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2019-02-06 07:21:52蔡欣月李志江牛江帥孫藝墨戴凌燕
食品與生物技術(shù)學(xué)報 2019年10期
蔡欣月，李志江，牛江帥，包 丹，蘇 晨，孫藝墨，戴凌燕*
（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）
高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是世界主要糧食作物之一，也可作為動物飼料，在世界發(fā)達(dá)及發(fā)展中國家種植面積較大，廣泛分布在亞、非和美洲等熱帶干旱、半干旱地區(qū)。在中國，高粱年均種植面積約為722 400 hm2，產(chǎn)量可達(dá)2 865 000 萬t，為世界第四大高粱主產(chǎn)國[1]。高粱可在干旱邊際土地上種植，不與玉米、小麥和水稻爭奪農(nóng)業(yè)用地。因此，隨著世界總?cè)丝诓粩嘣黾?，極端氣候頻繁出現(xiàn)，可利用水資源日漸減少，土地鹽漬化逐年加劇，高粱作為抗旱耐逆的經(jīng)濟作物，必將在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中占有重要戰(zhàn)略地位。
高粱籽粒包含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素和少量的灰分及蠟質(zhì)。蛋白質(zhì)約含6.8%～19.6%，是高粱中除淀粉以外含量最多的成分[2]。但是，高粱蛋白富含半胱氨酸，缺乏人體必需的賴氨酸和色氨酸，在禾谷類作物中消化率最低，約為30%～80%[3]，且會導(dǎo)致以高粱為主要蛋白食物的人嚴(yán)重營養(yǎng)不良[4]。高粱的主要貯藏蛋白為醇溶蛋白，約占高粱總蛋白的77%～82%[5]，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量和氨基酸序列組成被分成α、β、γ 和δ 醇溶蛋白，與玉米相似[6-7]。而α-醇溶蛋白占高粱醇溶蛋白總量的66%～84%[8]。而轉(zhuǎn)錄因子Opaque2（O2）可通過識別啟動子上O2 box（TCCACGT）來調(diào)控玉米22 kDa α-醇溶蛋白和15 kDa β-醇溶蛋白的基因表達(dá)[9-10]，O2 基因的突變能降低α-醇溶蛋白的含量，在有的玉米近交品系中α-醇溶蛋白能減少60%以上[11]，并會增加富含賴氨酸和酪氨酸蛋白質(zhì)的積累[12]。隨著社會和經(jīng)濟的發(fā)展，人們追求高生活品質(zhì)的同時很注重保健。在食物方面更青睞營養(yǎng)價值高，有益于健康的粗糧食材，而高粱產(chǎn)品從古至今一直被人們所喜愛。因此，有望在高粱醇溶蛋白合成調(diào)控基礎(chǔ)上，通過生物技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化改良高粱蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)。
目前為止，高粱育種主要集中在增加產(chǎn)量、提高抗性和降低單寧等方面，而在降低醇溶蛋白含量方面罕見報道。眾所周知，傳統(tǒng)育種針對性較差、分子機制不清楚、且費時耗力，收效??；而通過生物技術(shù)進行遺傳轉(zhuǎn)化可省時，收效大。近年產(chǎn)生的新技術(shù)RNA 干擾（RNA interference，RNAi）介導(dǎo)的基因沉默具有特異、高效的特點，植物中運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)所形成的RNAi 可以遺傳到下一代。本研究將構(gòu)建的opaque2 基因RNA 抑制表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化高粱幼胚，通過測定轉(zhuǎn)基因植株籽粒中醇溶蛋白含量，觀察胚乳中蛋白質(zhì)體形狀變化，以及SDS-PAGE 電泳檢測等來分析RNAi 靶向沉默opaque2 基因?qū)Ω吡淮既艿鞍缀康挠绊?。以期篩選出籽粒中醇溶蛋白含量低的優(yōu)質(zhì)株系，為擴展高粱的遺傳基礎(chǔ)和加快高粱品質(zhì)育種進程提供種質(zhì)資源和方法。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
