原發(fā)性膽汁性膽管炎中膽管上皮細胞損傷的機制研究進展

唐映梅, 余海燕

唐映梅, 余海燕, 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 云南省昆明市650101

核心提要：原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis,PBC)的關(guān)鍵步驟是靶向破壞膽管上皮細胞(biliary epithelial cells, BEC), 因此, 研究BEC的損傷機制是揭示PBC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵, 并且可為PBC尋找治療新靶點.

0 引言

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種自身免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)膽管上皮細胞破壞導(dǎo)致膽汁淤積的慢性肝病, 其自身免疫特征是高度特異性抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMAs)表達和自身反應(yīng)性T細胞的增殖[1]. 無特異性臨床表現(xiàn), 早期診斷困難.近年來PBC發(fā)病逐漸增多, 尤以女性患者居多, 中年婦女患病率為1.91-40.2/10萬[2]. PBC的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚, 在PBC動物模型中的研究[3]發(fā)現(xiàn), 自身免疫發(fā)生于具有環(huán)境觸發(fā)因素的遺傳易感宿主中, 環(huán)境損害(異生物質(zhì)或微生物), 最終打破肝臟耐受性. 人類PBC為多因素致病, 有研究[4-6]表明, 參與發(fā)病的包括遺傳傾向,環(huán)境因素, 病毒和細菌感染, 自身抗體, 失調(diào)的免疫功能, 趨化因子, 抗原呈遞細胞, 自噬, 衰老和細胞凋亡. 膽管上皮細胞(biliary epithelial cells, BEC)是PBC中免疫破壞的靶細胞, 故進一步研究PBC時BEC損傷機制, 有望闡明PBC的發(fā)病機制.

BEC具有膽汁吸收和分泌特性, 占肝臟細胞的一小部分(3%-5%)[7], 是膽道系統(tǒng)針對外來物質(zhì)的第一道防線, 膽道暴露于外來抗原, 在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[8], 積極參與肝臟中微生物誘導(dǎo)的促炎反應(yīng), 導(dǎo)致炎癥和感染性膽管病[9]. 而膽汁成分紊亂引起的BEC損傷可能是PBC發(fā)病的第一步[10]. 因此, 研究BEC的損傷機制是揭示PBC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵. 本文回顧了近年來PBC時BEC損傷機制的相關(guān)研究.

1 膽管上皮細胞損傷與免疫學(xué)機制

1.1 自身抗原暴露 PBC的特征是高滴度AMA, 肝臟中CD4+T和CD8+T細胞浸潤及靶向破壞BEC[11]. 免疫顯性自身抗原丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2亞單位(PDC-E2)的多譜系反應(yīng)是疾病發(fā)病機制的重要組成部分[12]. PDC-E2是AMA的靶標, PBC患者中, 一些PDC-E2的單克隆抗體在BEC頂端表面產(chǎn)生強的染色, 并在BEC頂端表面發(fā)現(xiàn)PDC-E2的部分內(nèi)部脂?；Y(jié)構(gòu)域, 而免疫顯性表位位于內(nèi)部脂?；Y(jié)構(gòu)域[13]. 此外, PBC患者中PDC-E2特異性IgA可通過多聚免疫球蛋白受體與BEC形成復(fù)合物,從而促進BEC的免疫病理學(xué)[14], 表明BEC的免疫調(diào)節(jié)作用在PBC的發(fā)生發(fā)展中起著積極作用.

1.2 TOLL樣受體介導(dǎo) Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)家族識別病原體相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular patterns, PAMPs), 在先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用, 人類膽管細胞表達多種TLRs[15]. 在BEC上TLRs依賴性NRas激活有助于促炎/增殖反應(yīng), 且表皮生長因子受體是TLRs誘導(dǎo)促炎過程的組成部分[9]. 有研究[16,17]發(fā)現(xiàn), PBC患者脂多糖(lipopolysachrides, LPS)釋放增多, LPS能改變單核細胞和BEC上TLR4, CD14和核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)的表達, 而BEC上具有識別PAMPs的TLRs, 可觸發(fā)NF-κB的激活和促炎介質(zhì)的釋放, 包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α), 白細胞介素(IL)-1β, IL-6和IL-8, 且γ-干擾素(IFN-γ)上調(diào)TLR2-5的表達,TNF-α上調(diào)TLR2的表達. 其次, TLR3通過NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatefactor 3, IRF3)在BEC中誘導(dǎo)趨化因子CCL5表達[18]. 因此, 在細胞因子、PAMPs細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)后, 導(dǎo)致BEC上表達的TLRs失調(diào), 進而參與肝內(nèi)膽管的先天免疫反應(yīng). 此外, TLR4刺激的自然殺傷(natural killer, NK)細胞對自體BEC具有高度細胞毒性, NK細胞的這種功能又與TLR3激活巨噬細胞合成IFN-α密切相關(guān)[19]. 故BEC受損與先天性免疫反應(yīng)的啟動密切相關(guān).

