二酪氨酸層賦予酵母孢子抗氧化活性

MUKAMA Omar，LEO Bemena，王曉文，高曉冬，中西秀樹(shù)

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

釀酒酵母的產(chǎn)孢過(guò)程是在碳源以及氮源匱乏等饑餓條件下引起的一個(gè)連續(xù)的過(guò)程。在此過(guò)程中，釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)化為孢子膜[1]，最終在二倍體細(xì)胞中形成四個(gè)單倍體孢子。孢子壁由四層結(jié)構(gòu)組成，從內(nèi)到外依次為：甘露糖層、葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層。相較于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，孢子可以有效抵抗外界的惡劣環(huán)境，該特性主要是由于殼聚糖層和二酪氨酸層的保護(hù)作用。孢子壁結(jié)構(gòu)是由內(nèi)到外依次合成，在殼聚糖層形成后，二酪氨酸層才開(kāi)始合成[2]。二酪氨酸層主要是由酵母細(xì)胞質(zhì)中兩個(gè)L-酪氨酸交聯(lián)形成的二肽（LL-二甲酰基-N，N’-二酪氨酸）為主體的結(jié)構(gòu)，該形成過(guò)程分為兩步：L-酪氨酸的N-甲酰化以及L-甲酰酪氨酸的二聚化[3]。這兩個(gè)步驟分別由Dit1 和Dit2 兩個(gè)蛋白調(diào)控完成[4]。隨后，LL-二甲?；?N，N’-二酪氨酸分子通過(guò)包括Dtr1 在內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)助下，運(yùn)送到形成過(guò)程中的孢子壁上[5]，且二酪氨酸層的組裝機(jī)制目前尚不清楚。

氧化劑可以通過(guò)自由基的介導(dǎo)來(lái)催化反應(yīng)，其氧化性會(huì)對(duì)生物大分子（核酸，蛋白質(zhì)，糖類和脂類）造成傷害，因此，氧化劑在生物體內(nèi)有很大的危害。H2O2作為氧化劑，進(jìn)入細(xì)胞后，主要通過(guò)抑制ATP 的合成（GAPDH 失活）影響糖酵解途徑，并且通過(guò)引起氧化應(yīng)激影響線粒體的氧化磷酸化途徑[6]。在過(guò)渡金屬存在時(shí)，即使低濃度的H2O2（20～80 μmol/L）也可以影響煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的活性，NAD+對(duì)于DNA 修復(fù)酶（多-ADP 核糖聚合酶）的活性是十分重要的。羥基自由基會(huì)造成不可逆的DNA 鏈斷裂[2，7]，以及堿基的羥基化。因此，氧化劑最終會(huì)造成細(xì)胞的損傷或者死亡。酚類化合物可以通過(guò)抑制自由基（如H2O2）與金屬離子（如Fe2+）的螯合從而抑制氧化性。在該機(jī)制中，自由基奪走酚基的一個(gè)氫原子，而酚基可以從抗氧化劑上得到一個(gè)電子轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂苫?yáng)離子[8]。酵母孢子的二酪氨酸是一種酚類化合物.過(guò)去的研究顯示，相較于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，酵母孢子對(duì)消化酶、乙醚處理、部分有機(jī)溶劑及高溫等特殊條件具有抵抗能力[9]。本研究目的是研究孢子對(duì)外源活性氧的抵抗能力，以及通過(guò)釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞合成NN′-二NN′甲?；野彼岵⒀芯?二甲?；野彼岬目寡趸匦浴?/p>

1 材料與方法

1.1 菌株與生長(zhǎng)條件

除了另外標(biāo)注的技術(shù)外，本文所提到的基因操作參考文獻(xiàn)[10]。所用到的酵母菌株見(jiàn)表1，引物序列表2。

在克隆過(guò)程中，大腸桿菌在加入氨芐青霉素（100 μL/mL）的LB 培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%NaCl）中培養(yǎng)。酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞是在YPAD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，0.033%腺嘌呤）和/或去除某一或某幾種特殊氨基酸的氨基酸混合物的完全培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。酵母產(chǎn)孢細(xì)胞的培養(yǎng)是在YPACe 培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%乙酸鉀）。