高粱品種P898012 由美國密蘇里大學(xué)哥倫比亞分校遺傳轉(zhuǎn)化中心張展元實驗室惠贈；高粱組織培養(yǎng)中激素類IAA、6-BA 和IBA 均購自美國Sigma公司；頭孢噻肟購自美國Caisson 公司；草銨膦購自美國Sigma 公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、SpeI、KpnI、SacI、HindIII 和EcoRI，T4 DNA連接酶，Taq 聚合酶，載體T-Vector pMD20 等購自寶生物工程有限公司（大連）；PCR 產(chǎn)物純化和質(zhì)粒提取等試劑盒均購自天根生化科技有限公司（北京）；TRIZOL 購自美國invitrogen 公司；所有引物均由上海生工公司合成。
1.2 試驗方法
1.2.1 RNAi 抑制表達(dá)載體構(gòu)建 以GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中高粱opaque2 基因序列（登錄號X71636）上第1 個外顯子設(shè)計引物。一對引物帶有BamHI和SpeI 酶切位點；另一對帶有KpnI 和SacI 酶切位點。將2 個擴增目的片段分別連接到植物載體p130035SI-X 上，然后再用HindIII 和EcoRI 將帶有35S、目標(biāo)片段和NOS 片段切下后連接到pCambia3300 載體上，用篩選抗性草銨磷（Bar）基因替換掉潮霉素（hptII）基因。
1.2.2 高粱幼胚遺傳轉(zhuǎn)化 高粱幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化體系參照Do 等的方法進行[13]。取授粉11～14 d 高粱籽粒，經(jīng)消毒后剝離幼胚作為外植體。將opaque2 基因的RNAi 抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1 中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化高粱幼胚，通過誘導(dǎo)愈傷、草銨磷抗性篩選芽分化、根分化過程來獲得再生轉(zhuǎn)基因植株。
1.2.3 再生植株的陽性檢測與分析
1）再生植株的PCR 檢測。再生植株先通過葉片涂抹草銨磷溶液來進行初步篩選，若葉片涂抹處未變黃焦枯，則初步認(rèn)定其為陽性轉(zhuǎn)基因植株。然后提取葉片DNA，使用Bar 基因和載體上序列設(shè)計引物進行PCR 檢測確定。構(gòu)建載體及再生植株陽性檢測的引物見表1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
2）轉(zhuǎn)基因植株實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。取葉片檢測呈陽性植株開花20 d 的籽粒，用Trizol 試劑盒分別提取胚乳總RNA，依據(jù)產(chǎn)品說明書，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。以高粱actin 基因為內(nèi)參（擴增引物為actin-F：TTGGGTCAGAAA GGTTCAGG 和actin-R：TGCTCATTCGATCAGCAAT C），以opaque2 基因序列設(shè)計引物（o2-F：CAAGCTG AAGAGCCAACCAT 和o2-R：AGAGTTGATCCGGA GGAGGT），利用SYBR 熒光染料法進行qRT-PCR檢測，并分析opaque2 基因的相對表達(dá)量。
1.2.4 高粱籽粒醇溶蛋白含量測定及SDS-PAGE電泳 高粱籽粒中醇溶蛋白含量測定參照文獻(xiàn)[14]。各轉(zhuǎn)基因植株收獲籽粒后，隨機取20 粒烘干至恒重后，研磨至粉末狀。稱取高粱籽粒粉末50 mg加到2.0 mL 離心管中，按1∶10 比例（g/mL）加入含4% DDT 的60%叔丁醇提取液500 μL，混勻后在37℃水浴過夜提取，8 000 r/min 離心15 min，取上清測定醇溶蛋白含量。蛋白含量測定采用考馬斯亮蘭G-250 方法。高粱籽粒醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳參照Hamaker 的方法進行[15]，略有修改。取300 μL 提取液減壓蒸發(fā)溶劑，使蛋白質(zhì)沉淀。加入100 μL 5X電泳上樣緩沖液（不含溴酚藍(lán)）溶解蛋白質(zhì)。取10 μL 溶解蛋白樣品與10 μL 的含有溴酚藍(lán)的5X 電泳上樣緩沖液混合后沸水浴處理5 min，取15 μL樣品用15%的分離膠電泳檢測。
1.2.5 高粱籽粒透射電鏡觀察 高粱籽粒用2.5%戊二醛在4 ℃固定，PBS 緩沖液沖洗3 次。1%鋨酸在4 ℃后固定2 h，仍用PBS 緩沖液沖洗3 次。使用30%、50%、70%、90%和100%系列的乙醇梯度脫水，每次10 min，100%乙醇梯度脫水2 次。然后用Epon812 環(huán)氧樹脂包埋，在37、45 ℃和65 ℃溫箱固化，各級溫度固化24 h。經(jīng)UltracutE 超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色后，用日立H-7560 透射電子顯微鏡觀察并拍照。