1.3 NK細胞介導(dǎo) NK細胞是機體重要的免疫細胞, 其介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)在PBC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用. Shimoda等[20]研究發(fā)現(xiàn), 在高NK / BEC比率下,NK細胞攻擊BEC, 導(dǎo)致受損BEC釋放自身抗原, 通過抗原提呈細胞激活自身反應(yīng)性T細胞; 在低NK/BEC比率下, NK細胞不直接損傷BEC, 而是通過NK細胞分泌的IFN-γ誘導(dǎo)BEC上主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類(major histocompatibility complex class-I, MHC-I)和Ⅱ類分子的表達, 導(dǎo)致自體反應(yīng)性CD4+T細胞破壞BEC. 此外, 活化的NKT細胞能導(dǎo)致BEC死亡[21]. 故NK細胞介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)可能在PBC的起始階段發(fā)揮重要作用.

1.4 凋亡誘發(fā) 凋亡細胞的清除對于組織止血和炎性病變的消退至關(guān)重要. BEC是非專業(yè)吞噬細胞, 但具有呈遞源自吞噬凋亡BEC的新型線粒體自身肽能力, BEC吞噬自體凋亡的囊泡后, 分泌趨化因子CCL2、CXCL8和IL-8, 獲取抗原呈遞細胞功能[22,23], BEC的這種吞噬自體凋亡作用可能促進了PBC的進展. BEC將PDC-E2轉(zhuǎn)移至凋亡小體, 從而產(chǎn)生一種凋亡體. PBC患者中巨噬細胞、AMA與BEC凋亡小體組成的獨特三聯(lián)體可導(dǎo)致炎性細胞因子的爆發(fā)[24]. 因此, BEC凋亡小體中的特定因子可能是導(dǎo)致PBC患者先天免疫反應(yīng)的因素. 有研究[25]表明, 半乳糖凝集素-3(galectin-3, Gal-3)是一種結(jié)合碳水化合物凝集素, 在炎癥性疾病和自身免疫中具有多種作用, 且在炎性破壞BEC中起保護作用. 故Gal-3可能是PBC中抗細胞凋亡的靶點.

1.5 其他免疫相關(guān)因素 BEC對細胞因子(IL-1β, TNF-α,IL-17和PAMPs)的反應(yīng)產(chǎn)生了一種吸引朗罕氏細胞的趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白-3α(Macrophage inflammatory protein3-α, MIP-3α), 朗罕氏細胞在膽管上皮周圍或內(nèi)部作為膽管周圍重要的抗原呈遞細胞, 向膽管的遷移與膽管周圍細胞因子環(huán)境和膽道先天免疫密切相關(guān)[26]. 另外, PBC肝臟中過表達的幾種促炎細胞因子(IL-8, IL-12,IL-17, IL-18和TNF-α)增強BEC上miR-506基因的表達,而miR-506在膽管細胞中能促進免疫激活[27].

