茶黃素藥理功效及分離純化研究進(jìn)展

涂云飛

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016；2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016）

茶樹（Camellia sinensis）鮮葉可通過傳統(tǒng)的萎凋、揉捻及通氧“發(fā)酵”等工序制成紅茶。紅茶中茶黃素類 （Theaflavins，TFs）主要有4種化合物，即茶黃素（Theaflavin，TF）、茶黃素-3-單沒食子酸酯 （Theaflavin-3-Gallate，TF-3-G）、 茶黃素-3’-單沒食子酸酯 （Theaflavin-3’-Gallate，TF-3’-G）、茶黃素-3，3′-雙沒食子酸酯（Theaflavin-3，3’-Gallate，TF-3，3’-G），單體化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。茶黃素類可由茶鮮葉中對(duì)應(yīng)的兒茶素類（Catechins），即表兒茶素（Epi-Catechin，EC）偶聯(lián)表沒食子兒茶素 （Epigallo-Catechin，EGC），EC偶聯(lián)表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallo-Catechin Gallate，EGCG），表兒茶素沒食子酸酯（Epi-Catechin Gallate，ECG）偶聯(lián)EGC，ECG偶聯(lián)EGCG，并在多酚氧化酶酶促氧化條件下合成。

當(dāng)前世界茶葉貿(mào)易以紅茶為主，占茶葉總交易量的70%。茶黃素作為紅茶中一類具有苯駢罩酚酮結(jié)構(gòu)的多酚，最初是由ROBERTS等于1957年從紅茶提取物中分離鑒定，并因固體呈橙黃色而得名。茶黃素對(duì)人體具有廣普性藥理功效，并對(duì)紅茶的口感滋味及品質(zhì)高低起著十分重要的作用。因此，精制、富集、純化茶黃素亦成為紅茶深加工領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。文章就近年來茶黃素的藥理功效及分離純化研究現(xiàn)狀作總結(jié)與展望。

圖1 茶黃素類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Chemical structure of theaflavins

1 茶黃素的藥理功效

1.1 抗氧化

自由基（Free Radical，F(xiàn)R）學(xué)說認(rèn)為，正常人體內(nèi)的自由基與抗氧化物質(zhì)處于平衡狀態(tài)。當(dāng)人體器官和組織的細(xì)胞膜在自由基過量時(shí)便可能遭受其進(jìn)攻，引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA鏈斷裂、細(xì)胞解體、機(jī)體衰老，并可能誘發(fā)腫瘤等惡性疾病。體內(nèi)過量的超氧陰離子及雙氧水等，是產(chǎn)生毒副作用的重要因素。細(xì)胞中的主要抗氧化酶超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）能夠?qū)⒊蹶庪x子催化分解為雙氧水（Hydrogen Oxygen，H2O2），H2O2在過氧化氫酶（Catalase，CAT）或硒谷胱甘肽過氧化物酶 （Selenium-glutathione Peroxidase，Se-GSH-Px）催化作用下迅速轉(zhuǎn)化為無毒的O2和H2O。TFs具有良好的抗氧化性，如TFs可以清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化，提高SOD、谷光甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-Transferase，GST）、醌還原酶（Quinone Reductase，QR）的活性，增強(qiáng)人體免疫力。

在低密度脂蛋白 （Low Density Lipid，LDL）模型中，TFs能夠抑制二價(jià)銅離子介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化[1-2]。研究表明，巨噬細(xì)胞中LDL氧化程度與金屬離子濃度有關(guān)[3]，金屬離子濃度升高，LDL氧化程度也升高，而TFs能抑制LDL的氧化，這與它能螯合金屬離子有關(guān)。YOSHIDA等[4]和HAN等[5]用TFs類化合物分別處理鼠巨噬細(xì)胞和人內(nèi)表皮細(xì)胞，以考察細(xì)胞LDL氧化能力，結(jié)果顯示TFs能與脂質(zhì)氧合酶的活性中心鐵結(jié)合，從而降低脂質(zhì)氧合酶的活性，并抑制細(xì)胞LDL氧化。另外，TFs對(duì)外源性因子引起的生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有較好的效果。如持續(xù)高強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)會(huì)使肌肉酸痛腫脹，每天給予高強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)的男大學(xué)生1760 mg富含茶黃素的紅茶提取物，持續(xù)9天，發(fā)現(xiàn)其能夠緩解酸痛腫脹[6-7]，即茶黃素能夠提高肌肉損傷恢復(fù)能力并降低氧化應(yīng)激程度。

