負(fù)載光敏劑D-甘露糖修飾膠束的制備及其在靶向光動(dòng)力治療中的應(yīng)用

蔡 穎，王勝濤，魏 朋，張 權(quán)，尹 健*

（1.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

光動(dòng)力療法（Photodynamic Therapy，PDT）是治療腫瘤疾病的一種非侵入性新技術(shù)[1-2]。這種治療策略主要依賴于單線態(tài)氧（1O2）的產(chǎn)生[3]：當(dāng)?shù)桶刀拘怨饷羲幬镌谀[瘤組織區(qū)域富集后，向腫瘤部位給予特定波長(zhǎng)的光照，光敏藥物吸收特定波長(zhǎng)的光躍遷至激發(fā)態(tài)；此時(shí)處于激發(fā)態(tài)的光敏藥物會(huì)將能量傳遞給周?chē)[瘤組織和細(xì)胞中的基態(tài)氧，產(chǎn)生活性很強(qiáng)的單線態(tài)氧，單線態(tài)氧和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損和死亡[4-5]。

目前，用于光動(dòng)力療法的光敏劑種類已經(jīng)被廣泛開(kāi)發(fā)，主要包括卟啉、二氫卟酚、酞菁、氟硼二吡咯（簡(jiǎn)稱BODIPY）等[6-7]。這些光敏劑具有高熒光量子產(chǎn)率、高光穩(wěn)定性、良好化學(xué)穩(wěn)定性和易于化學(xué)修飾等性質(zhì)，但其在水中溶解性較差，而且缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性[8-9]，因此嚴(yán)重制約了其在光動(dòng)力療法臨床上的應(yīng)用。近年來(lái)，已有許多報(bào)道利用新型靶向輸送系統(tǒng)在改善光敏劑性能方面取得了很大的進(jìn)步，但仍需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)安全高效的新型輸送載體材料用于靶向光動(dòng)力治療研究。

膠束是一類藥物輸送系統(tǒng)。具有良好生物相容性的兩親性大分子能在水中自組裝形成膠束[10]。對(duì)疏水性的光敏劑進(jìn)行親水性修飾，或以包載的形式構(gòu)建成具有光敏特性的膠束，可以滿足光動(dòng)力治療的要求。同時(shí)，由于腫瘤區(qū)域增強(qiáng)滲透與滯留（EPR）效應(yīng)[11]的存在，通過(guò)構(gòu)建適宜粒徑的具光敏特性的膠束可以實(shí)現(xiàn)很好的被動(dòng)靶向作用，進(jìn)一步提高光動(dòng)力治療的效率，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。但僅依靠EPR 作用不足以實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞選擇性光動(dòng)力治療；通常采用對(duì)光敏劑修飾靶向性分子或用具有靶向性的膠束包載光敏劑的方式，實(shí)現(xiàn)靶向光動(dòng)力治療的目的。由于癌組織區(qū)域細(xì)胞的特殊的生長(zhǎng)性質(zhì)，其會(huì)在細(xì)胞膜表面過(guò)度表達(dá)多種靶向受體；而一些功能性靶向分子，例如透明質(zhì)酸[12]、抗體[13]、多肽[14]、葉酸[15]等，能特異型識(shí)別這些受體，所以表面修飾有靶向分子的膠束能被癌細(xì)胞通過(guò)受體介導(dǎo)識(shí)別方式大量攝取，從而達(dá)到靶向輸送光敏劑進(jìn)行光動(dòng)力治療的目的，降低光動(dòng)力治療對(duì)正常細(xì)胞的毒性。