2 結(jié)果與分析
2.1 構(gòu)建RNAi 抑制表達(dá)載體
RNAi 抑制表達(dá)載體構(gòu)建過程如圖1 所示。用高粱opaque2 基因序列第1 個外顯子上帶有BamHI和SpeI 酶切位點，KpnI 和SacI 酶切位點的兩對引物進行RT-PCR，分別擴增出2 條長度約為224 bp的目標(biāo)片段（圖1（a））。在將2 條目標(biāo)片段1 正1 反分別連接到植物載體p130035SI-X 上后，用BamHI和SacI 2 個內(nèi)切酶酶切載體進行驗證。由于載體上連接的2 條目標(biāo)序列間還存在1 個118 bp 長度的內(nèi)含子，在酶切后產(chǎn)生除線性載體外的一個約566 bp 的短片段（圖1（b））。由于載體p130035SI-X 上的植物抗性篩選基因為hptII 基因，其不利于高粱抗性植株的篩選。因此，使用HindIII 和EcoRI 將新構(gòu)建的p130035SI-X 載體上帶有35S 啟動子、目標(biāo)片段和 NOS 終止子片段切下后連接到pCambia3300 載體上，用篩選抗性Bar 基因替換掉hptII 基因。用HindIII 和EcoRI 2 個內(nèi)切酶酶切新構(gòu)建的pCambia3300 載體進行驗證，產(chǎn)生除線性載體外的一個約1 700 bp 的片段（圖1（c）），結(jié)果表明帶有opaque2 基因片段的RNAi 抑制表達(dá)載體構(gòu)建成功。
圖1 RNAi 載體構(gòu)建電泳Fig.1 Electrophoregram of RNAi vector construction
2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)opaque2 基因RNAi 抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)化高粱
以高粱幼胚為外植體，利用農(nóng)桿菌將opaque2基因RNAi 抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)化高粱品種P898012 的過程如圖2 所示。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化幼胚共培養(yǎng)3 d 后，幼胚長大并在胚周圍產(chǎn)生色素（圖2（a））。在草銨磷抗性篩選培養(yǎng)基上，抗性愈傷白色致密，而非抗性愈傷則水浸狀褐色，甚至變黑（圖2（b））。在誘導(dǎo)芽分化的草銨磷抗性篩選培養(yǎng)基上，抗性愈傷組織可先后分化出從生苗，而有些愈傷則變黑壞死（圖2（c））。將苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根（圖2（d））后，移苗至土中。
圖2 高粱遺傳轉(zhuǎn)化Fig.2 Genetic transformation of sorghum
2.3 陽性轉(zhuǎn)基因植株檢測與分析
2.3.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測 再生幼苗葉片涂抹100 mg/L 草銨磷，若涂抹葉片在3 片以上未發(fā)生黃褐色焦枯，則初步認(rèn)為其為陽性植株。取葉片提取DNA，用Bar 基因引物以葉片DNA 為模板進行PCR 擴增，目標(biāo)片段約為552 bp，結(jié)果見圖3（a），野生型植株未擴增出目標(biāo)條帶，而有些轉(zhuǎn)基因植株可擴增出目標(biāo)條帶。再用載體上兩個插入片段間內(nèi)含子設(shè)計的上游引物，和在其后載體上設(shè)計的下游引物，以DNA 為模板進行PCR 擴增，目標(biāo)片段約為591 bp，結(jié)果見圖3（b）?？梢姡趐Cambia3300 載體上擴增出極亮目標(biāo)條帶，而在以H2O 為模板的陰性對照和野生型植株中均未擴出目標(biāo)條帶；有些轉(zhuǎn)基因植株可擴增出目標(biāo)條帶。經(jīng)過多次檢測，將用不同引物可同時擴增出相應(yīng)目標(biāo)條帶的植株確定為轉(zhuǎn)基因植株，本試驗共獲得5 株。
2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR 檢測分析 以高粱actin 基因為內(nèi)參，采用qRT-PCR 對高粱胚乳中opaque2 基因的表達(dá)量進行檢測，見圖4。結(jié)果表明，除1 號外，其余4 株轉(zhuǎn)基因植株中opaque2 基因的表達(dá)量較對照顯著降低（P＜0.05），但不同植株表現(xiàn)不同，12 號下降程度更大?？梢?，通過RNAi 技術(shù)可對轉(zhuǎn)基因高粱植株opaque2 基因造成不同程度的干擾。