茶黃素作為天然植物多酚類成分，可形成氫自由基，淬滅體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，從而保護(hù)組織，起到延緩衰老、抗突變、抗癌、殺菌消炎、防治心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化等功能，故在醫(yī)藥領(lǐng)域得到人們廣泛關(guān)注。因此，加強(qiáng)茶黃素類成分抗氧化機(jī)理研究與臨床用藥的應(yīng)用顯得尤為迫切。

1.2 抗心腦血管疾病

心血管疾病是心臟和血管疾患的總稱，包括高血壓、冠心病、腦血管疾?。ㄖ酗L(fēng)）、周圍血管疾病、血栓性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、心臟病等。經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型、城市化、工業(yè)化及全球化帶來生活方式的改變，包括吸煙、缺乏活動(dòng)、不健康飲食是導(dǎo)致心血管疾病增加的重要因素。每年死于心血管疾病的人數(shù)多于其它任何病因，成為全球頭號(hào)死因。MARON等[8]設(shè)計(jì)了一種含有75 mg TFs、150 mg兒茶素和150 mg其他多酚的膠囊，給予240名18歲以上高膽固醇成年人群低脂飲食12周，且每日服用該膠囊。結(jié)果表明試驗(yàn)組能夠使總膽固醇及低密度脂蛋白分別降低11.3%和16.4%，高密度脂蛋白與甘油三酯增長2%左右，降脂效果優(yōu)于不含TFs的綠茶多酚膠囊。

茶黃素不僅通過抑制脂肪酸合成、激活脂肪酸的氧化消耗來降低脂肪積累，也通過肝激酶B（Liver Kinase B1，LKB1） 與活性氧途徑激活 5"—磷酸腺苷 （Adenosine 5"-Monophosphate，AMP）依賴的蛋白激酶（Activated Protein Kinase，AMPK）達(dá)到抑制乙酰輔酶A羧化酶，降低肝臟脂質(zhì)累積的作用[9]。在試驗(yàn)組與對(duì)照組在糞便量上沒有顯著差異的情況下，茶黃素能夠抑制高脂飲食肥胖鼠體重增加及內(nèi)臟脂肪累積[10]。茶黃素可以明顯抑制由膠原、ADP、 前列腺素 H2 （PGH2）/血栓素 A2（TxA2）（TP）受體激動(dòng)劑 U46619等多種刺激劑引起的人體血小板聚集[11]，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。茶黃素還是血小板非受體酪氨酸激酶 （Non-Receptor Cytoplasmic Tyrosine Kinases，SYK） 膠原引起的血小板活性的一個(gè)重要的靶點(diǎn)抑制劑，茶黃素組和對(duì)照組相比，小鼠腸系膜動(dòng)脈血管形成血栓性堵塞的時(shí)間明顯延長，充分證明了茶黃素對(duì)血小板功能的抑制，且優(yōu)于目前臨床使用的抗血小板藥物，如存在著出血、引起胃腸道不適等副作用的藥物阿司匹林。

1.3 抗炎癥作用

炎癥（Inflammation）是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng)，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙，包括感染引感染性炎癥及非感染性炎癥。任何能夠引起組織損傷的因素，如致炎因子（Inflammatory Agent）都可成為炎癥的原因。每日口服5 mg/kg劑量的 TF-3，3’-G能夠顯著改善三硝基苯磺酸（Trinitro Benzene Sulfonic Acid，TNBS） 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，降低結(jié)腸上皮粘膜腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素-12（Interleukin 12，IL-12）、人干擾素-g（Interferon-g，IFN-g）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 （Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）基因與蛋白表達(dá)水平[12]。 同時(shí)茶黃素能抑制佛波酯促使的TNF-α、白細(xì)胞介素 1β（Interleukin-1 beta，IL-1β）及白細(xì)胞介素 6（Interleukin 6，IL-6）的活性[13]。

TFs能夠有效阻止脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)，包括抑制IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白（Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1）、細(xì)胞間粘附分子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）的表達(dá)，并有效阻止LPS誘導(dǎo)的核因子抑制蛋白（Inhibitor of Nuclear Factor kappa B alpha，IκBα） 與核易位蛋白（Nuclear Translocation of REL-Associated Protein，RelA），胞外信號(hào)調(diào)控激酶（Extracellular Signal Regulated Kinase，ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun-N-Terminal Kinase，JNK）及 p38 絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，p38 MAPK）的表達(dá)[14]；在急性肺損傷小鼠模型中，TF-3，3’-G通過減少促炎因子降低急性肺損傷（Acute Lung Injury，ALI）， 抑制 LPS 誘導(dǎo)的 JNK及p38 MAPK絲裂原活化蛋白激酶的表達(dá)。

