小豆不定芽誘導及再生體系的建立

林建輝 陸玉建 張永磊 李震 朱麗暉 石東里

摘要：以小豆（Vigna angularis）下胚軸為外植體，分析影響小豆不定芽誘導及植株再生的因素，建立高效穩(wěn)定的小豆離體再生體系。結(jié)果表明，小豆不定芽誘導最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA;生根最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：小豆（Vigna angularis）;胚軸;不定芽;生根;再生

中圖分類號：S521 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0236-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.057 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Adventitious buds induction of Vigna angularis and establishment of

the regeneration system

LIN Jian-hui，LU Yu-jian，ZHANG Yong-lei，LI Zhen，ZHU Li-hui，SHI Dong-li

（1.College of Biological and Environmental Engineering，Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603，Shandong，China）

Abstract： In this study， the hypocotyls were used as explants to analyze the factors that affected the adventitious bud induction and plant regeneration of Vigna angularis. An attempt was made to establish an efficient and stable regeneration system of Vigna angularis. The results showed that the optimal medium for the induction of adventitious buds was MS+2.0 mg/L 6-BA， and the optimum medium for rooting was 1/2MS+0.5 mg/L IBA. By analyzing the factors affecting the regeneration of Vigna angularis in vitro.

Key words： Vigna angularis; hypocotyl; adventitious bud; rooting; regeneration

小豆（Vigna angularis）又名赤豆、紅豆、紅小豆，為豆科（Leguminosae）豇豆屬（Vigna）一年生草本植物，起源于中國，已有2 000多年的栽培歷史[1，2]。小豆營養(yǎng)價值豐富，富含多種氨基酸和維生素，蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，是理想的高蛋白、低脂肪食品[3]。小豆子粒鐵含量豐富，是傳統(tǒng)的補血食物[4]。此外，小豆中還含有較多的萜類、異黃酮、皂角甙等生物活性物質(zhì)，具有較高的藥用價值[5]。小豆廣泛分布于全國各地，其耐瘠薄、抗干旱、適應(yīng)性強，是逆境條件下優(yōu)勢雜糧作物[6，7]。不同品種小豆對干旱脅迫的響應(yīng)存在差異[8]，用PEG處理小豆幼苗，小豆葉片中 MDA和可溶性蛋白含量、SOD活性均發(fā)生明顯的變化[9]。缺Fe脅迫降低了小豆幼苗葉片的葉綠素含量及光合速率，增加了小豆幼苗根系呼吸速率及Fe3+還原酶活性[10]。利用現(xiàn)有種質(zhì)資源，選育優(yōu)質(zhì)新品種已成為當前小豆研究的重點。隨著分子生物學的快速發(fā)展，基因工程技術(shù)已成為快速高效改良作物遺傳性狀的重要途徑。小豆再生體系建立是進行遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，而關(guān)于小豆離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化研究的報道較少。已有的研究表明，小豆的外植體不同、基因型不同，其離體再生能力和遺傳轉(zhuǎn)化條件也不盡相同[11-15]。

目前，小豆離體再生的頻率比較低，已成為制約小豆遺傳性狀快速改良的重要因素。本試驗以小豆胚軸為外植體，研究不同植物生長物質(zhì)對小豆愈傷組織誘導和不定芽分化的影響，建立高效穩(wěn)定的小豆離體再生體系，從而為下一步小豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和品質(zhì)的改良奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

小豆種子由山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?培養(yǎng)基的配制

1）愈傷組織誘導和分化培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（2.0、3.0和5.0 mg/L）、NAA（0.2和0.5 mg/L）、IBA（0.2和0.5 mg/L）和TDZ（0.05和0.1 mg/L），調(diào)節(jié)pH到5.8（表1）。所有培養(yǎng)基均添加3%的蔗糖和1%的瓊脂。

2）生根培養(yǎng)基。以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.1和0.5 mg/L）和IBA（0.1和0.5 mg/L），調(diào)節(jié)pH到5.8（表2）。

1.2.2 ?種子的消毒和種植 ?選取子粒飽滿、種皮完好的小豆種子，自來水沖洗10 min后75%乙醇溶液浸泡30 s，0.1% HgCl2溶液處理10 min，無菌水沖洗5～6次，然后將種子接種到MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。小豆的生長條件為16 h光照/8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度25 ℃，光照度2 000 lx。

