā)咳嗽，咳嗽在清除呼吸道異物時從而引發(fā)炎癥?，F(xiàn)代藥理學研究表明[3]，咳嗽是慢性支氣管炎的重要臨床特征，鎮(zhèn)咳祛痰和增加人體內抗氧化能力，對治療慢性支氣管炎具有良好的效果。氧化損傷與人體內疾病如呼吸道疾病、心血管疾病等多種其他疾病的發(fā)生密切相關[4]，因此，本研究對咳特靈片（膠囊）總黃酮抗氧化活性進行探討，以期為咳特靈片（膠囊）治療慢性支氣管炎深入研究奠定科學基礎。

1儀器與材料

1.1儀器

Infinite M200 PRO全波長多功能酶標儀（瑞士Tecan）;SQP型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）;SB25-12D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2材料

蘆丁（批號：MVST-19010202），購自中國科學院成都生物研究所;維生素C（Vc），購于國藥集團化學試劑有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽均購于麥克林公司;氫氧化鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀均購于成都金山化學試劑有限公司;乙醇購于成都市科隆化學品有限公司;甲醇、三氯醋酸購于天津市大茂化學試劑有限公司;22批咳特靈片（膠囊），其中片（P）（廣西廠家P1～5，廣東廠家P6～9，包括1批過期的廣東廠家P10），膠囊（J）（廣東廠家J1～9，江西廠家J10，吉林廠家J11～12）。

2方法與結果

2.1總黃酮含量測定

2.1.1蘆丁對照品溶液的制備 ?取蘆丁對照品5 mg，精密稱定，置于25 ml容量瓶中，加無水乙醇適量，超聲使溶解，放冷，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得到210 μg/ml的蘆丁對照品溶液，冷藏，備用。

2.1.2供試品溶液的制備 ?取咳特靈片20片，除去包衣后研細，精密稱取1.5 g;取咳特靈膠囊，將內容物混勻，精密稱取1.4 g，置于50 ml容量瓶中，加70%甲醇適量，密塞，超聲45 min使其溶解，放冷，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3線性關系考察 ?精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6 ml分別置于25 ml容量瓶中，各加純水至6 ml，加5%亞硝酸鈉1 ml，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁1 ml，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉10 ml，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白對照。用酶標儀于510 nm處測定吸光度（OD）[5]。

2.1.4樣品總黃酮含量測定 ?將咳特靈片（膠囊）分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下樣品測定方法測定A值并計算總黃酮含量。

2.2體外抗氧化活性研究

2.2.1咳特靈DPPH清除能力的測定 ?0.1 mmol/L DPPH溶液的配置：精密稱取4 mg的DPPH，用無水乙醇定容至100 ml，4℃避光保存。

按“2.1.2”項下方法制備樣品溶液，用70%甲醇將樣品制成質量濃度0.0112 mg/ml的供試品溶液，取2 ml不同濃度的樣品溶液，加2 ml現(xiàn)配的0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光放置30 min，以無水乙醇為空白在517 nm下測定其OD（A1）。2 ml的無水乙醇代替DPPH溶液，其余操作同上為空白（A2）。2 ml的無水乙醇代替樣品溶液，其余操作同上為空白（A0），Vc為陽性對照。根據(jù)以下公式計算咳特靈對DPPH自由基的消除能力：清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%[6-9]。

2.2.2去除ABTS自由基能力的測定 ?ABTS反應液：精密稱取0.3841 g ABTS用超純水定容至100 ml，配制成7 mmol/L的ABTS溶液，精密稱取0.0662 g過硫酸鉀用超純水定容至100 ml，配制成2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液。將100 ml 7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，避光靜置16 h，得到ABTS反應液，取1 ml ABTS反應液加入100 ml無水乙醇，用無水乙醇逐級稀釋該溶液至吸光值為0.70±0.02。

將3.9 ml ABTS反應液分別加入100 μl不同濃度的咳特靈溶液（A樣品）或乙醇溶液（A空白）在避光條件下反應30 min，在734 nm下測定其吸光值，根據(jù)以下公式計算去除ABTS自由基能力：清除率（%）=[（A空白-A樣品）/A空白]×100%[10-12]。