黏膜相關(guān)恒定免疫T(mucosal-associated invariant T,MAIT)細胞是天然免疫樣T細胞, 肝臟浸潤性MAIT是具有活化效應(yīng)的記憶表型, 表達α4β7和IL-12, IL-18和IL-23的受體, 并對B細胞和BEC作出應(yīng)答. 此外, 其還表達T-bet和RORγt以及細胞因子IFN-γ, TNF-α和IL-17, 故MAIT細胞對人肝臟膽管上皮細胞免疫監(jiān)視效應(yīng)有重要作用[28]. 有研究[29]發(fā)現(xiàn), IL-33的增殖反應(yīng)依賴2型固有淋巴細胞(type-2 innate lymphoid cell, ILC2)數(shù)量的增加, 其釋放高水平的IL-13, 在小鼠膽管損傷模型中誘導(dǎo)IL-33/ILC2/IL-13回路可促進膽管細胞增生, 進而促進上皮修復(fù). 該信號通路激活可以改善膽道修復(fù), 故可能為PBC中BEC損傷的修復(fù)治療提供新思路.

2 膽管上皮細胞損傷與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是指活性氧和活性氮的產(chǎn)生與機體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除之間失衡, 包括超氧化物歧化酶, 過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等酶以及谷胱甘肽和維生素C/E等電子受體的非酶顆粒, 導(dǎo)致活性氧和活性氮產(chǎn)生過多, 造成機體組織細胞損傷[30]. 氧化應(yīng)激在多種肝臟疾病有重要作用, BEC可能是損傷的關(guān)鍵. PBC時,促炎細胞因子(IFN-β, IFN-γ和TNF-α)誘導(dǎo)BEC中的活性氧[31], 氧化應(yīng)激導(dǎo)致BEC再生或細胞周期停滯減少與進行性小膽管喪失密切相關(guān)[32]. 其次, 炎性細胞因子誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致BEC對化學(xué)誘導(dǎo)的細胞毒性的敏感性, 并且與抗氧化酶(醌氧化還原酶-1, NQO1)的抑制有關(guān)[31].

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衰老的BEC可以通過分泌各種衰老相關(guān)的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)(例如細胞因子和趨化因子)來調(diào)節(jié)膽管周圍的微環(huán)境.PBC時, 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)衰老表型, 衰老的BEC上CCL2和CX3CL1的表達增加[33,34]. Bmi1屬于polycomb組基因家族的轉(zhuǎn)錄受體, 損傷的小膽管中, 衰老的BEC對進行性膽管喪失至關(guān)重要, 氧化應(yīng)激引起bmi1表達下降導(dǎo)致BEC衰老是PBC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[35]. 有研究[36,37]發(fā)現(xiàn), 端?？s短是細胞衰老細胞的一個特征, 在PBC受損的小膽管BEC中存在端?？s短, 而氧化應(yīng)激損傷加速了端?？s短的速度, 故PBC受損膽管中的端?？s短表明端粒功能障礙可能是細胞衰老的觸發(fā)因素, 且與氧化應(yīng)激密切相關(guān).

人類PBC為多因素致病, 因此沒有單一模型可以完全模擬人類PBC的免疫病理生理學(xué). 有研究[38]發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)人的BEC中, 雌激素相關(guān)受體-α(estrogen-related receptor α, ERRα)被過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α, PGC-1α)激活, PGC-1α-ERRα軸誘導(dǎo)脂肪酸氧化, 脂肪酸的氧化磷酸化是新陳代謝的重要組成部分, 但會產(chǎn)生活性氧, 從而導(dǎo)致細胞受損和凋亡. 因此, 氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)BEC的能量代謝可能是導(dǎo)致BEC損傷的一個重要因素. 而氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators - activated receptor-γ, PPARγ)可以抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生, 其表達被IL-4(Th2-型)上調(diào), 被IFN-γ(Th1-型)下調(diào), 并且 PPARγ配體負調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB活化, 這些過程對維持肝內(nèi)BEC的穩(wěn)態(tài)起著重要的作用[39]. 因此, 氧化應(yīng)激可能是BEC損傷的致病因子, 是進一步加重PBC膽管病變的關(guān)鍵.

氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在機體的新陳代謝過程中起著重要的作用, 一旦這種協(xié)調(diào)與動態(tài)平衡產(chǎn)生紊亂與失調(diào), 就會引起一系列免疫功能降低. 有研究[40]發(fā)現(xiàn), 膽管中的脂質(zhì)過氧化與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-pi(GSTPi)的表達降低是導(dǎo)致PBC膽管損傷的重要病理過程. 解偶聯(lián)蛋白可以保護細胞免受氧化應(yīng)激,PBC時, BEC中解偶聯(lián)蛋白-2的表達增強具有特異性[41].其次, STAT3驅(qū)動富含脯氨酸小蛋白2a(small proline rich protein 2a, SPRR2a)的表達, 作為src同源3(src homology 3, SH3)結(jié)構(gòu)域的配體, SPRR2a可以抑制自由基, 并防止非腫瘤BEC中的氧化應(yīng)激和DNA損傷[42]. 3型1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, ITPR3)是BEC中最豐富的細胞內(nèi)鈣釋放通道, 也是膽管分泌碳酸氫鹽所必需的[43]. 氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2, Nrf2)能調(diào)節(jié)肝膽轉(zhuǎn)運蛋白的表達, 與ITPR3的啟動子結(jié)合, 抑制其在BEC中的表達, 導(dǎo)致鈣信號傳導(dǎo)和膽管分泌減少[43]. 故氧化應(yīng)激可能抑制這些過程導(dǎo)致BEC損傷. 但PBC時,參與氧化應(yīng)激損傷BEC的具體炎性細胞因子及信號通路尚不完全清楚, 進一步研究氧自由基反應(yīng)與抗氧化系統(tǒng)的作用機制可能會為PBC的治療尋找新靶點.

3 膽管上皮細胞損傷與自噬

自噬是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器, 并與溶酶體融合形成自噬溶酶體, 降解其所包裹的內(nèi)容物的過程,是維持細胞更新和穩(wěn)態(tài)的一個重要機制. 自噬若過度激活, 則可加重細胞損傷, 甚至導(dǎo)致細胞裂解和促進細胞死亡. PBC中, 在受損的小膽管中特異性地觀察到自噬及細胞衰老[44], 故自噬可能介導(dǎo)BEC的衰老過程, 并參與PBC膽管病變的發(fā)病機制. 有研究[45]發(fā)現(xiàn), p62是一種特異性自噬載體, PBC時BEC中p62與受損膽管的細胞衰老密切相關(guān), 且BEC中超微結(jié)構(gòu)觀察到自噬溶酶體的積累, 在培養(yǎng)BEC中敲低p62可以抑制細胞衰老及自噬.因此, p62與BEC自噬、細胞衰老過程密切相關(guān), 并且抑制p62可能為治療PBC提供了新思路.

其次, BEC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了PBC膽管上皮病變,并在失調(diào)的自噬和細胞衰老的發(fā)病機制中發(fā)揮作用[46].此外, PBC中細胞衰老涉及膽管反應(yīng)的病理生理學(xué), 膽管反應(yīng)的BEC中常見自噬, 且自噬可能先于膽管反應(yīng)的BEC的細胞衰老[47]. 因此, 自噬可能在介導(dǎo)BEC衰老過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用. 線粒體是自噬的主要靶標, PBC膽管上皮病變中線粒體抗原表達增加, 且與自噬的失調(diào)密切相關(guān), 自噬以及線粒體抗原的異常表達可能參與MHCⅠ類或Ⅱ類分子上的抗原呈遞, 從而導(dǎo)致BEC自身免疫介導(dǎo)的細胞毒性反應(yīng)[6]. 其次, PBC中, 失調(diào)的自噬可能是導(dǎo)致受損膽管中BEC與炎性細胞中線粒體蛋白表達增加的原因, 并且與PBC的發(fā)病機制有關(guān)[48].

自噬是目前研究的熱點之一, 但在PBC中的研究甚少. 自噬既可以作為一種防御機制清除胞質(zhì)內(nèi)受損細胞, 也作為一種細胞死亡程序誘導(dǎo)細胞主動死亡, 而BEC衰老過程涉及多個因素, 進一步深入研究自噬與BEC死亡、衰老的機制是闡明BEC損傷的關(guān)鍵, 進而有望尋找保護受損BEC的新靶點.

4 膽管上皮細胞損傷與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細胞向間充質(zhì)細胞的程序化轉(zhuǎn)換, 各種信號通路可激活 EMT參與若干生理功能和病理狀態(tài)[49].PBC患者LPS表達增高, BEC暴露于LPS或TGF-β1時,LPS或TGF-β1都可促進BEC中的EMT[50]. miR-200b是miR-200家族的一員. BEC中, miR-200b可抑制TGF-β1介導(dǎo)的EMT[51], 因此, PBC中細胞因子TGF-β1和LPS可能共同對BEC的病理學(xué)進展發(fā)揮作用.