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 （Rheumatoid Arthritis，RA）或骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）最明顯的特征是關(guān)節(jié)軟骨的損傷。引起關(guān)節(jié)損傷和疼痛的IL-1β和IL-18在RA和OA中促炎癥因子發(fā)揮重要作用。在IL-1β誘導(dǎo)建立的OA細(xì)胞模型中，TF-3，3’-G能夠明顯改善OA軟骨細(xì)胞形態(tài)，上調(diào)軟骨細(xì)胞分子標(biāo)志物 II型膠原（Type II Collagen，Col II）mRNA的表達(dá)，還可以下調(diào)炎癥因子IL-1β與IL-6 mRNA的表達(dá)，降低炎癥誘導(dǎo)酶環(huán)氧化酶（Cyclooxygenase-2，COX-2）蛋白表達(dá)量；并可增強(qiáng)軟骨細(xì)胞合成因子活性、減弱分解因子活性并抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，有效延緩大鼠軟骨細(xì)胞炎性退變進(jìn)程[15]。

同時(shí)，茶黃素還可顯著下調(diào)由血管緊張素II（Angiotensin II，AngII）誘導(dǎo)的促炎因子 IL-6 mRNA的表達(dá)，降低由AngII刺激產(chǎn)生的大鼠血管平滑肌細(xì)胞（Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC）中ROS水平，達(dá)到抵抗AngII引起的大鼠VSMC細(xì)胞炎癥作用[16]。

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）的突出特征是慢性炎癥致氣道阻塞，引起不完全可逆的氣流受限，從而引發(fā)一系列臨床癥狀。以往的研究表明，氣道黏液高分泌是導(dǎo)致氣流受限的危險(xiǎn)因素。在刺激氣道的各種炎性因子中，中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶（Neutrophil Elastase，NE）被認(rèn)為是肺炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終效應(yīng)分子，以及炎癥氣道微生態(tài)平衡的重要惡化性推動(dòng)因素[17]，茶黃素被證明能夠起到抑制氣道黏液高分泌的作用。此外以高頻霧化的方式使大鼠吸入茶黃素乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly Lactic Co Glycolic Acid，PLGA）納米粒，能夠抑制香煙引起的炎性氣道黏蛋白 （Mucoprotein 5AC，MUC5AC）高分泌作用[18]。

1.4 抗病毒與抗菌作用

嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS）由 SARS 冠狀病毒引起，該病毒屬于包膜病毒，包含正極性單鏈RNA，其所含有的一個(gè)開放的閱讀框用于編輯兩個(gè)重疊的多聚蛋白，PP1a（Polyprotein-1a，450 kDa）與PP1ab（Poplyprotein-1ab，750 kDa）負(fù)責(zé)病毒的復(fù)制。同時(shí)冠狀病毒都編輯生成Papline類似蛋白及胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin，3CLPro）類似蛋白，用于病毒成熟過程中蛋白水解加工。Papline類似蛋白水解酶在PP1a蛋白上只含不超過2個(gè)的剪切位點(diǎn)，而3CLPro蛋白酶在PP1a與PP1ab內(nèi)在區(qū)域含有至少11個(gè)剪切位點(diǎn)。在720個(gè)篩選的天然化合物中僅發(fā)現(xiàn)TF-3，3’-G能夠有效抑制3CLPro[19]。并且SARS冠狀病毒在胃腸道中的復(fù)制非?；钴S，紅茶中的茶黃素類化合物具有預(yù)防該病毒對(duì)人體的侵染的應(yīng)用潛力。

1%的乳酸（pH4.0）能顯著抑制對(duì)于單純性1型與2型皰疹病毒所引起的生殖器潰瘍，但當(dāng)pH＞4.5時(shí)，則失去抑制活性狀態(tài)。茶黃素特別是TF-3，3’-G 能夠在 5.7＞pH＞4.5 區(qū)間獨(dú)立發(fā)揮作用[20]，并在非洲綠猴腎細(xì)胞及人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中得到驗(yàn)證[21]。同時(shí)茶黃素還能夠抗流感病毒[22]，通過與血凝素HA2亞基結(jié)合，抑制病毒的神經(jīng)氨酸酶活性從而抵抗高致病性禽流感（H5N1）病毒[23]的感染。并且，TFs可作為第二代殺微生物劑用于預(yù)防人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）的性傳播，在高濃度時(shí)，還能抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性[24]。