2.2.3對Fe3+還原能力的測定 ?2.5 ml的磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）+2.5 ml K3Fe（CN）6（1%）。將1 ml不同濃度的咳特靈溶液分別加入反應體系內，50℃水浴20 min。后加入2.5 ml 10%三氯醋酸，1000 r/min離心10 min。取上清夜2.5 ml加入到2.5 ml蒸餾水和0.5 ml 0.1%的FeC13體系中。反應10 min，在700 nm下測吸光值[13-16]。

2.2.4統(tǒng)計學方法 ?實驗數(shù)據(jù)用Excel 2016、Graph pad 8軟件進行分析，采用One way Anova進行差異性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異顯著。

2.3結果

2.3.1檢測波長的選擇 ?按“2.1.1”和“2.1.2”項下制備樣品溶液和對照品溶液，在波長300～500 nm范圍內進行波長掃描，樣品溶液和對照品溶液在510 nm處有最大吸收，故選擇檢測波長為510 nm。

2.3.2線性范圍 ?以OD（A）為縱坐標，蘆丁質量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。計算回歸方程為A=11.545C-0.0169。結果表明，蘆丁在8.40～50.40 μg/ml內線性關系良好，r2=0.9994。

2.3.3總黃酮含量的測定 ?廣東廠家咳特靈膠囊和片劑中總黃酮平均質量分數(shù)分別為11.45%和12.28%，廣西廠家咳特靈片劑中總黃酮平均質量分數(shù)為12.80%，21批有效期內咳特靈片劑和膠囊的平均總黃酮含量分別為12.57%、10.13%，具體結果見表1。

2.3.4咳特靈片（膠囊）對DPPH自由基的清除能力 ?由表1可知，21批有效期內咳特靈片劑和膠囊的DPPH自由基自由基清除率分別為77.44%、83.27%，除過期咳特靈片劑P10外，不同廠家的咳特靈片和膠囊對DPPH自由基均有良好的清除作用。

2.3.5咳特靈片（膠囊）對ABTS自由基的清除能力 ?21批有效期內咳特靈片劑和膠囊的ABTS自由基自由基清除率分別為54.51%、49.93%，咳特靈片（膠囊）質量濃度為0.09、0.18、0.36 mg/ml時抗氧化活性均低于Vc，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）（表2）。提示不同廠家的咳特靈片（膠囊）對ABTS自由基均有良好的清除作用，且對ABTS自由基清除能力隨著藥液濃度的增加而增強。

2.3.6咳特靈片（膠囊）對Fe3+的還原能力 ?FRAP法測定總還原力，通過抗氧化劑將Fe3+還原為Fe2+，使藍色鐵離子絡合物的色澤消褪，通過在593 nm下測定其OD，通過測定其OD的變化，可以反映其還原能力的大小?？忍仂`片（膠囊）的總還原力隨著樣品濃度的增大OD逐漸升高，即在實驗濃度范圍內，抗氧化能力隨著質量濃度的增加而增加，且相同濃度時抗氧化能力低于Vc（圖1）。21批有效期內咳特靈片劑和膠囊的Fe3+的還原能力分別為0.15、0.13。

3討論

3.1咳特靈片（膠囊）總黃酮含量

通過對4個省22批咳特靈片和膠囊總黃酮含量的測定，結果提示，廣東咳特靈膠囊廠家較多且總黃酮含量相對其他地區(qū)較高，廣西咳特靈片總黃酮含量相對廣東較高;過期的咳特靈片劑總黃酮含量最低。

3.2咳特靈片（膠囊）的抗氧化活性

抗氧化實驗結果提示，21批咳特靈片（膠囊）對ABTS自由基、DPPH自由基均具有一定的清除作用，且具有較強的還原力。在實驗濃度范圍內，咳特靈片（膠囊）去除DPPH和ABTS自由基的能力及總還原力隨著質量濃度的增加而增加，21批咳特靈中有15批DPPH自由基清除率超過80%，咳特靈片（膠囊）質量濃度為0.09、0.18、0.36 mg/ml時抗氧化活性與陽性組比較有顯著性差異，不同廠家的咳特靈片（膠囊）對ABTS自由基均有良好的清除作用，且對ABTS自由基清除能力隨著藥液濃度的增加而增強;其質量濃度為0.18 mg/ml時，對Fe3+還原能力較強。

綜上所述，咳特靈片（膠囊）在一定濃度范圍，隨著含量的增加，抗氧化活性增強。

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（收稿日期：2019-05-07 ?本文編輯：任秀蘭）