超高效液相色譜法同時檢測茶葉中的沒食子酸、咖啡堿和兒茶素

趙明明 周聰 彭茂民 周有祥

摘要：通過優(yōu)化前處理提取條件和超高效液相色譜分離方法，建立了茶葉中沒食子酸、咖啡堿和8種兒茶素定性和定量方法。結(jié)果表明，選用ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱，色譜條件為柱溫30 ℃，流速0.2 mL/min，流動相選擇0.1%甲酸水-0.1 %甲酸甲醇溶液，檢測波長278 nm，10種組分在0.05～10.00 mg/L具有良好的線性關(guān)系，綠茶樣品中各組分含量的相對偏差RSD在1.77%～5.89%，表明該方法簡潔快速，且精密度好。

關(guān)鍵詞：茶葉;超高效液相色譜法;沒食子酸;咖啡堿;兒茶素

中圖分類號：S571.1;O657.7+2 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0205-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.050 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Simultaneous determination of gallic acid，caffeine and catechins in tea by UPLC

ZHAO Ming-ming，ZHOU Cong，PENG Mao-min，ZHOU You-xiang

（Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： A qualitative and quantitative method for gallic acid， CAF and 8 catechins in tea were established by optimizing the extraction conditions of pretreatment and separation methods of Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）. The results showed that the ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm） chromatographic column was used and the chromatographic conditions were as follows：The column temperature was 30 ℃， the flow rate was 0.2 mL/min， the mobile phase was 0.1% formic acid water -0.1% formic acid methanol solution， the detection wavelength was 278 nm. The 10 components in the range of 0.05～10.00 mg/L had a good linear relationship， the relative deviation of the content of each component in green tea samples RSD between 1.77%～5.89%. The method is simple， fast and accurate.

Key words： tea; ultra high performance liquid chromatography; catechins; caffeine; gallic acid

茶葉中所含的多酚類物質(zhì)是一類存在于茶水中的多元酚的混合物，其中最重要的是以兒茶素為主體的黃烷醇類，其含量占多酚類總量的70%～80%[1]，是茶樹次生物質(zhì)代謝的重要成分，對茶葉的色、香、味品質(zhì)的形成有重要作用。酚酸是具有羧基和羥基的芳香族化合物，早在19世紀中葉就開始了茶葉中酚酸的研究，1847年從綠茶中分離出沒食子酸[2]，沒食子酸在茶葉中的含量為干物質(zhì)的0.5%～1.4%[3]。生物堿是茶葉重要的代謝產(chǎn)物，主要包括咖啡堿、可可堿和茶堿，在茶葉干物質(zhì)中含量最多[4]。這些營養(yǎng)物質(zhì)對人體具有極好的功效價值，如兒茶素抗氧化、保護心腦血管、抗腫瘤等作用;咖啡堿能興奮提神、舒張血管等;沒食子酸具有強抗氧化性，也有抗腫瘤、抗血栓等藥理作用。目前，關(guān)于茶葉沒食子酸、兒茶素及咖啡堿測定方法的報道已經(jīng)很多，主要有薄層色譜法、液相色譜-紫外檢測、液相色譜-質(zhì)譜、毛細管區(qū)帶電泳法等檢測方法[5]。高效液相色譜法應(yīng)用最多，但是同時檢測多種成分的方法耗時較長，超高效液相色譜法高效迅速，尚未廣泛應(yīng)用于茶葉中茶多酚及生物堿的分離檢測。因此建立快速、高通量、靈敏度高、特異性強的茶葉中沒食子酸、兒茶素和咖啡堿含量的超高效液相色譜法測定方法具有十分重要的意義。

本研究主要采用超高效液相色譜（UPLC）法測定普洱茶中兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素（GC）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）和沒食子酸（GA）9種兒茶素和咖啡堿（CAF）組分的含量，該法快速簡便，能夠同時測定多種兒茶素。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

龍毛尖綠茶、九龍利川紅茶、大集白茶購自市場。GA、GC、GCG、CG、C、EGCG、EGC、EC、ECG和CAF標準品購自國家標準物質(zhì)網(wǎng)。

1.2 ?儀器與試劑

DZKW-4電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），Waters ACQUITY UPLC-PDA超高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

甲醇、乙醇等分析純試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，色譜純試劑購自J.T.Baker公司，EDTA溶液，10 mg/mL;抗壞血酸溶液，10 mg/mL。

穩(wěn)定溶液：分別將25 mL EDTA溶液、25 mL抗壞血酸溶液、50 mL甲醇溶液加入500 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。

1.3 ?方法

1.3.1 ?標準溶液的配置 ?稱取適量兒茶素（GA、GC、GCG、CG、C、EGCG、EGC、EC、ECG）和CAF于25 mL容量瓶中，以穩(wěn)定溶液定容，得到單標母液，于4 ℃保藏，臨用前配置混標，于4 ℃保藏。單標濃度為：100 μg/mL GA、100 μg/mL CAF、800 μg/mL GC、800 μg/mL EGC、600 μg/mL C、200 μg/mL EGCG、400 μg/mL EC、400 μg/mL GCG、400 μg/mL ECG、400 μg/mL CG。