圖3 陽性植株檢測電泳圖Fig.3 Electrophoregram of detecting the positive plants
2.4 高粱籽粒醇溶蛋白含量測定及SDS-PAGE電泳
2.4.1 籽粒中醇溶蛋白含量測定 RNAi 抑制opaque2 轉(zhuǎn)基因高粱籽粒醇溶蛋白含量見圖5。從圖5 中可見，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株中4 株籽粒的醇溶蛋白含量顯著降低（P＜0.05），只有1 號植株醇溶蛋白含量未下降?？梢?，通過RNAi 抑制opaque2基因可有效影響高粱籽粒中醇溶蛋白的合成和積累。文獻(xiàn)[15]在玉米上的研究表明，以opaque2（o2）基因突變體W64Ao2 為材料，運用RNAi 技術(shù)抑制Ohp（O2 heterodimerizing protein）、Pbf（Prolaminebox binding factor）的突變體和Pbf/Ohp 雙基因突變體，其醇溶蛋白含量與野生型相比分別下降83%、89%和90%，opaque2、PBF 及OHP 三者間以效應(yīng)物和協(xié)同作用的模式在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控醇溶蛋白基因表達(dá)。但本實驗中轉(zhuǎn)基因植株中醇溶蛋白含量未與RNAi 抑制opaque2 基因程度完全吻合，其原因還需進一步研究。
圖4 轉(zhuǎn)基因植株opaque2 基因表達(dá)的qRT-PCR 檢測結(jié)果Fig.4 Result of opaque2 gene expression in the transgenic plants by qRT-PCR assay
圖5 高粱籽粒中醇溶蛋白含量Fig.5 Kafirin content in grains
2.4.2 醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳 醇溶蛋白SDSPAGE 電泳如圖6，供試野生型和各轉(zhuǎn)基因植株的醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳帶型相同，約在15、20 kDa 和22 kDa 處出現(xiàn)3 條帶，可推測通過RNAi 技術(shù)抑制opaque2 基因后，僅影響了醇溶蛋白含量，而未影響醇溶蛋白種類及存在方式。參照文獻(xiàn)[15]對高賴氨酸高粱突變體P721 Q 進行SDS-PAGE 電泳結(jié)果可知，20 kDa 處條帶為β-醇溶蛋白，22 KDa處條帶為α-醇溶蛋白，但缺少分子量較大的γ-醇溶蛋白條帶。參照玉米醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳結(jié)果[15-16]推測15 KDa 處的可能為高粱的δ-醇溶蛋白。
圖6 高粱籽粒中醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳Fig.6 SDS-PAGE analysis of kafirin in grains
2.5 高粱籽粒胚乳細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果
選取轉(zhuǎn)基因植株9 號和野生型高粱籽粒進行透射電鏡觀察，結(jié)果見圖7。野生型胚乳細(xì)胞中淀粉粒排列緊密，部分大淀粉粒融合成大塊狀；而轉(zhuǎn)基因植株淀粉粒排列疏松，細(xì)胞中存在多處孔隙（圖7中1、2，4，5）。野生型胚乳細(xì)胞中蛋白質(zhì)體數(shù)量較多且有一些體積較大，而轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)體數(shù)量較少，體積較?。▓D7 中2、3、5、6）。有研究報道，玉米o2 基因突變體在灌漿過程中蛋白質(zhì)體體積明顯變小[16]，這與本試驗結(jié)果一致。有研究表明，玉米籽粒胚乳中由于α-醇溶蛋白含量的降低，蛋白質(zhì)體的數(shù)量變少且體積變小，在種核脫水過程中不能形成堅硬、致密的組織，容易導(dǎo)致玉米種核松軟、易碎[17]。本試驗中轉(zhuǎn)基因植株籽粒胚乳細(xì)胞內(nèi)含物排列不緊密，空隙多，也可能由于高粱籽粒在灌漿脫水過程中蛋白質(zhì)體數(shù)量減少和體積變小所導(dǎo)致，進而使籽粒中醇溶蛋白含量降低。