白念珠菌（C.Albicans）是一種腐物寄生菌[25]，作為機(jī)會(huì)性條件致病菌，平時(shí)生存于人體的皮膚、粘膜、消化道及其他臟器中。當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，白色念珠菌就會(huì)繁殖，達(dá)到一定量時(shí)，人體就會(huì)發(fā)病，通過微感染而引起的粘膜念珠菌病，對(duì)癌癥、HIV及重癥病人還會(huì)造成致命性打擊。茶黃素對(duì)白念珠菌NCTC 3255和NCTC 3179能夠起到很強(qiáng)的抑制作用，其最低抑制濃度為1024 μg/mL，聯(lián)合兒茶素時(shí)其最低抑菌濃度降為128 μg/mL。

1.5 抗腫瘤

癌癥與原癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有著密切的關(guān)系。TF-3，3’-G能夠通過溶酶體途徑有效降低原癌基因絲裂原活化蛋白激酶 （Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）及絲蘇氨酸蛋白激酶（Serine/threonine-protein kinase，Raf-1） 總量，10 μM TF-3，3’-G就能起到體外抑制由磷酸化絲裂原活化蛋白激酶磷酸化的細(xì)胞核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子（p44 MAP kinases Ets-like protein 1，Elk-1）的作用，提示飲用含有TFs的紅茶對(duì)癌癥有預(yù)防作用[26]。同時(shí)，表皮生長因子在腫瘤中具有重要的促進(jìn)作用，TF-3，3’-G誘導(dǎo)表皮生長因子受體內(nèi)吞與降解作用，激活表皮生長因子受體泛素化與酪氨酸激酶活化，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖作用，下調(diào)表皮生長因子EGFR在JB6 Cl41細(xì)胞中的表達(dá)[27]。

在肝癌細(xì)胞體外處理中，茶黃素類化合物能夠通過抑制STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子磷酸化，并進(jìn)一步阻止其下游抗凋亡蛋白BCL-2與生存素（Survivin）及入侵相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9來達(dá)到顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移、入侵的作用，誘使其凋亡[28]。此外，茶黃素類化合物對(duì)人類白血病細(xì)胞系HL-60與K-562呈劑量依賴性抑制，阻止細(xì)胞于G1期，活化Caspase 3和Caspase 8，下調(diào)BCL-2，同時(shí)上調(diào)BAX蛋白[29]。

同時(shí)，TF-3，3’-G顯著降低由雄激素應(yīng)答引起的人前列腺癌細(xì)胞LNCaP生長，抑制雄激素受體（Androgen Receptors，AR），降低雄激素誘導(dǎo)的前列腺特定抗原分泌及脂肪酸合成蛋白水平[30]。在乳腺癌小鼠模型中，每天給予0.05%的紅茶提取物能夠使其瘤體積變小（減小40%～42%），使剪切活化的Caspase 3水平增高，凋亡率增加，并活得更長[31]。在卵巢癌模型中，TF-3，3’-G通過上調(diào)p27，下調(diào)CyclinD1、CDK4和p-Rb蛋白水平誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，推測(cè)Notch-1、Chk2、p27作為雙酯型茶黃素的靶點(diǎn)，參與其抗癌作用[32-33]。

對(duì)于毒性化學(xué)試劑誘導(dǎo)的癌癥，茶黃素也有預(yù)防與治療作用。當(dāng)小鼠口腔長期暴露于N-亞硝基二乙胺 （N-nitrosodiethylamine，NDEA）類化合物，不僅體重降低，而且會(huì)誘導(dǎo)口腔癌與肝癌。在其癌癥發(fā)展過程中，茶黃素能精密、嚴(yán)格調(diào)控被化學(xué)試劑誘導(dǎo)而自動(dòng)更新調(diào)整的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，Hh/Gli1路及相關(guān)的G1/S-特異性周期蛋白-CyclinD1，cMyc及伴隨下調(diào)上皮型鈣黏附蛋白（E-cadherin）EGFR 基因表達(dá)[34]。 另外，TFs能夠阻止具有致癌性的二噁英類化合物與細(xì)胞中芳香烴受體（Aryl Hydrocarbon Receptor，AhR）結(jié)合，并進(jìn)一步阻止其與對(duì)應(yīng)的DNA位點(diǎn)結(jié)合[35]，達(dá)到預(yù)防作用。