為了敲除DIT1，以pFA6a-HIS3MX6[11]為模板，以BLD1 和BLD2 為引物，通過(guò)PCR 技術(shù)擴(kuò)增得到一條DNA 片段，將該片段分別融合進(jìn)單倍體AN117-4B 和AN117-16D，然后將二者融合，得到dit1△二倍體菌株。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的釀酒酵母菌株Table 1 S.cerevisiae strains used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 質(zhì)粒

本文所用的質(zhì)粒見(jiàn)表3。pRS424-GAL-DIT1，pRS426-GAL-DIT2 and pRS424-TEF-DTR1 三個(gè)質(zhì)粒是按如下方法構(gòu)建的。

首先，DIT1，DIT2 和DTR1三個(gè)基因是以AN120 酵母菌株的基因組DNA 為模板[12]分別用引物 HXO599 和 HXO600，HXO601 和 HXO602，HXO603 和HXO604 通過(guò)PCR 擴(kuò)增的。得到的擴(kuò)增片段用SpeI 和XhoI 進(jìn)行切割，然后將其連接到以同樣酶切位點(diǎn)切割的質(zhì)粒pRS424-GAL，pRS426-GAL 或pRS425-TEF。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母YH499 菌株中進(jìn)行表達(dá)[16]。所有構(gòu)建的質(zhì)粒均由基因測(cè)序確認(rèn)（BGI，China，Beijing）。

表3 本實(shí)驗(yàn)所用到的質(zhì)粒Table 3 Plasmids used in this study

1.3 酵母產(chǎn)孢

取單菌落在5 mL 的YPAD 中培養(yǎng)過(guò)夜，然后將1 mL 菌液轉(zhuǎn)接到200 mL 的YPA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。離心（5 600 g，30 s）收集細(xì)胞，并用去離子水洗，然后將其轉(zhuǎn)移到2%的醋酸鉀培養(yǎng)24 h。產(chǎn)孢后，離心（5 600 g，30 s）收集孢子，并用6 mol/L NaCl 溶液洗滌2 次。

1.4 點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)

氧化劑的處理實(shí)驗(yàn)是根據(jù)文獻(xiàn)[17]稍作調(diào)整后進(jìn)行的。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到穩(wěn)定期后，收集菌體處理到105cells/mL，用1 μL 的氧化劑（2 mmol/L FeSO4/2 mmol/L H2O2或者2 mmol/L FeCl3/2 mmol/L H2O2）處理。混合液在30 ℃培養(yǎng)1 h，依次按梯度稀釋10 倍后震蕩混勻后分別取5 μL 點(diǎn)板到Y(jié)PAD 培養(yǎng)基上，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)一次。同樣的細(xì)胞用去離子水稀釋100 倍，分別涂于兩塊相同的平板上，對(duì)生長(zhǎng)的菌落計(jì)數(shù)，取兩板的平均值。實(shí)驗(yàn)圖片是用Image Quant LAS 4 000（GE Healthcare，USA）拍攝的。

1.5 LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸生物合成

含有空載（對(duì)照）和質(zhì)粒pRS424-GAL-DIT1，pRS426 -GAL -DIT2 和 pRS424 -TEF -DTR1 的YPH499 單菌落在含2%葡萄糖的SD 培養(yǎng)基上培養(yǎng)到指數(shù)期，離心（8 560 g，2 min）收集菌體，去離子水洗2 次，然后轉(zhuǎn)入含有2%半乳糖的SD 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后含有LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸的培養(yǎng)基（4 mg/mL）將用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.6 LL-二酪氨酸和LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸的化學(xué)合成