圖7 高粱籽粒胚乳細(xì)胞中淀粉粒和蛋白質(zhì)體的透射電鏡觀察Fig.7 Transmission electron microscopy of starch granule and protein bodies in endosperm of sorghum grain
3 結(jié)語
本研究獲得了通過RNAi 技術(shù)抑制opaque2 基因的高粱轉(zhuǎn)基因植株，其中80%的植株籽粒中醇溶蛋白含量降低，但由opaque2 基因調(diào)控的降低機制還需深入研究。同時，所得種子后代品質(zhì)特性也需進一步確定。
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高粱籽粒包含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素和少量的灰分及蠟質(zhì)。蛋白質(zhì)約含6.8%～19.6%，是高粱中除淀粉以外含量最多的成分[2]。但是，高粱蛋白富含半胱氨酸，缺乏人體必需的賴氨酸和色氨酸，在禾谷類作物中消化率最低，約為30%～80%[3]，且會導(dǎo)致以高粱為主要蛋白食物的人嚴(yán)重營養(yǎng)不良[4]。高粱的主要貯藏蛋白為醇溶蛋白，約占高粱總蛋白的77%～82%[5]，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量和氨基酸序列組成被分成α、β、γ 和δ 醇溶蛋白，與玉米相似[6-7]。而α-醇溶蛋白占高粱醇溶蛋白總量的66%～84%[8]。而轉(zhuǎn)錄因子Opaque2（O2）可通過識別啟動子上O2 box（TCCACGT）來調(diào)控玉米22 kDa α-醇溶蛋白和15 kDa β-醇溶蛋白的基因表達(dá)[9-10]，O2 基因的突變能降低α-醇溶蛋白的含量，在有的玉米近交品系中α-醇溶蛋白能減少60%以上[11]，并會增加富含賴氨酸和酪氨酸蛋白質(zhì)的積累[12]。隨著社會和經(jīng)濟的發(fā)展，人們追求高生活品質(zhì)的同時很注重保健。在食物方面更青睞營養(yǎng)價值高，有益于健康的粗糧食材，而高粱產(chǎn)品從古至今一直被人們所喜愛。因此，有望在高粱醇溶蛋白合成調(diào)控基礎(chǔ)上，通過生物技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化改良高粱蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)。
目前為止，高粱育種主要集中在增加產(chǎn)量、提高抗性和降低單寧等方面，而在降低醇溶蛋白含量方面罕見報道。眾所周知，傳統(tǒng)育種針對性較差、分子機制不清楚、且費時耗力，收效??；而通過生物技術(shù)進行遺傳轉(zhuǎn)化可省時，收效大。近年產(chǎn)生的新技術(shù)RNA 干擾（RNA interference，RNAi）介導(dǎo)的基因沉默具有特異、高效的特點，植物中運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)所形成的RNAi 可以遺傳到下一代。本研究將構(gòu)建的opaque2 基因RNA 抑制表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化高粱幼胚，通過測定轉(zhuǎn)基因植株籽粒中醇溶蛋白含量，觀察胚乳中蛋白質(zhì)體形狀變化，以及SDS-PAGE 電泳檢測等來分析RNAi 靶向沉默opaque2 基因?qū)Ω吡淮既艿鞍缀康挠绊?。以期篩選出籽粒中醇溶蛋白含量低的優(yōu)質(zhì)株系，為擴展高粱的遺傳基礎(chǔ)和加快高粱品質(zhì)育種進程提供種質(zhì)資源和方法。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
高粱品種P898012 由美國密蘇里大學(xué)哥倫比亞分校遺傳轉(zhuǎn)化中心張展元實驗室惠贈；高粱組織培養(yǎng)中激素類IAA、6-BA 和IBA 均購自美國Sigma公司；頭孢噻肟購自美國Caisson 公司；草銨膦購自美國Sigma 公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、SpeI、KpnI、SacI、HindIII 和EcoRI，T4 DNA連接酶，Taq 聚合酶，載體T-Vector pMD20 等購自寶生物工程有限公司（大連）；PCR 產(chǎn)物純化和質(zhì)粒提取等試劑盒均購自天根生化科技有限公司（北京）；TRIZOL 購自美國invitrogen 公司；所有引物均由上海生工公司合成。
1.2 試驗方法