甘露糖作為一類靶向性小分子已被應(yīng)用于靶向藥物輸送的研究中[16]。近年來(lái)，已有研究表明修飾有甘露糖的納米載體能夠特異性識(shí)別甘露糖受體[17]，而達(dá)到靶向給藥的目的；但利用甘露糖的靶向作用，實(shí)現(xiàn)選擇性光動(dòng)力治療的研究鮮有報(bào)道。本文以D-甘露糖修飾的兩親性β-環(huán)糊精（β-CD）制備膠束，另外合成金剛烷（Ad）修飾的BODIPY 光敏劑分子，利用β-CD 與Ad 之間主客體識(shí)別[18]原理制備高負(fù)載光敏劑的膠束，考察其理化性質(zhì)和光動(dòng)力治療性能。以表面甘露糖受體高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 作為細(xì)胞模型，考察了負(fù)載光敏劑聚合物膠束通過(guò)甘露糖受體識(shí)別作用被MDA-MB-231 癌細(xì)胞攝入并用于靶向光動(dòng)力治療的性能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1-金剛烷甲酸（99%）、2-（2-氨基乙氧基）乙醇（99%）、對(duì)甲苯磺酰氯（TsCl，99%）、2，4-二甲基吡咯（97%）、N-碘代丁二酰亞胺（NIS，99%）、2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（DDQ，98%）、對(duì)甲基苯磺酸（98%）、三氟甲磺酸三甲基硅酯（TMSOTf，99%）、3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2H-四氮唑鎓溴化物（MTT，98%）、（+）-L-抗壞血酸鈉（99%）、五水硫酸銅（CuSO4·5H2O，98%）、炔丙醇（99%）均于百靈威科技有限公司購(gòu)買(mǎi)；9，10-蒽基-雙（亞甲基）二丙二酸（ABDA）、4’，6-二脒基-2’-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)于sigma 試劑有限公司；D-甘露糖（D-Mannose，分析純）、β-環(huán)糊精（β-CD，98%）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

AVANCE 400M 型核磁共振儀，德國(guó)Bruker 公司生產(chǎn)；熒光分光光度計(jì)，美國(guó)Agilent 公司生產(chǎn)；Nano ZS 動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS），英國(guó)Malvern 公司生產(chǎn)；UV-3 900 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本日立公司生產(chǎn)；JEM-2 100 透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會(huì)社生產(chǎn)；激光共聚焦顯微鏡（CLSM），日本尼康株式會(huì)社生產(chǎn)；Enspire 多標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)，美國(guó)PerkinElmer 公司生產(chǎn)。

1.3 D-甘露糖修飾的兩親性β-CD（C3-CDMan7）與光敏劑BTA 的合成

D-甘露糖修飾的丙?；h(huán)糊精分子C3-CDMan7的化學(xué)合成方法參照文獻(xiàn)[19]。共價(jià)鍵連金剛烷（Ad）的BODIPY 光敏劑分子（BTA）的合成方法參照文獻(xiàn)[20]。

1.4 負(fù)載光敏劑BTA 膠束（BTA@C3-CD-Man7）的制備

采用透析凍干法制備高負(fù)載光敏劑膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7。準(zhǔn)確稱取C3-CD-Man7（150 mg，41.44 μmol）和光敏劑BTA（12 mg，7.75 μmol）；用3 mL DMSO 溶解C3-CD-Man7，室溫下攪拌2 h，制得溶液①；另用3 mL DMSO 溶解BTA，室溫下攪拌2 h，制得溶液②。然后將溶液②加入溶液①，再在室溫下攪拌2 h，獲得混合溶液。再向上述混合溶液中，緩慢滴加20 mL DD H2O，并于室溫下攪拌30 min。然后將制備的BTA@C3-CD-Man7溶液轉(zhuǎn)移到透析袋（MW 2 000）中透析2 d，每6 h 換一次水，除去DMSO。冷凍干燥所獲澄清綠色溶液，獲得BTA@C3-CD-Man7粉末。