1.3.2 ?前處理方法的優(yōu)化 ?樣品制備：茶葉樣品充分粉碎、過篩，密封常溫保存。試驗分3組，A組：70%甲醇（80 ℃預(yù)熱），茶水比1∶100（0.1 g茶葉粉末加10 mL溶劑），80 ℃浸提10 min，浸提過程搖勻以保證浸提完全。3 500 r/min離心10 min，吸取上清液至50 mL容量瓶中，沉淀再重復(fù)提取一次，合并上清液，用穩(wěn)定溶液定容;B組：水提（80 ℃預(yù)熱），茶水比1∶100，80 ℃浸提10 min，沉淀再用80 ℃水提取一次，合并上清液，用穩(wěn)定溶液定容;C組：用70%甲醇（80 ℃預(yù)熱）提取一次，沉淀再用80 ℃水提取一次，合并上清液，用穩(wěn)定溶液定容。提取液用0.22 μm微孔濾膜過濾，UPLC進樣2 μL。

1.3.3 ?色譜條件的優(yōu)化

1）色譜柱的選擇。選用美國Waters的 ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）和ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，1.0 mm×100 mm）3種色譜分離柱進行比較。

2）流動相及其梯度的選擇。分別以甲醇和乙腈作為流動相，比較出峰情況。在此基礎(chǔ)上，比較不同酸度流動相（0.2%甲酸溶液、0.1%甲酸溶液、0.05%甲酸溶液、0.01%甲酸溶液、0.2%乙酸溶液、0.1%乙酸溶液、0.05%乙酸溶液和0.01%乙酸溶液）出峰情況。

3）柱溫和流速的選擇。選擇不同的溫度（25、30、35 ℃）用于色譜柱溫度條件優(yōu)化，選擇0.1和0.2 mL/min的流速進行流速條件優(yōu)化。

4）檢測波長的選擇。分別選擇210 nm和278 nm作為檢測波長，觀察出峰情況。

1.3.4 ?標準曲線、線性范圍及方法的精確度 ?用穩(wěn)定溶液將混標溶液進行梯度稀釋，按其所得峰面積的平均值與對應(yīng)濃度（μg/L）作標準曲線，計算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。按“1.3.2”方法提取茶葉上清液，每個樣品測6組平行，計算各組分RSD。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?出峰時間的確定

將所配置的兒茶素和咖啡堿的單標與混標色譜圖相比較，確定各成分的出峰時間，如圖1所示，具體出峰時間見表1。

2.2 ?前處理條件的優(yōu)化

在3組試驗組中，采用不同的浸提溶劑組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用70%的甲醇提取2次的提取率最高（表2）。這是由于甲醇的羥基與兒茶素及茶多酚分子中含有的酚羥基能形成氫鍵，具有良好的溶解性[6]，而且天然狀態(tài)的兒茶素與茶多酚往往以氫鍵與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物形式存在，甲醇溶液具有斷裂氫鍵的能力，有利于使締合態(tài)的兒茶素及茶多酚游離出來。

2.3 ?色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 ?色譜柱的確定 ?從色譜試驗來看，UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）的分離效果最好。HSS T3柱是高強度的硅膠，而UPLC BEH C18柱采用橋式亞乙基硅氧烷，亞乙基硅氧烷與極性成分的鍵合作用較強，有利于沒食子酸、兒茶素和咖啡堿的分離，其主要利用分子與層析材料烴基之間的疏水作用來實現(xiàn)分離，其分離效率高。且1.7 μm粒徑較1.8 μm粒徑小，所以C18柱不論是從峰形方面來說，還是從分離情況來考慮，其效果都更好。而50 mm BEH C18柱所需分離時間比100 mm BEH C18柱所需時間短，效率更高，因而最終選擇ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）。

2.3.2 ?流動相及其梯度的確定 ?乙腈極性較強，對目標物洗脫能力更強，使得大多數(shù)目標物很快洗脫，分離度差，短時間內(nèi)無法實現(xiàn)多種目標物的分離。而使用甲醇有很好的分離度。因此，本方法選用甲醇作為強洗脫相。

由于反相色譜柱填料表面存在殘余的羥基，而部分酚類化合物具有弱酸性，能夠與殘余硅羥基發(fā)生靜電作用產(chǎn)生次級保留效應(yīng)，被推遲洗脫下來，產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。酸性環(huán)境能夠抑制硅羥基電離，向流動相中添加少量酸，能夠明顯改善峰型[7]。為了獲得準確的定量分析結(jié)果，試驗考察了酸的種類以及酸的濃度對10種目標物質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明，多酚化合物在0.1%甲酸水和0.1%甲酸甲醇梯度洗脫條件下，都能夠出峰且基線平穩(wěn)（表3）。