1.2.1 RNAi 抑制表達(dá)載體構(gòu)建 以GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中高粱opaque2 基因序列（登錄號X71636）上第1 個外顯子設(shè)計引物。一對引物帶有BamHI和SpeI 酶切位點；另一對帶有KpnI 和SacI 酶切位點。將2 個擴增目的片段分別連接到植物載體p130035SI-X 上，然后再用HindIII 和EcoRI 將帶有35S、目標(biāo)片段和NOS 片段切下后連接到pCambia3300 載體上，用篩選抗性草銨磷（Bar）基因替換掉潮霉素（hptII）基因。
1.2.2 高粱幼胚遺傳轉(zhuǎn)化 高粱幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化體系參照Do 等的方法進行[13]。取授粉11～14 d 高粱籽粒，經(jīng)消毒后剝離幼胚作為外植體。將opaque2 基因的RNAi 抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1 中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化高粱幼胚，通過誘導(dǎo)愈傷、草銨磷抗性篩選芽分化、根分化過程來獲得再生轉(zhuǎn)基因植株。
1.2.3 再生植株的陽性檢測與分析
1）再生植株的PCR 檢測。再生植株先通過葉片涂抹草銨磷溶液來進行初步篩選，若葉片涂抹處未變黃焦枯，則初步認(rèn)定其為陽性轉(zhuǎn)基因植株。然后提取葉片DNA，使用Bar 基因和載體上序列設(shè)計引物進行PCR 檢測確定。構(gòu)建載體及再生植株陽性檢測的引物見表1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
2）轉(zhuǎn)基因植株實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。取葉片檢測呈陽性植株開花20 d 的籽粒，用Trizol 試劑盒分別提取胚乳總RNA，依據(jù)產(chǎn)品說明書，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。以高粱actin 基因為內(nèi)參（擴增引物為actin-F：TTGGGTCAGAAA GGTTCAGG 和actin-R：TGCTCATTCGATCAGCAAT C），以opaque2 基因序列設(shè)計引物（o2-F：CAAGCTG AAGAGCCAACCAT 和o2-R：AGAGTTGATCCGGA GGAGGT），利用SYBR 熒光染料法進行qRT-PCR檢測，并分析opaque2 基因的相對表達(dá)量。
1.2.4 高粱籽粒醇溶蛋白含量測定及SDS-PAGE電泳 高粱籽粒中醇溶蛋白含量測定參照文獻(xiàn)[14]。各轉(zhuǎn)基因植株收獲籽粒后，隨機取20 粒烘干至恒重后，研磨至粉末狀。稱取高粱籽粒粉末50 mg加到2.0 mL 離心管中，按1∶10 比例（g/mL）加入含4% DDT 的60%叔丁醇提取液500 μL，混勻后在37℃水浴過夜提取，8 000 r/min 離心15 min，取上清測定醇溶蛋白含量。蛋白含量測定采用考馬斯亮蘭G-250 方法。高粱籽粒醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳參照Hamaker 的方法進行[15]，略有修改。取300 μL 提取液減壓蒸發(fā)溶劑，使蛋白質(zhì)沉淀。加入100 μL 5X電泳上樣緩沖液（不含溴酚藍(lán)）溶解蛋白質(zhì)。取10 μL 溶解蛋白樣品與10 μL 的含有溴酚藍(lán)的5X 電泳上樣緩沖液混合后沸水浴處理5 min，取15 μL樣品用15%的分離膠電泳檢測。
1.2.5 高粱籽粒透射電鏡觀察 高粱籽粒用2.5%戊二醛在4 ℃固定，PBS 緩沖液沖洗3 次。1%鋨酸在4 ℃后固定2 h，仍用PBS 緩沖液沖洗3 次。使用30%、50%、70%、90%和100%系列的乙醇梯度脫水，每次10 min，100%乙醇梯度脫水2 次。然后用Epon812 環(huán)氧樹脂包埋，在37、45 ℃和65 ℃溫箱固化，各級溫度固化24 h。經(jīng)UltracutE 超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色后，用日立H-7560 透射電子顯微鏡觀察并拍照。
2 結(jié)果與分析
2.1 構(gòu)建RNAi 抑制表達(dá)載體