1.5 膠束的TEM 與DLS 表征

對(duì)于TEM 樣品的制備，分別稱取C3-CD-Man7和BTA@C3-CD-Man7并配制兩種膠束的水溶液（1 mg/mL）；各取50 μL 上述溶液，滴加于電鏡銅網(wǎng)上，并對(duì)膠束C3-CD-Man7的銅網(wǎng)用磷鎢酸復(fù)染處理，待兩種TEM 樣品晾干后，于電鏡下進(jìn)行觀察。對(duì)于DLS 樣品的制備，分別配制濃度為200 μg/mL C3-CD-Man7和BTA@C3-CD-Man7的10%胎牛血清培養(yǎng)液，并各取上述溶液1 mL，通過(guò)DLS 在25°C 條件下測(cè)定其流體力學(xué)直徑。

1.6 BTA@C3-CD-Man7中BTA 含量的測(cè)定

BTA@C3-CD-Man7中負(fù)載光敏劑BTA 的質(zhì)量百分比通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-3 900）進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。分別配制光敏劑BTA 的DMSO 溶液（1 mg/mL）和BTA@C3-CD-Man7的DMSO 溶液（1 mg/mL）待用。稱取BTA 固體粉末，并配制濃度為5、10、15、20、25、30 μg/mL 的系列溶液，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)BTA 在300～800 nm 波段內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定其在最大吸收665 nm 處的吸光度。以吸光度A 與質(zhì)量濃度c 作圖，制作光敏劑BTA 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算出BTA 的質(zhì)量濃度與吸光度之間的線性關(guān)系，進(jìn)而測(cè)定BTA@C3-CD-Man7中BTA 的百分含量。

1.7 BTA@C3-CD-Man7產(chǎn)單線態(tài)氧性能的測(cè)定

單線態(tài)氧捕獲劑ABDA 能被氧化導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，從而表征負(fù)載光敏劑的膠束產(chǎn)單線態(tài)氧的性能[21]。準(zhǔn)確稱取兩份1 mg ABDA，分別用DMSO、DD H2O 溶解，配制成兩種1 mg/mL 母液待用；再配制1 mg/mL BTA@C3-CD-Man7水溶液。通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定，選取終質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL 的ABDA 溶液為宜。然后分別配制四種溶液：0.5 μg/mL ABDA 的水溶液、0.5 μg/mL ABDA 的DMSO 溶液，0.5 μg/mL ABDA+0.04 mg/mL BTA@C3-CD-Man7的水溶液和其DMSO 溶液。用LED 光源（665 nm，20 mW/cm2）分別對(duì)上述溶液進(jìn)行10、20、30、40 min照射，在激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm 的條件下，分別測(cè)定上述各溶液在熒光波段（390～500 nm）處的熒光光譜。

1.8 甘露糖受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞

將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h，使其貼壁生長(zhǎng)。加入含有BTA@C3-CD-Man7（160 μg/mL）的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次。將癌細(xì)胞用4.0% 甲醛在室溫下固定15 min 后，移除甲醛溶液，1 mL PBS 清洗2 次，再用4’，6-二脒基-2’-苯基吲哚（DAPI，1 μg/mL）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色15 min[22]，最后用PBS 溶液清洗2 次。利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察BTA@C3-CD-Man7在細(xì)胞內(nèi)部的分布狀態(tài)（激發(fā)波長(zhǎng)：408/561 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：417～477/570～1 000 nm）。

1.9 小分子甘露糖競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)

與上述細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)相似，先將MDA-MB-231癌細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，讓其貼壁生長(zhǎng)24 h。然后再加入含過(guò)量小分子甘露糖的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)于孵育箱中培養(yǎng)4 h。移除舊的培養(yǎng)基，加入含有BTA@C3-CD-Man7（160 μg/mL）的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次。對(duì)細(xì)胞樣依次經(jīng)4.0%甲醛固定，DAPI 染色15 min，PBS 緩沖液清洗處理。最后，利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察BTA@C3-CD-Man7被癌細(xì)胞吸收的情況（激發(fā)波長(zhǎng)：408/561 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：417～477/570～1 000 nm）。

