免疫熒光法在呼吸道病毒快速檢驗(yàn)中的應(yīng)用

(臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，山東 臨沂 276000)

目前，免疫熒光法已廣泛應(yīng)用于各類(lèi)病毒、細(xì)菌的檢測(cè)，具有較高的特異性和敏感性，且檢驗(yàn)速度快。現(xiàn)將其應(yīng)用于病毒種類(lèi)的快速鑒別體會(huì)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 檢測(cè)對(duì)象為2017年1月-2018年12月本院收治的200名上呼吸道感染患者，其中男130例，女70例；年齡3～78歲，平均(56.3±2.7)歲；感染部位：喉部40例，咽部78例，鼻部95例；并發(fā)癥：急性的心肌炎15例，腎炎12人例。

1.2方法

1.2.1試劑 病毒檢測(cè)試劑盒均采用了美國(guó)DHI公司產(chǎn)品，涵蓋了熒光標(biāo)志抗體、單克隆抗體形式的試劑盒，還有針對(duì)腺病毒、流感病毒以及副流感病毒等多種病毒的試劑盒，共計(jì)7種。

1.2.2檢測(cè)方式 標(biāo)本的收集和處理：首先，借助負(fù)壓吸引器對(duì)患者鼻、喉、咽等部位的分泌物進(jìn)行提取，通常2～3 ml便可，置于無(wú)菌生理鹽水之中。其次，對(duì)提取物進(jìn)行反復(fù)吹打后置于離心管中。第三，以500 r/min離心8 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液對(duì)沉淀物進(jìn)行洗滌并混勻，共洗滌3次，用0.5～1 ml、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖鹽溶液將最后一次離心的沉淀物溶解，并吹打成細(xì)胞懸液。將25 μl細(xì)胞懸液點(diǎn)入玻片點(diǎn)樣孔中，對(duì)點(diǎn)樣孔進(jìn)行風(fēng)干，并用冷丙酮進(jìn)行10 min的固定。

熒光染色：首先，于對(duì)照玻片樣孔對(duì)應(yīng)的細(xì)胞上滴加1滴相匹配的熒光抗體，約20 μl，并將其置于37℃保濕盒中進(jìn)行30 min的孵育。將1-7號(hào)樣孔中滴加相匹配的熒光標(biāo)志抗體作為陰性對(duì)照；將單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照；腺病毒、流感病毒等多種病毒試劑盒作為樣品孔。其次，用洗滌液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多次洗滌，然后再用蒸餾水實(shí)施洗滌，洗滌時(shí)間1 min。第三，待蒸餾水充分風(fēng)干后，通過(guò)玻片孔滴加封閉液，并蓋好蓋玻片，隨后借助熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。

1.3診斷原理和判斷依據(jù) 診斷原理：如果單克隆抗體(已經(jīng)被熒光標(biāo)志)和對(duì)應(yīng)抗原進(jìn)行結(jié)合，則會(huì)構(gòu)成復(fù)合物，借助熒光顯微鏡可以觀(guān)察到綠色熒光；若沒(méi)有被染色，便會(huì)被Evans藍(lán)染成紅色。判斷依據(jù)：若出現(xiàn)綠色熒光則表示為陽(yáng)性，若沒(méi)有熒光則表示為陰性；若顯微鏡放大至200倍時(shí)，觀(guān)察到超過(guò)2個(gè)熒光細(xì)胞便可斷定表針檢測(cè)是陽(yáng)性。

2 結(jié)果

200例患者中，175例檢測(cè)出病毒，其中呼吸道合胞病毒25例(占14.29%)，腺病毒50例(占28.57%)，副流感病毒1 12例(占6.86%)，副流感病毒2 11例(占6.26%)，副流感病毒3 9例(占5.14%)，流感病毒A 38例(占21.71%)，流感病毒B 30例(占17.14%)。

3 討論

對(duì)于微生物的常規(guī)檢驗(yàn)需要借助多層面綜合指標(biāo)，部分常規(guī)檢驗(yàn)?zāi)軌蛞揽可磻?yīng)來(lái)排除部分非病原性微生物，若此類(lèi)非病原性微生物在形態(tài)層面與病原微生物較為相似，則容易發(fā)生混淆。因此，必須借助快速分離，同時(shí)需要于試驗(yàn)時(shí)添加別的判定指標(biāo)。

免疫熒光檢測(cè)是臨床常用的方法，現(xiàn)已向著自動(dòng)化、器械化方向發(fā)展，如可借助脈沖激光光源、纖維熒光光度計(jì)或者是微型電腦等結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)[1]。因?yàn)闊晒饪贵w并不會(huì)使其生長(zhǎng)繁殖遭受影響，因此待孵育一段時(shí)間后除了要對(duì)其特異性進(jìn)行判定外，還應(yīng)選出“熒光菌球”來(lái)作鑒定試驗(yàn)[2-3]。此外，借助流式分析分離器(FACS)，能夠快速分離1000～5000個(gè)/s，從而為后續(xù)鑒定奠定基礎(chǔ)。但以免疫熒光行定量分析通常較為薄弱，若僅依靠目測(cè)對(duì)其特異性熒光進(jìn)行估定并不可取[4]。通常借助熒光顯微鏡可以對(duì)免疫熒光標(biāo)本帶展開(kāi)自動(dòng)掃描，速度能夠達(dá)到400步/s，距離則是0.25步。同時(shí)熒光信息可利用光電倍增管得到放大進(jìn)而輸入到圖像識(shí)別儀當(dāng)中來(lái)進(jìn)行參數(shù)測(cè)定分析，如對(duì)微粒周長(zhǎng)、圖形或者是熒光光度[5-6]。本研究用免疫熒光法對(duì)上呼吸道感染患者的分泌物進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)分泌物提取細(xì)胞，讓細(xì)胞標(biāo)本和相匹配的抗體間進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，來(lái)辨別相應(yīng)病毒種類(lèi)，結(jié)果十分準(zhǔn)確并且較為快速。同時(shí)，此方式僅需要在2h內(nèi)借助熒光顯微鏡、試劑盒等便可對(duì)病毒種類(lèi)等展開(kāi)快速鑒別，該方式較為簡(jiǎn)單并且十分廉價(jià)。

總之，推動(dòng)免疫熒光技術(shù)應(yīng)用至微生物的快速檢驗(yàn)當(dāng)中，即便有些操作仍伴有部分問(wèn)題，但相較于傳統(tǒng)形式而言，該技術(shù)優(yōu)勢(shì)顯著，隨著其不斷完善發(fā)展，將具備理想的應(yīng)用價(jià)值。