RNAi 抑制表達(dá)載體構(gòu)建過程如圖1 所示。用高粱opaque2 基因序列第1 個外顯子上帶有BamHI和SpeI 酶切位點，KpnI 和SacI 酶切位點的兩對引物進行RT-PCR，分別擴增出2 條長度約為224 bp的目標(biāo)片段（圖1（a））。在將2 條目標(biāo)片段1 正1 反分別連接到植物載體p130035SI-X 上后，用BamHI和SacI 2 個內(nèi)切酶酶切載體進行驗證。由于載體上連接的2 條目標(biāo)序列間還存在1 個118 bp 長度的內(nèi)含子，在酶切后產(chǎn)生除線性載體外的一個約566 bp 的短片段（圖1（b））。由于載體p130035SI-X 上的植物抗性篩選基因為hptII 基因，其不利于高粱抗性植株的篩選。因此，使用HindIII 和EcoRI 將新構(gòu)建的p130035SI-X 載體上帶有35S 啟動子、目標(biāo)片段和 NOS 終止子片段切下后連接到pCambia3300 載體上，用篩選抗性Bar 基因替換掉hptII 基因。用HindIII 和EcoRI 2 個內(nèi)切酶酶切新構(gòu)建的pCambia3300 載體進行驗證，產(chǎn)生除線性載體外的一個約1 700 bp 的片段（圖1（c）），結(jié)果表明帶有opaque2 基因片段的RNAi 抑制表達(dá)載體構(gòu)建成功。
圖1 RNAi 載體構(gòu)建電泳Fig.1 Electrophoregram of RNAi vector construction
2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)opaque2 基因RNAi 抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)化高粱
以高粱幼胚為外植體，利用農(nóng)桿菌將opaque2基因RNAi 抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)化高粱品種P898012 的過程如圖2 所示。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化幼胚共培養(yǎng)3 d 后，幼胚長大并在胚周圍產(chǎn)生色素（圖2（a））。在草銨磷抗性篩選培養(yǎng)基上，抗性愈傷白色致密，而非抗性愈傷則水浸狀褐色，甚至變黑（圖2（b））。在誘導(dǎo)芽分化的草銨磷抗性篩選培養(yǎng)基上，抗性愈傷組織可先后分化出從生苗，而有些愈傷則變黑壞死（圖2（c））。將苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根（圖2（d））后，移苗至土中。
圖2 高粱遺傳轉(zhuǎn)化Fig.2 Genetic transformation of sorghum
2.3 陽性轉(zhuǎn)基因植株檢測與分析
2.3.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測 再生幼苗葉片涂抹100 mg/L 草銨磷，若涂抹葉片在3 片以上未發(fā)生黃褐色焦枯，則初步認(rèn)為其為陽性植株。取葉片提取DNA，用Bar 基因引物以葉片DNA 為模板進行PCR 擴增，目標(biāo)片段約為552 bp，結(jié)果見圖3（a），野生型植株未擴增出目標(biāo)條帶，而有些轉(zhuǎn)基因植株可擴增出目標(biāo)條帶。再用載體上兩個插入片段間內(nèi)含子設(shè)計的上游引物，和在其后載體上設(shè)計的下游引物，以DNA 為模板進行PCR 擴增，目標(biāo)片段約為591 bp，結(jié)果見圖3（b）?？梢姡趐Cambia3300 載體上擴增出極亮目標(biāo)條帶，而在以H2O 為模板的陰性對照和野生型植株中均未擴出目標(biāo)條帶；有些轉(zhuǎn)基因植株可擴增出目標(biāo)條帶。經(jīng)過多次檢測，將用不同引物可同時擴增出相應(yīng)目標(biāo)條帶的植株確定為轉(zhuǎn)基因植株，本試驗共獲得5 株。
2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR 檢測分析 以高粱actin 基因為內(nèi)參，采用qRT-PCR 對高粱胚乳中opaque2 基因的表達(dá)量進行檢測，見圖4。結(jié)果表明，除1 號外，其余4 株轉(zhuǎn)基因植株中opaque2 基因的表達(dá)量較對照顯著降低（P＜0.05），但不同植株表現(xiàn)不同，12 號下降程度更大?？梢?，通過RNAi 技術(shù)可對轉(zhuǎn)基因高粱植株opaque2 基因造成不同程度的干擾。
圖3 陽性植株檢測電泳圖Fig.3 Electrophoregram of detecting the positive plants
2.4 高粱籽粒醇溶蛋白含量測定及SDS-PAGE電泳