1.6 茶黃素其它藥理功效

在氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的小鼠高尿酸血癥動(dòng)物模型中，10 mg/kg茶黃素可明顯降低血清尿酸水平與LDL水平；相比別嘌醇，其對(duì)腎臟并無明顯損傷作用。茶黃素能分別升高鈉磷共轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白4（Sodium-Phosphate Transporter 4，NPT4）、 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 9（Glucose Transporter 9，GLUT9）及尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1 （Uric acid transporter 1，RAT1）的mRNA表達(dá)水平，可降低有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（Organic Anion Transporter 1，OAT1）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體 2（Organic Anion Transporter 2，OAT2）及鈉氫交換調(diào)節(jié)因子3（Na+/H+Exchanger Regulatory Factor 3，NHERF3/PDZK1）表達(dá)；同時(shí)茶黃素還能夠降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸，其降低血清尿酸作用[36]與抑制黃嘌呤氧化酶活性、調(diào)節(jié)相關(guān)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA及其蛋白表達(dá)水平相關(guān)。

另一方面，將TF-3，3’-G負(fù)載于納米修飾羥基磷灰石 （Nano Modified Hydroxyapatite，Nano-HAp）上，能夠促進(jìn)大鼠股骨缺損修復(fù)[37]，且低濃度的TF-3，3’-G微球顆?？纱龠M(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）增殖及成骨因子和成血管因子的基因表達(dá)，及誘導(dǎo)成骨基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone Morphogenetic Protein 2，BMP-2）信號(hào)通路，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）信號(hào)通路中的ERK途徑與p38途徑參與BMSCs成骨分化的過程。另外，大劑量使用糖皮質(zhì)激素容易引起股骨頭壞死，激素性股骨頭壞死采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)上聯(lián)合茶黃素治療效果理想[38]，建模后4～8周空骨陷窩陽性數(shù)顯著少于其他對(duì)照組。

2 茶黃素的富集純化技術(shù)

2.1 茶黃素的富集技術(shù)

化工、核能與制藥等工業(yè)的發(fā)展促使分離技術(shù)的發(fā)展，其中吸附性分離是通過吸附劑選擇性物理吸附氣體或液體中的目標(biāo)分子，達(dá)到分離純化的目的。大孔吸附樹脂主要是以苯乙烯、二乙烯苯為原料合成的一種內(nèi)部呈交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的新型非離子型高分子聚合物吸附劑，粒度為20～60目，具有比表面積大，在天然產(chǎn)物的富集純化方面已得到了廣泛應(yīng)用。屠幼英公開了一種從紅茶色素溶液中分離高純度茶黃素的方法發(fā)明專利[39]，該專利以大孔吸附樹脂 AB-8、NKA-9或 Mitsubishisp-207為分離介質(zhì)，并以20%～60%乙醇水溶液為洗脫溶液，分離制備得到高純度茶黃素。徐懿等[40]進(jìn)一步比較了 AB-8、NKA-9、SP-207 三種樹脂對(duì)茶黃素的吸附與解析率，發(fā)現(xiàn)這3種樹脂中AB-8對(duì)茶黃素的吸附作用最好，SP-207的吸附率約為47%，但是其特點(diǎn)是洗脫劑乙醇幾乎可以全部解析被吸附的茶黃素。

郁軍等[41]比較了3種不同極性的大孔吸附樹脂NKA-9、AB-8和ADS-7對(duì)茶黃素的吸附純化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶黃素單體純度與純化條件密切相關(guān)。賈振寶等[42]亦以紅碎茶為原料，比較了不同大孔吸附樹脂對(duì)茶黃素的吸附與解析能力，發(fā)現(xiàn)HPD-300樹脂對(duì)茶黃素有較高的吸附與解析能力，茶黃素的純度由18.4%提高到67.2%[43-44]（純度由比色法測(cè)定），回收率達(dá)到73.7%。

2.2 茶黃素的單體制備技術(shù)

茶黃素單體最初是由ROBERTS等利用紙層析的方法制備鑒定，后來DAVIS等[45]用凝膠SephadexLH-20作為載體并以乙醇洗脫，獲得茶黃素單體，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析。LEUNG等[46]先利用硅膠粗分茶黃素后，再利用70%的乙醇進(jìn)行凝膠SephadexLH-20洗脫以獲取其單體組分。凝膠SephadexLH-20適合茶黃素、茶黃素單沒食子酸酯及茶黃素雙沒食子酸酯的分離，但對(duì)于茶黃素單沒食子酸酯中的同分異構(gòu)體的拆分效率較低。同時(shí)，中國專利[47]公布了一種以微晶纖維素和低取代度羥丙基纖維素先富集茶黃素再用Sephadex LH-20 凝膠， 實(shí)現(xiàn)茶黃素 TF、TF-3-G、TF-3’-G及 TF-3，3’-G 有效分離。