PBC患者的肝臟和外周血中IL-17A表達升高, IL-17A在體外誘導(dǎo)了人肝內(nèi)膽管上皮細胞(IBECs)的EMT,故IL-17A在IBECs-EMT中起重要作用, IBECs-EMT和IL-17A介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可能是PBC早期的關(guān)鍵致病過程[52]. 但有研究[53]發(fā)現(xiàn), IL-6可以刺激EMT, 增強BEC的遷移能力, 并抑制人體肝內(nèi)BEC的凋亡, 從而延遲細胞衰老. Mizuguchi等[42]認為SPRR2a誘導(dǎo)BEC上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化, 進而促進傷口愈合.

這些研究為與BEC相關(guān)的EMT途徑提供了新的見解, EMT可能介導(dǎo)了PBC的起始過程, BEC中EMT可能會與不同信號通路刺激產(chǎn)生不同的作用機制, 由于BEC形態(tài)和功能的復(fù)雜性和多態(tài)性, 還需進一步探索EMT在PBC發(fā)生發(fā)展中的作用.

5 膽管上皮細胞損傷與易感基因

全基因組關(guān)聯(lián)分析和基因芯片等遺傳學(xué)研究在揭示PBC的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用.

PBC早期, 肝細胞膽堿攝取和磷脂酰膽堿合成失調(diào), 膽堿攝取相關(guān)的基因OCT1基因型可能影響PBC發(fā)病[10]. 多藥耐藥相關(guān)蛋白3(multidrug resistance associated protein 3, MDR3)是由位于7號染色體上的ABCB4/MDR3基因編碼的肝細胞小管膜蛋白, MDR3缺失導(dǎo)致膽汁磷脂的分泌減少, 從而引起膽汁成分紊亂, 導(dǎo)致膽管上皮損傷, 誘導(dǎo)細胞死亡和炎癥[54]. TBX3基因是調(diào)控生長發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因之一, 其缺失或突變會引起尺骨-乳腺綜合征, Tbx3在多能肝臟祖細胞中特異性表達,Tbx3缺失激活了BEC的分化程序, 從而引起肝臟發(fā)育異常[55]. 有研究[56]發(fā)現(xiàn), PBC中BEC上的基因表達譜人白細胞抗原DQα1(HLA-DQA-1), 癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1(CEACAM1), 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和血管細胞黏附分子1(VCAM-1)局部免疫應(yīng)答基因表達增加, 表明其可能參與了膽管損傷.

盡管遺傳易感基因的研究日益得到關(guān)注, 但其導(dǎo)致BEC損傷的具體機制尚不完全清楚. 我國人口基數(shù)龐大, 并且受到地域、飲食等方面的影響, 對PBC發(fā)病人群的遺傳因素研究具有一定的挑戰(zhàn)性, 為了達到早期診斷, 早期治療及靶向治療, 進一步研究PBC的易感基因等均具有重要的意義.

6 結(jié)論

膽管上皮細胞靶向破壞是PBC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟. 免疫學(xué)機制、氧化應(yīng)激、自噬、EMT、遺傳易感基因在BEC的損傷中起到重要作用.

自身免疫功能異常是導(dǎo)致BEC損傷的主要環(huán)節(jié). 氧化應(yīng)激、自噬和EMT都與細胞死亡及衰老相關(guān), 深入探索其導(dǎo)致BEC損傷的具體機制是研究的重點, 可能為闡明PBC的發(fā)生發(fā)展提供新思路. 但氧化應(yīng)激損傷BEC的具體炎性細胞因子及信號通路尚不完全清楚; 而自噬是一把雙刃劍; 研究不同信號通路激活的EMT在BEC中的作用機制可能會為治療PBC提供新見解. 對PBC發(fā)病人群的遺傳因素研究具有一定的挑戰(zhàn)性.

因此, BEC的損傷機制仍然是未來研究的重點, 也是提高PBC早期診斷率的關(guān)鍵、為PBC尋找治療新靶點提供理論基礎(chǔ).