2.4.1 籽粒中醇溶蛋白含量測定 RNAi 抑制opaque2 轉(zhuǎn)基因高粱籽粒醇溶蛋白含量見圖5。從圖5 中可見，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株中4 株籽粒的醇溶蛋白含量顯著降低（P＜0.05），只有1 號植株醇溶蛋白含量未下降?？梢?，通過RNAi 抑制opaque2基因可有效影響高粱籽粒中醇溶蛋白的合成和積累。文獻(xiàn)[15]在玉米上的研究表明，以opaque2（o2）基因突變體W64Ao2 為材料，運用RNAi 技術(shù)抑制Ohp（O2 heterodimerizing protein）、Pbf（Prolaminebox binding factor）的突變體和Pbf/Ohp 雙基因突變體，其醇溶蛋白含量與野生型相比分別下降83%、89%和90%，opaque2、PBF 及OHP 三者間以效應(yīng)物和協(xié)同作用的模式在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控醇溶蛋白基因表達(dá)。但本實驗中轉(zhuǎn)基因植株中醇溶蛋白含量未與RNAi 抑制opaque2 基因程度完全吻合，其原因還需進一步研究。
圖4 轉(zhuǎn)基因植株opaque2 基因表達(dá)的qRT-PCR 檢測結(jié)果Fig.4 Result of opaque2 gene expression in the transgenic plants by qRT-PCR assay
圖5 高粱籽粒中醇溶蛋白含量Fig.5 Kafirin content in grains
2.4.2 醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳 醇溶蛋白SDSPAGE 電泳如圖6，供試野生型和各轉(zhuǎn)基因植株的醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳帶型相同，約在15、20 kDa 和22 kDa 處出現(xiàn)3 條帶，可推測通過RNAi 技術(shù)抑制opaque2 基因后，僅影響了醇溶蛋白含量，而未影響醇溶蛋白種類及存在方式。參照文獻(xiàn)[15]對高賴氨酸高粱突變體P721 Q 進行SDS-PAGE 電泳結(jié)果可知，20 kDa 處條帶為β-醇溶蛋白，22 KDa處條帶為α-醇溶蛋白，但缺少分子量較大的γ-醇溶蛋白條帶。參照玉米醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳結(jié)果[15-16]推測15 KDa 處的可能為高粱的δ-醇溶蛋白。
圖6 高粱籽粒中醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳Fig.6 SDS-PAGE analysis of kafirin in grains
2.5 高粱籽粒胚乳細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果
選取轉(zhuǎn)基因植株9 號和野生型高粱籽粒進行透射電鏡觀察，結(jié)果見圖7。野生型胚乳細(xì)胞中淀粉粒排列緊密，部分大淀粉粒融合成大塊狀；而轉(zhuǎn)基因植株淀粉粒排列疏松，細(xì)胞中存在多處孔隙（圖7中1、2，4，5）。野生型胚乳細(xì)胞中蛋白質(zhì)體數(shù)量較多且有一些體積較大，而轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)體數(shù)量較少，體積較?。▓D7 中2、3、5、6）。有研究報道，玉米o2 基因突變體在灌漿過程中蛋白質(zhì)體體積明顯變小[16]，這與本試驗結(jié)果一致。有研究表明，玉米籽粒胚乳中由于α-醇溶蛋白含量的降低，蛋白質(zhì)體的數(shù)量變少且體積變小，在種核脫水過程中不能形成堅硬、致密的組織，容易導(dǎo)致玉米種核松軟、易碎[17]。本試驗中轉(zhuǎn)基因植株籽粒胚乳細(xì)胞內(nèi)含物排列不緊密，空隙多，也可能由于高粱籽粒在灌漿脫水過程中蛋白質(zhì)體數(shù)量減少和體積變小所導(dǎo)致，進而使籽粒中醇溶蛋白含量降低。
圖7 高粱籽粒胚乳細(xì)胞中淀粉粒和蛋白質(zhì)體的透射電鏡觀察Fig.7 Transmission electron microscopy of starch granule and protein bodies in endosperm of sorghum grain
3 結(jié)語
本研究獲得了通過RNAi 技術(shù)抑制opaque2 基因的高粱轉(zhuǎn)基因植株，其中80%的植株籽粒中醇溶蛋白含量降低，但由opaque2 基因調(diào)控的降低機制還需深入研究。同時，所得種子后代品質(zhì)特性也需進一步確定。
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