2.3.3 ?柱溫和流速的確定 ?溫度是反相色譜中一個控制選擇性的重要變量，在高溫下，色譜峰的拖尾現(xiàn)象得到改善，峰形變得更加對稱，在C18柱上對兒茶素進行分析，無論是以純水作為流動相，還是以水和有機溶劑共同作為流動相，色譜峰的對稱性都隨著溫度的升高而升高。隨著柱溫的升高，極性和非極性溶質(zhì)的容量因子都減小，高效液相色譜系統(tǒng)壓力和茶多酚的保留時間都呈減小趨勢。同時，溫度對分離度和有效塔板數(shù)都有影響，當溫度和流速都增加時，柱效也得以增加，在30 ℃，流速為0.2 mL/min時，分析時間比25 ℃減少，分離效果比35 ℃好，峰形更窄且對稱，充分說明了溫度對柱效調(diào)節(jié)的有效性。當流速為0.2 mL/min時，色譜峰形好，且色譜柱能在15 min內(nèi)分離所有的化合物。

2.3.4 ?檢測波長的確定 ?試驗采用200～400 nm全波長掃描，用3D色譜圖分析發(fā)現(xiàn)，10種組分在210 nm處和278 nm處均有最大吸收，與目前已有的文獻結(jié)果一致。對照目標物相應(yīng)的2D譜圖，10種標準物質(zhì)在這個波長范圍內(nèi)，分離度好，峰高、峰型都能達到檢測需要，但在梯度洗脫時，由于流動相的影響，造成實際樣品在210 nm檢測時基線漂移較明顯，而在278 nm處，10種分析物靈敏度、分離度以及基線情況都很好，并且避免了溶劑的影響。因此，在試驗過程中，采用278 nm作為檢測波長。

2.4 ?標準曲線及線性范圍

GA、CAF、GC、EGC、C、EGCG、EC、GCG、ECG、CG標準溶液濃度均在0.05～10.00 mg/L具有良好的線性關(guān)系，具體的線性方程及R2見表4。

2.5 ?檢出限與定量限的確定

以3倍信噪比計算檢出限（LOD），10倍信噪比測量定量限（LOQ），得到結(jié)果見表5。

2.6 ?方法的精確度和可選擇性

2.6.1 ?方法的精確度 ?用外標法計算可以得出綠茶樣品中的茶多酚濃度及其含量（表6）。利用本試驗中建立的超高效液相色譜法檢測綠茶樣品中兒茶素、沒食子酸和咖啡堿含量，進行精密度試驗，結(jié)果表明，綠茶樣品中各種特征物質(zhì)含量的相對偏差RSD在1.77%～5.89%，說明該方法精密度良好。

2.6.2 ?方法的可選擇性 ?進一步測定紅茶和白茶樣品中的兒茶素、沒食子酸和咖啡堿含量，紅茶中目標物含量在0～3.3%，相對偏差為0.28%～14.90%，白茶中目標物含量在0.05%～11.00%，相對偏差為0.51%～6.42%，該方法適用于紅茶和白茶。兒茶素在每類茶中的含量差異較大，綠茶中的兒茶素含量最高，紅茶中無GC和EC，白茶中EGCG含量最高，經(jīng)過比較可以看出，綠茶是不發(fā)酵茶，兒茶素基本全部保留，白茶部分發(fā)酵，兒茶素有略微的分解降低，紅茶的兒茶素在發(fā)酵過程中被大量的分解。

3 ?小結(jié)與討論

本試驗建立了超高效液相色譜法快速測定兒茶素、沒食子酸和咖啡堿含量的方法，選用ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱，柱溫為30 ℃，流速為200 μL/min，流動相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇溶液，檢測波長為278 nm，該方法適用于檢測綠茶樣品中的特征物質(zhì)。綠茶中多酚類占干物質(zhì)總量的20%～30%，咖啡堿占2%～3%，其中兒茶素占多酚類總量的70%～80%。白茶所含有的功能性成分主要是茶多酚及其氧化產(chǎn)物、咖啡堿和氨基酸等，成品白茶的多酚類物質(zhì)含量為18.3%～33.0%，兒茶素含量為7.84%～12.86%。紅茶是發(fā)酵茶，茶多酚減少90%以上，生成茶黃素（TF）、茶紅素（TR）和茶褐素（TB）等新成分。在制作時，綠茶不經(jīng)過任何發(fā)酵過程，白茶經(jīng)10.00%～30.00%程度的發(fā)酵，紅茶的發(fā)酵度高達80%～90%[8]。紅茶和白茶中存在其他目標物質(zhì)，在后期試驗中，可將試驗方案進一步優(yōu)化改進，以測定茶葉中更多的特征物質(zhì)，使得該方法的選擇性更大。

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