2.0 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

采用MTT 法對(duì)空白膠束和負(fù)載光敏劑膠束的光暗細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)[23]。將人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231 種植于96 孔板內(nèi)，每孔約10 000 個(gè)細(xì)胞。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞24 h 后，加入含BTA@C3-CD-Man7或C3-CD-Man7的10%胎牛血清培養(yǎng)基，確定體系中所含光敏劑BTA 的質(zhì)量濃度為20 μg/mL，繼續(xù)于孵育箱中培養(yǎng)一段時(shí)間。待24 h 后，分別進(jìn)行665 nm LED 光源照射30 min和黑暗環(huán)境處理后，移除培養(yǎng)液，用pH 7.4 的PBS緩沖溶液清洗2 次，每孔中加入100 μL MTT 培養(yǎng)液（0.5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除每個(gè)孔內(nèi)MTT 培養(yǎng)液，再加入100 μL DMSO，振蕩10 min，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm 處各孔的吸光值（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTA@C3-CD-Man7的設(shè)計(jì)制備及其光動(dòng)力治療策略

通過(guò)β-CD 和金剛烷超分子識(shí)別作用將甘露糖功能化β-CD 固定到光敏劑納米聚集體表面，從而制備了表面甘露糖功能修飾的光敏劑納米粒子[20]。然而由于上述研究的納米粒子在水溶液中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性較差，因此需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有高穩(wěn)定性的負(fù)載光敏劑輸送載體材料。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，本研究希望通過(guò)C3-CD-Man7自組裝形成膠束，同時(shí)包載BTA 進(jìn)入膠束的疏水性空腔，從而提高負(fù)載BTA 膠束的穩(wěn)定性，并將其應(yīng)用于靶向光動(dòng)力治療的研究中。

通過(guò)透析凍干法制得新型負(fù)載光敏劑膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7，并將其應(yīng)用于靶向光動(dòng)力治療人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的研究中。如圖1 所示，將所獲具有靶向作用的BTA@C3-CD-Man7與MDA-MB-231 癌細(xì)胞共培養(yǎng)。利用甘露糖受體識(shí)別介導(dǎo)光敏劑BTA 被癌細(xì)胞內(nèi)吞，并在665 nm LED燈照射下誘導(dǎo)胞質(zhì)內(nèi)的基態(tài)氧產(chǎn)生單線態(tài)氧，進(jìn)而氧化殺傷癌細(xì)胞；這里細(xì)胞中基態(tài)氧主要以三線態(tài)氧（3O2）形式存在。

圖1 BTA@C3-CD-Man7的結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用于靶向光動(dòng)力治療的示意Fig.1 Schematic illustration of BTA@C3-CD-Man7for targeted PDT

2.2 膠束的DLS 與TEM 表征

優(yōu)良的兩親性納米載體需具有良好的結(jié)構(gòu)外形和穩(wěn)定性。通過(guò)TEM 觀察膠束的形貌和粒徑，用DLS 測(cè)定膠束的水合粒徑分布以及一段時(shí)間內(nèi)在生物溶劑中的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)TEM 與DLS 的結(jié)果，空白膠束C3-CD-Man7在負(fù)載光敏劑BTA 后，平均粒徑明顯增大。由于在溶液中膠束表面會(huì)形成水合層，其流體力學(xué)粒徑明顯大于TEM測(cè)得的真實(shí)粒徑，對(duì)比空白膠束的TEM 和DLS 的結(jié)果可知，其由TEM 測(cè)得真實(shí)直徑30 nm 左右變?yōu)镈LS 測(cè)得的流體力學(xué)直徑110 nm 左右（圖2（a）和圖2（c））；負(fù)載光敏劑膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7也呈現(xiàn)類似的結(jié)果（圖2（b））。而圖2（c）則表示兩種膠束的動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中C3-CD-Man7的PDI 值 為0.210，BTA@C3-CD-Man7的PDI 值 為0.291，這表明兩者均一性較好。另外，選取3 d 來(lái)考察空白膠束C3-CD-Man7以及負(fù)載光敏劑膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中穩(wěn)定性，一般3 d 是藥劑在生物體內(nèi)循環(huán)作用的時(shí)間；從圖2（d）中則可以看出，在培養(yǎng)基中兩種膠束流體力學(xué)直徑波動(dòng)較小，在這段時(shí)間內(nèi)膠束的整體結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，滿足光動(dòng)力治療的要求。