利用高速逆流色譜[48]也能夠?qū)崿F(xiàn)分離純化，TF、TF-3-G、TF-3’-G 及 TF-3，3’-G 單體組分，其所采用的溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-正己烷-甲醇-水（3∶1∶1∶6，v/v）。 相對(duì)于 Sephadex LH-20 柱色譜法，高速逆流色譜法無不可逆吸附，不會(huì)對(duì)體系造成污染。WANG等[49]進(jìn)一步在該體系中添加乙酸并以正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸（1∶5∶1∶5∶0.25，v/v）進(jìn)行高速逆流色譜運(yùn)行500 min后一次性獲得了四種茶黃素單體，純度均達(dá)到90%以上。另外，發(fā)明專利[50]采用了凝膠柱層析和高速逆流色譜相結(jié)合的方法，從紅茶提取物中大批量分離制備四種高純度茶黃素單體的方法。以乙醇或丙酮作為凝膠色譜的洗脫劑，以烷烴-脂肪酸酯-脂肪醇-水組成的高速逆流色譜分離體系，可從茶黃素粗提物中分離制備10 g以上的茶黃素單體，產(chǎn)品純度在97%以上。

另外，近年來中低壓色譜[38]也應(yīng)用到茶黃素單體的分離當(dāng)中。謝練武等[51]以茶黃素混合物為原料，通過二醇基鍵合（diol）硅膠制備色譜分離純化獲得高純度（純度＞95%）的 TF（95.6%）、TF-3-G（95.2%)、TF-3’-G（99.8%）和 TF-3，3’-G（96.3%）四種單體。與此同時(shí)，林丹[52]以自制茶色素（茶黃素含量65.2%）為原料，應(yīng)用中壓色譜MPLC方法對(duì)茶黃素進(jìn)行分離純化，實(shí)現(xiàn)了在190 min內(nèi)TF、TF-M-G及TF-3，3’-G三種茶黃素純品的制備，純度分別為92.6%，98.9%，98.7%；三種茶黃素純品得率51.5%，總回收率達(dá)79.0%。進(jìn)一步優(yōu)化條件后，以550 min分離一次得到四種主要茶黃素單體， 純度分別為 92.6%（TF)，96.5%（TF-3-G），94.8%（TF-3’-G），98.7%（TF-3，3’-G）；四種茶黃素單體得率為53.5%，總回收率達(dá)82.1%。市場(chǎng)上，茶黃素粗品中以TF-3，3’-G含量較為豐富，而其它三種單體含量較低為特點(diǎn)。高速逆流色譜及中低壓色譜近年來隨著技術(shù)的進(jìn)步也逐步走向工業(yè)化生產(chǎn)當(dāng)中，制備茶黃素單體時(shí)，可利用高速逆流色譜聯(lián)合Sephadex LH-20凝膠色譜柱、硅膠柱聯(lián)合Sephadex LH-20凝膠色譜柱對(duì)其進(jìn)行初步的精制或硅膠柱層析純化。

3 展望

茶黃素作為紅茶中含有苯駢罩酚酮結(jié)構(gòu)的功能活性多酚類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗流感病毒及HIV病毒，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，保護(hù)心腦血管等獨(dú)特的作用；并對(duì)紅茶茶湯的口感滋味及品質(zhì)功效起著積極的作用，目前已受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。精制富集純化茶黃素成為茶葉深加工領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，當(dāng)前富集茶黃素的技術(shù)手段主要為大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂現(xiàn)雖已被廣泛應(yīng)用于茶黃素、黃酮、皂苷、生物堿類等天然化合物的富集純化中，但大孔吸附樹脂一般會(huì)殘留危害人體的致孔劑，長期使用過程中樹脂降解產(chǎn)物也會(huì)對(duì)產(chǎn)品造成安全隱患。另一方面，茶黃素制備過程所涉及的工藝路線長，耗時(shí)多，茶黃素制備過程易氧化且制量少，讓一般研究工作者望而退步。尋求利用高性價(jià)比，且對(duì)生態(tài)環(huán)境無污染的綠色化、可再生性吸附材料富集制備高純度茶黃素類化合物，將會(huì)對(duì)茶葉精深加工及其醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響。