速溶茶中草甘膦殘留量的測定方法及殘留狀況研究

林柃敏 ，孔俊豪 ，郝秦鋒 ，王朝武，石長燕 ，林志偉 ，陳宇 ，陳宏坤 *

（1.大閩食品（漳州）有限公司，福建漳州 363005；2.海西茶葉深加工研究所，福建漳州 363005）

草甘膦（Glyphosate）又稱草干膦、膦苷酸、鎮(zhèn)草寧、農(nóng)達，化學名稱為N-磷酸甲基甘氨酸，分子式為C3H8NO5P，純品為白色固體，無臭、不揮發(fā)，常溫儲存穩(wěn)定[1-2]。可利用亞磷酸二烷基酯法、氯甲基磷酸法和亞氨基二乙酸法等方法制得[3-5]。草甘膦是目前世界上使用量最大的除草劑之一，廣泛應用于抑制農(nóng)田或非耕作用地中的一年生或多年生雜草生長。經(jīng)研究證實，草甘膦及其代謝物可能具有致畸作用，對生物的遺傳、發(fā)育和生育都有一定的毒副作用[2，6]。因此，很多地區(qū)對草甘膦的使用做出限制，并將其在食品中的殘留限量列入相關(guān)法規(guī)和標準中。國家標準GB 2763—2019規(guī)定草甘膦在茶葉中的最大殘留限量是1.0 mg/kg[7]。

根據(jù)中華人民共和國輕工行業(yè)標準QB/T 4067—2010規(guī)定，速溶茶是以茶葉或鮮茶葉為主要原料，經(jīng)水提取或采用茶鮮葉榨汁，可在生產(chǎn)過程中加入食品添加劑和食品加工助劑，加工制成的，作為食品、飲料等原輔料的固體產(chǎn)品[8]。草甘膦作為一種水溶性農(nóng)藥，不可避免地會在速溶茶的加工過程中，由茶葉遷移、富集至速溶茶中。事實上，已有資料表明殘留在農(nóng)作物上的草甘膦會遷移至終端食品，有報告顯示，德國市售的14種啤酒中，草甘膦含量為 0.46～29.74 μg/L，而德國飲用水中的草甘膦最高殘留限量為0.1 μg/L，所以推測德國啤酒中的草甘膦來源于生產(chǎn)原料中的大麥和啤酒花。在速溶茶的生產(chǎn)實踐中也發(fā)現(xiàn)，采用符合GB 2763—2019要求的茶葉原料制成的速溶茶產(chǎn)品，草甘膦含量也經(jīng)常超出1.0 mg/kg[6，9]。

目前，我國尚未對速溶茶中的農(nóng)藥殘留限值制定標準。文章建立了速溶茶中草甘膦殘留的檢測方法，測定了茶葉原料和速溶茶中草甘膦的殘留量，從而為將來制定我國速溶茶農(nóng)殘標準提供參考。

1 材料與方法

由于草甘膦屬水溶性物質(zhì)，可隨茶葉經(jīng)過萃取、過濾、濃縮、干燥的工藝流程，最終傳遞至速溶茶中。因此萃取條件（溫度、時間、茶葉碎度、料水比）、過濾條件（有/無膜澄清處理）等影響速溶茶得率的因素都可能會影響草甘膦在速溶茶中的含量。由于試驗樣品及數(shù)據(jù)全部從自有生產(chǎn)線采集而來，因此受到生產(chǎn)設(shè)備和效率的限制，試驗茶葉萃取時間設(shè)定為30 min，料水比都設(shè)定為1∶15。

1.1 材料及儀器

1.1.1 試驗材料

試驗選取草甘膦陽性樣品，但殘留量低于GB 2763—2019限量要求的紅茶、綠茶、烏龍茶等合計30批次，及其對應的速溶茶產(chǎn)品進行檢測。紅茶主要產(chǎn)自云南，綠茶主要來自福建、浙江、安徽、陜西產(chǎn)區(qū)，烏龍茶為福建產(chǎn)區(qū)。茶葉碎度為過7目篩。

1.1.2 試劑耗材

色譜純乙腈、甲醇、丙酮，分析純硼酸鈉，20%氫氧化鉀溶液，0.3 mol/L鹽酸溶液，酸度調(diào)節(jié)劑（稱取16 g磷酸二氫鉀于160 mL水中，加入13.4 mL鹽酸和40 mL甲醇，混勻），CAX洗脫液（分別量取 160 mL水，2.7 mL鹽酸和40 mL甲醇，混勻），1.0 g/L FMOC-CI丙酮溶液 （稱取 100 mg FMOC-CI，用丙酮溶解并定溶至100 mL），CAX陽離子交換柱：AG 50W-X8 （200 目～400 目），0.8 cm×4 cm。

1.1.3 試驗儀器

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（Waters，Xevo TQ MS）、多功能臺式冷凍離心機（BECKMAN COULTER，Allegra X-22R）。

1.2 生產(chǎn)線產(chǎn)能及工藝流程

生產(chǎn)線每日投料（茶葉量）約80～90噸，可生產(chǎn)速溶茶粉約為15～25噸。速溶茶的生產(chǎn)工藝一般包含萃取、澄清、濃縮、殺菌、干燥、包裝等過程，具體流程如圖1所示。