1.2.3 ?愈傷組織的誘導和分化 ?以生長5 d的小豆下胚軸為材料，切成約2 cm的小段，接種到HD1～HD9培養(yǎng)基中，進行愈傷組織誘導和不定芽的分化培養(yǎng)。2周繼代培養(yǎng)1次，30 d統(tǒng)計愈傷組織誘導率，分化出芽的數(shù)量和芽分化率。

愈傷組織誘導率=（產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%

不定芽分化率=（產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%

1.2.4 ?生根的誘導 ?當不定芽長度約3～5 cm時，切取生長良好的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基R1～R4中進行生根誘導，2周后統(tǒng)計不定芽的生根率和根增殖系數(shù)。

生根率=（產(chǎn)生不根的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%

1.2.5 ?統(tǒng)計分析 ?采用EXCEL 2007和SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及Duncan多重比較。顯著性測驗，字母相同者差異不顯著，字母不同者表示在0.05（小寫字母）或0.01（大寫字母）水平上差異顯著。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?植物生長物質(zhì)對外植體愈傷組織誘導的影響

將小豆下胚軸接種于HD1～HD9培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。結(jié)果表明，上述培養(yǎng)基均可誘導外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織，但培養(yǎng)基中植物生長物質(zhì)不同，愈傷組織誘導效果也存在明顯的差異（圖1A）。在HD1～HD4培養(yǎng)基中，小豆產(chǎn)生愈傷組織的量較少且易褐化，誘導率不足50%。愈傷組織誘導效果較好的是HD6～HD8，愈傷組織生長狀態(tài)較好，誘導率超過75%。其中，誘導效果最好的是HD7，愈傷組織誘導率達到90%，和其他培養(yǎng)基差異極顯著（P<0.01）。

2.2 ?植物生長物質(zhì)對小豆不定芽誘導的影響

選取生長良好的愈傷組織，接種到HD1～HD9培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，30 d可分化產(chǎn)生明顯的不定芽。結(jié)果表明，小豆在上述培養(yǎng)基中，植物生長物質(zhì)明顯影響愈傷組織的分化（圖1B）。其中效果最差的是HD1，不定芽的分化率只有20%，幾乎觀察不到明顯的不定芽;其次是HD2～HD5，不定芽的分化率不到50%;愈傷組織分化不定芽效果較好的培養(yǎng)基為HD7～HD9，不定芽的分化率達到70%以上，不定芽的數(shù)量較多，生長情況較好。其中，HD7培養(yǎng)基中愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽的效果最好，不定芽分化率達到90%，不定芽數(shù)量多且生長旺盛，和其他培養(yǎng)基差異極顯著（P<0.01）。

2.3 ?植物生長物質(zhì)對小豆不定芽生根的影響

將小豆不定芽接種到HR1～HR4培養(yǎng)基中，2周后統(tǒng)計不定芽生根率。結(jié)果表明，小豆比較容易生根，這4種培養(yǎng)基都可誘導不定芽生根，但植物生長物質(zhì)不同，生根的效果不同（圖1C和圖1D）。在HR1和HR2培養(yǎng)基中，不定芽基部產(chǎn)生的根長而勻稱;HR3和HR4培養(yǎng)基誘導產(chǎn)生的根短而細小。在HR1培養(yǎng)基中，不定芽生根率大約為60%，數(shù)量較少;在HR2培養(yǎng)基中，不定芽生根率最高，達到90%以上，數(shù)量較多，根系發(fā)達。小豆不定芽在HR3培養(yǎng)基中生根率雖高于HR1培養(yǎng)基，但效果不及HR2培養(yǎng)基，且主根數(shù)量較少，根系不發(fā)達;在HR4培養(yǎng)基中，不定芽生根率較高，數(shù)量較多，接近HR2培養(yǎng)基，但根生長有些異常，許多根向上生長。