LL-二酪氨酸和LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸通過(guò)[18]所描述的用L-酪氨酸或者N-甲?；?L-酪氨酸（Sigma-Aldrich）進(jìn)行氧化反應(yīng)從而合成。反應(yīng)過(guò)程如下：2 mL 的Tris-HCl（0.3 mmol/L，pH 8.5），1.5 mL 的L-tyrosine 或者N-甲酰基-L-酪氨酸（2 mg/mL），0.1 mL 的過(guò)氧化氫（8.82×10-5mol/L），0.5 mL 的過(guò)氧化物酶（1 mg/mL，Sangon，Shanghai，China），混合，20 ℃培養(yǎng)1 h。然后進(jìn)行LC-MS 分析，確認(rèn)LL-二酪氨酸和LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸是否合成。

1.7 二酪氨酸的高效液相色譜（HPLC）分析

該樣品是用Discovery C18 柱（150 mm×4.6 mm ID，5 μm particles）（Sigma Aldrich，U.S.A）在Waters分離模塊e2695 HPLCs 系統(tǒng)（Wexford，UK）進(jìn)行分析。每組加入10 μL 樣品。柱子經(jīng)過(guò)含有100%CH3CN 的0.01 M 三氟乙酸梯度洗脫（0～50%的CH3CN，55 min。樣品流速為1 mL/min，紫外熒光檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)285 nm，發(fā)射波長(zhǎng)425 nm。

1.8 抗氧化劑實(shí)驗(yàn)

DPPH 和ABTS 溶液被用來(lái)檢測(cè)二甲酰基-二酪氨酸的自由基清除能力。DPPH 的用法是根據(jù)[19-20]中所描述的方法進(jìn)行的。在99%甲醇溶液中，加入3.5 mL 的60 mol/L 的DPPH，然后分別加入10，20，50 μL 的含有培養(yǎng)基的LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸，空質(zhì)粒，單獨(dú)的培養(yǎng)基和合成的LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸?；旌先芤涸诤诎抵惺覝嘏囵B(yǎng)20 min，然后在517 nm（吸光度）下用Ultrospec 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer（GE healthcare，F(xiàn)airfield，USA）讀數(shù)。清除力的計(jì)算如下：

ABTS 工作溶液的制備過(guò)程是按照[21-22]中的描述。本實(shí)驗(yàn)中，在99%甲醇溶液中，加入3.5 mL 的60 mol/L 的ABTS，然后分別加入10，20，50 μL 的含有培養(yǎng)基的LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸，空質(zhì)粒，單獨(dú)的培養(yǎng)基和合成的LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸?；旌先芤涸诤诎抵惺覝嘏囵B(yǎng)16 h，然后在734 nm（吸光度）下用Ultrospec 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer（GE healthcare，F(xiàn)airfield，USA）讀數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究至少做了3 次的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，如±SE 所顯示的。

2 結(jié)果與討論

2.1 孢子的抗氧化性相對(duì)于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞更強(qiáng)

為了測(cè)試孢子是否具有抗氧化能力，將營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和孢子分別用2 mmol/L FeCl3/2 mmol/L H2O2或2 mmol/L FeSO4/2 mmol/L H2O2處理。通過(guò)氧化反應(yīng)，F(xiàn)eCl3可以與H2O2反應(yīng)并產(chǎn)生帶超氧陰離子。Fe2+與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基。將細(xì)胞在該溶液中培養(yǎng)1 h 后在YPAD 上點(diǎn)板。如圖1 所示，用FeCl3/H2O2或FeSO4/H2O2處理的孢子與未處理的孢子生長(zhǎng)狀況相似。然而，處理后的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的生存力顯著降低。這些結(jié)果表明，與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞相比，孢子具有抗氧化能力。

圖1 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和孢子對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性Fig.1 Susceptibility of vegetative cells and spores toward oxidative stress

2.2 二酪氨酸層賦予孢子抗氧化能力

本研究評(píng)估了二酪氨酸層是否具有抗氧化性。由于DIT1 基因控制合成二酪氨酸，其突變導(dǎo)致二酪氨酸層缺失。如圖2（a）所示，dit1△突變株孢子對(duì)FeCl3/H2O2和FeSO4/H2O2比野生型孢子更敏感。