圖2 C3-CD-Man7和BTA@C3-CD-Man7的透射電鏡照片，水溶液中的流體力學(xué)直徑分布圖以及在10%胎牛血清培養(yǎng)基中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性Fig.2 TEM images，hydrodynamic size distributions in water and long-term colloidal stability in culture medium with 10% FBS of the micelles

2.3 BTA@C3-CD-Man7中BTA 含量的測(cè)定

膠束僅作為輸送載體，介導(dǎo)光敏劑在腫瘤組織中富集并用于光動(dòng)力治療時(shí)需明確光敏劑的量。通過(guò)紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定一系列濃度下光敏劑BTA 在最大吸收665 nm 處的最大吸光度，制定出BTA 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，從而表征BTA 濃度與吸光度之間的線性關(guān)系。結(jié)果如圖3 所示：從圖3（a）中可以明顯看出不同濃度下BTA 在665 nm 處均有最大吸光度；進(jìn)而繪制其標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見(jiàn)圖3（b）。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明光敏劑的濃度與其最大吸收處的吸光度兩者之間具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)朗伯比爾定律科：

式中：A 為吸光度；T 為透射比；b 為吸收層厚度；c為吸光物質(zhì)的質(zhì)量濃度；K 為吸光系數(shù)，只與物質(zhì)本身性質(zhì)相關(guān)。光敏劑BTA 的吸光系數(shù)K 為0.048 6。

根據(jù)上述測(cè)定方法，取負(fù)載光敏劑膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7加入1 mL DMSO 中破壞膠束，測(cè)定其吸光度，即可知道膠束中光敏劑BTA 濃度與吸光度之間的關(guān)系。通過(guò)計(jì)算，可知負(fù)載光敏劑膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7中BTA 的質(zhì)量百分比為14%。另外，本文對(duì)末端未共價(jià)鍵連金剛烷的BODIPY 光敏劑，按上述相同的方法制備另一種載光敏劑膠束，并對(duì)其確切的包載量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其包載率僅為5%左右，這些結(jié)果表明由于β-CD 與金剛烷之間的超分子識(shí)別作用，由C3-CDMan7自組裝形成膠束包載BTA 的能力明顯增強(qiáng)。

圖3 B TA 的紫外可見(jiàn)光譜圖和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.3 UV -vis spectrum andthe standard curve of photosensitizer BTA in DMSO

2.4 BTA@C3-CD-Man7產(chǎn)單線態(tài)氧的研究

光敏劑產(chǎn)單線態(tài)氧（1O2）的能力是衡量其光動(dòng)力治療效果的重要指標(biāo)。光敏劑在特定波長(zhǎng)的光照下產(chǎn)生的單線態(tài)氧能將其捕獲劑ABDA 氧化，進(jìn)而導(dǎo)致ABDA 在其特征吸收光帶（390～500 nm）處熒光強(qiáng)度降低，通過(guò)這種方式間接地表征單線態(tài)氧的產(chǎn)生。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示：在有機(jī)溶劑DMSO 中在光照條件下下不斷產(chǎn)生有單線態(tài)氧（1O2）產(chǎn)生，而ABDA 捕獲1O2后導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變，熒光猝滅，熒光強(qiáng)度下降，通過(guò)連續(xù)階段的光照，ABDA 的熒光強(qiáng)度不斷的降低（圖4（a））；而在去離子水中，即便給予長(zhǎng)時(shí)間光照，也不能產(chǎn)生單線態(tài)氧，故而單線態(tài)氧捕獲劑ABDA 的熒光強(qiáng)度不變（圖4（b））。這一現(xiàn)象主要是由于BTA@C3-CD-Man7在兩種溶劑中存在形式的不同引起：其在DMSO 中以分子狀態(tài)存在，而在水中則以膠束的形式存在。