2.4 ?小豆離體再生體系的建立

選取顆粒飽滿的小豆種子（圖2A），消毒后接種于MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。小豆種子萌發(fā)較快，4～5 d后即可生長為高度適中小豆幼苗（圖2B）。切取長度適宜的下胚軸，接種到HD7培養(yǎng)基中（圖2C）。7 d后胚軸頂端細胞開始脫分化產(chǎn)生愈傷組織（圖2D）。繼續(xù)培養(yǎng)14 d后，可觀察到有大量的愈傷組織生成，結(jié)構(gòu)致密，呈淡綠色（圖2E）。取生長狀態(tài)較好的愈傷組織，接種到HD7培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，愈傷組織急劇增多（圖2F）。14 d進行一次繼代，部分愈傷組織開始再分化產(chǎn)生不定芽（圖2G）。愈傷組織連續(xù)繼代培養(yǎng)，約30 d后可產(chǎn)生明顯的不定芽，但數(shù)量較少（圖2H）。將分化產(chǎn)生不定芽的愈傷組織繼續(xù)進行分化培養(yǎng)，愈傷組織體積顯著增大，表面產(chǎn)生大量的不定芽，成簇分布，形成叢生芽（圖2I），其中結(jié)構(gòu)致密的顆粒狀愈傷組織比較適合不定芽的分化培養(yǎng)（圖2J）。繼續(xù)培養(yǎng)至49 d，不定芽逐漸長高，數(shù)量不斷增多，生長比較旺盛（圖2K）。培養(yǎng)60 d后，多數(shù)不定芽高度比較適中，可以進行生根誘導（圖2L）。不定芽再繼續(xù)培養(yǎng)至70 d，雖然不定芽仍能繼續(xù)生長，但部分不定芽開始發(fā)黃枯萎，生長狀態(tài)不佳（圖2M）。

不定芽連續(xù)繼代培養(yǎng)約60 d后，選取長度3～5 cm生長健壯的不定芽，接種到HR2生根培養(yǎng)基中進行生根誘導（圖2N）。不定芽生根較快，7 d后基部開始長出不定根，此時數(shù)量較少，長度較短。14 d后產(chǎn)生明顯的根，繼續(xù)培養(yǎng)21 d后，根的數(shù)量顯著增多，根系較為發(fā)達，不定芽繼續(xù)生長，不斷產(chǎn)生新枝新葉，進而獲得試管苗（圖2O和圖2P）。

3 ?討論

小豆在中國種植歷史悠久，具有較高的食用價值和藥用價值[4，5]。目前，有關(guān)小豆的研究還較少，高效的離體再生體系尚未建立，制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小豆作物遺傳改良中的應(yīng)用。本研究以小豆胚軸為外植體，分析影響小豆不定芽誘導和植株再生的因素，初步建立起高效穩(wěn)定的小豆離體再生體系。在適宜的培養(yǎng)條件下，小豆下胚軸誘導14 d后產(chǎn)生明顯的愈傷組織;愈傷組織繼代培養(yǎng)14 d，愈傷組織繼續(xù)生長，開始產(chǎn)生芽點;繼代培養(yǎng)14 d后產(chǎn)生明顯的芽。生根誘導7 d不定芽開始生根，14 d產(chǎn)生明顯的根。試驗結(jié)果表明，影響小豆愈傷組織誘導和分化的最主要因素是6-BA的濃度。當培養(yǎng)基中添加6-BA時，無論是否加入其他植物生長物質(zhì)，下胚軸均可誘導產(chǎn)生愈傷組織并分化出不定芽。加入NAA、IBA或TDZ，對小豆愈傷組織誘導和不定芽分化不僅沒有明顯的促進作用，反而還顯示出一定程度的抑制作用，抑制效果的強弱和這些成分的濃度有關(guān)。在HD7培養(yǎng)基中，外植體產(chǎn)生愈傷組織和不定芽的效果最好，不僅愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，生長旺盛，不易褐化，而且再分化產(chǎn)生不定芽數(shù)量較多，這與劉紅霞[11]的研究結(jié)果一致。小豆基因型也是影響小豆離體再生的重要因素，本研究所采用的小豆品種，在最適條件下，愈傷組織誘導率和不定芽分化率均達到90%以上。生根結(jié)果表明，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA和IBA，均可促進不定芽生根。其中HR2培養(yǎng)基最適合生根，不定芽生根率最高，達到90%以上，數(shù)量較多，根系發(fā)達。對于小豆而言，與NAA相比，一定濃度的IBA更適合不定芽的生根誘導。本研究通過探索小豆離體快繁的最適條件，初步建立起比較高效穩(wěn)定的小豆離體再生體系，從而為下一步小豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和生物性狀的改良奠定基礎(chǔ)。

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