如圖2（b）所示，經(jīng)FeCl3/H2O2處理后，dit1△的孢子，野生型孢子和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的存活率分別降低到28.55%，60%和0，經(jīng)過(guò)FeSO4/H2O2處理，dit1△的孢子，野生型孢子和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的存活率分別降低到37.43%，90.84%和0。該結(jié)果表面二酪氨酸層賦予孢子抗氧化的能力。

2.3 二甲?；野彼崮軌蚍置诘脚囵B(yǎng)基中

二酪氨酸層主要由二甲?；野彼峤M成。本研究檢測(cè)了二甲?；野彼崾欠耧@示出抗氧化活性。為了獲得大量的二甲?；野彼?，本研究采用生物法合成二甲?；野彼?。

圖2 二酪氨酸層的缺失對(duì)細(xì)胞抗氧化性的影響Fig.2 Effect of the loss of the dityrosine layer on oxidative stress resistance

之前研究表明，即使在增殖期營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中，二甲?；野彼嵋部捎蒁IT1，DIT2 和DTR1 三個(gè)基因控制合成的[3-5]。因此，分別構(gòu)建了在GAL1 啟動(dòng)子下游含有DIT1，DIT2 及DTR1的質(zhì)粒。在GAL1 啟動(dòng)子調(diào)控下，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中抑制基因表達(dá)，并通過(guò)含半乳糖的培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)基因表達(dá)。

轉(zhuǎn)化構(gòu)建得到的3 種質(zhì)粒到酵母菌株YPH499中，挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子在含有葡萄糖或半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。離心除去細(xì)胞并將培養(yǎng)基濃縮10倍。二酪氨酸是一種熒光分子：激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為475 nm。在半乳糖培養(yǎng)基中，檢測(cè)到強(qiáng)烈的二酪氨酸熒光信號(hào)。在葡萄糖培養(yǎng)基中，未檢測(cè)到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。表達(dá)了空載體的培養(yǎng)基中，未檢測(cè)到熒光信號(hào)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證培養(yǎng)了表達(dá)Dit1，Dit2 和Dtr1細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有二甲酰二酪氨酸，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了HPLC 驗(yàn)證。在表達(dá)Dit1，Dit2 和Dtr1 細(xì)胞用過(guò)的培養(yǎng)基中檢測(cè)到二甲?；野彼岱澹诤锌蛰d體的細(xì)胞的培養(yǎng)基中沒(méi)有檢測(cè)到（圖3）因此，實(shí)驗(yàn)用過(guò)的培養(yǎng)基中含有二甲?；野彼帷?/p>

圖3 在表達(dá)DIT1，DIT2 和DTR1 細(xì)胞用過(guò)的培養(yǎng)基中檢測(cè)二甲酰基二酪氨酸Fig.3 Detection of bisformyl dityrosine in spent media cultured DIT1，DIT2，and DTR1 expressing cells

2.4 二甲?；野彼峋哂锌寡趸钚?/h3>

通過(guò)使用DPPH 和ABTS 測(cè)定，本研究檢測(cè)了二甲?；野彼崾欠窬哂锌寡趸钚?。如圖4 所示，兩種方法測(cè)定顯示含二甲?；野彼岬呐囵B(yǎng)基具有抗氧化活性，而在表達(dá)了空載體的細(xì)胞培養(yǎng)基中沒(méi)有觀察到這種活性。

圖4 二甲基二酪氨酸的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of bisformyl dityrosine

3 結(jié)語(yǔ)

孢子具有對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力。本研究證實(shí)了孢子的抗氧化性比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞更強(qiáng)。由于二酪氨酸層的存在，孢子展示出了部分的抗氧化性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可證實(shí)二甲?；野彼釋?duì)強(qiáng)氧化劑有清除能力，因此具有抗氧化活性。在釀酒酵母中異源表達(dá)DIT1，DIT2 和DTR1 可證實(shí)二甲?；野彼釙?huì)分泌到培養(yǎng)基中，也可被用作抗氧化劑。因此，二甲?；野彼岬纳a(chǎn)十分便捷。二甲?；野彼岷玩咦游磥?lái)可以被用作相關(guān)的抗氧化材料。