圖1 速溶茶生產(chǎn)工藝流程圖Fig.1 Flow chart of instant tea production process

1.3 樣品前處理

1.3.1 速溶茶樣品前處理

準確稱取1 g速溶茶樣品 （精確到1 mg）于50 mL的離心管中，加入10 mL沸水，待樣品全部溶于水后，超聲提取10 min，再振蕩提取5 min。將提取液放入離心機10000 rpm/min離心5 min，吸取4.5 mL上清液至50 mL離心管中，加入0.5 mL酸度調(diào)節(jié)劑，混勻。草甘膦檢測所采用的方法參照SN/T 1923—2007《進出口食品中草甘膦殘留的檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》。試樣用水提取，經(jīng)陽離子交換柱（CAX）凈化，與9-芴基甲基三氯甲烷（FMOC-CI）衍生反應后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量（內(nèi)標加量0.5 mg/kg）。

1.3.2茶葉樣品前處理

茶葉原料樣品粉碎過20目篩后，準確稱取1 g（精確到 1 mg），于 50 mL的離心管中，加入 10 mL沸水，超聲提取10 min，再振蕩提取5 min，后序操作步驟同上。采用內(nèi)標法定量。

1.4 液相色譜和質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱為安捷倫Rapid Resolution HDC18柱，150 mm×2.1 mm，5 μm； 流動相梯度洗脫程序見表 1。流速為 200 μL/min；進樣量為 30 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子模式；檢測方式為多反應監(jiān)測MRM；霧化氣、窗簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣；使用前應調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求；噴霧電壓（IS）、霧化氣壓力（GSI）、氣簾氣壓力（CUR）、輔助氣流速（GS2）、去集簇電壓（DP）、碰撞能等電壓（CE）值應優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

內(nèi)標和樣品的LC-MS譜圖如圖2所示，該方法可較好地分離樣品中的草甘膦，且草甘膦的保留時間在2.4 min左右。

2.2 草甘膦檢出限、回收率和精密度分析

圖3為0.1 mg/kg的草甘膦信噪比圖譜，在0.1 mg/kg添加水平下進行回收率試驗，此時茶葉原料/速溶茶的PMG-FMOC信噪比大于10，因此檢測限定為0.1 mg/kg。

在速溶茶樣品中添加草甘膦標樣，計算速溶茶中的草甘膦回收率和精密度，結(jié)果如表2所示。經(jīng)統(tǒng)計，速溶茶中的草甘膦平均回收率為77.70%，精密度RSD為2.50%。

表2 速溶茶中的草甘膦回收率和精密度記錄表Table 2 Recovery and precision records of glyphosate in instant tea

2.3 草甘膦標準曲線的繪制

將草甘膦標準衍生液精確稀釋至濃度梯度為0.2、0.4、0.8、2.0、3.0 μg/g 的標準工作液， 分別進行上機檢測，結(jié)果如圖4所示，草甘膦的濃度在0～3.0 μg/g范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。線性方程為y=0.503×x－0.002，其中y為相對靈敏度，x為進樣濃度，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，能夠滿足定量檢測的要求。

圖2 草甘膦衍生產(chǎn)物（PMG-FMOC）的LC-MSMS譜圖Fig.2 LC-MSMS spectra of glyphosate derivatives(PMG-FMOC)

3 速溶茶及其茶葉原料草甘膦含量狀況

研究總共檢測了30批茶葉原料及對應批次速溶茶產(chǎn)品的草甘膦含量，結(jié)果如表3所示，有3批的茶葉原料未檢測出草甘膦，茶葉原料草甘膦的含量低于0.76 mg/kg，速溶茶中草甘膦殘留量在2.20 mg/kg以下，全都符合美國法規(guī)《Tolerances and Exemptions for Pesticide Chemical Residues in Food》（編號：40CFR 180） 中對草甘膦的限值（速溶茶為7 mg/kg，茶葉1 mg/kg）。此外，結(jié)果表明在速溶茶加工的過程中草甘膦都有不同程度的富集，最大富集倍數(shù)達5.92倍，最小富集倍數(shù)為1.74倍。

目前，我國尚未對速溶茶中的農(nóng)藥殘留限值制定標準。我國應廣泛收集速溶茶中草甘膦富集的數(shù)據(jù)資料，結(jié)合實驗室研究，應用監(jiān)測和調(diào)查，進一步完善速溶茶中草甘膦安全標準與治理控制措施。此外，針對速溶茶中草甘膦的代謝物氨甲基膦酸（AMPA）的殘留，可進行更深入的探索。

圖3 0.1 mg/kg的草甘膦信噪比圖譜Fig.3 Signal to noise ratio of glyphosate at 0.1 mg/kg

圖4 草甘膦回收率的標準工作曲線圖Fig.4 Standard operating chart of glyphosate recovery

表3 茶葉原料和速溶茶中草甘膦的含量Table 3 Content records of glyphosate in tea raw materials and instant tea