以上實(shí)驗(yàn)證明BTA@C3-CD-Man7以分子狀態(tài)存在時(shí)能夠在近紅外光照射下不斷產(chǎn)生單線態(tài)氧，滿足光動(dòng)力治療殺傷癌細(xì)胞的條件。為了考察溶劑因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，另做兩組空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：①ABDA 的水溶液在連續(xù)光照下熒光光譜；②ABDA 的DMSO 溶液在連續(xù)光照下熒光光譜。結(jié)果表明了單線態(tài)氧捕獲劑ABDA 在水相或油相中穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度不會(huì)改變，也證實(shí)了上述實(shí)驗(yàn)中ABDA熒光強(qiáng)度的改變僅是光敏劑在起作用。

2.5 甘露糖受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞

利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM），考察BTA@C3-CD-Man7經(jīng)甘露糖受體介導(dǎo)被人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 內(nèi)吞的性能，研究甘露糖的靶向作用。BTA@C3-CD-Man7與MDA-MB-231 癌細(xì)胞在5% CO2的孵育箱中共培養(yǎng)24 h 后，依次用4%甲醛固定，1 μg/mL DAPI 染色，pH 7.4 PBS 溶液清洗保存，然后使用激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果見(jiàn)圖5，癌細(xì)胞的細(xì)胞核經(jīng)過(guò)DAPI 染色而呈現(xiàn)藍(lán)色，光敏劑BTA 呈現(xiàn)紅色熒光，通過(guò)兩者疊加圖，可以明顯地看到BTA 被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。

由于甘露糖受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞，負(fù)載光敏劑膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7具有良好的靶向性。將BTA@C3-CD-Man7與人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231共培養(yǎng)24 h 后，在癌細(xì)胞內(nèi)有大量紅色熒光，這些紅色熒光是由于BTA@C3-CD-Man7被內(nèi)吞入細(xì)胞后解組裝釋放BTA 分子所產(chǎn)生的（圖5（a））。而通過(guò)提前用過(guò)量的小分子甘露糖對(duì)癌細(xì)胞表面的甘露糖受體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)膠束靶向內(nèi)吞受阻和光敏劑BTA 的內(nèi)吞量減少，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度明顯降低（圖5（b））。上述靶向性細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和小分子甘露糖競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了甘露糖分子具有良好的靶向作用，也表明了負(fù)載光敏劑膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7能夠靶向識(shí)別乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 表面的甘露糖受體，并通過(guò)受體識(shí)別內(nèi)吞的方式進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了良好的靶向輸送光敏藥物的目的。

2.6 光動(dòng)力治療的細(xì)胞評(píng)價(jià)

細(xì)胞水平上的光動(dòng)力治療效果，作為衡量光敏劑用于光動(dòng)力療法的必要指標(biāo)。利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM），研究BTA@C3-CD-Man7被內(nèi)吞進(jìn)入癌細(xì)胞的情況，進(jìn)而在光動(dòng)力治療后對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、評(píng)價(jià)。

圖5 BTA@C3-CD-Man7（160 μg/mL）與癌細(xì)胞MDAMB-231 共培養(yǎng)24 h 后分別在無(wú)甘露糖環(huán)境和有小分子甘露糖競(jìng)爭(zhēng)下的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.5 CLSM images of MDA -MB -231 cancer cells incubated for 24 h with BTA@C3-CD-Man7（160 μg/mL）as indicated

結(jié)果如圖6 所示：在不對(duì)癌細(xì)胞給予LED（665 nm，20 mW/cm2）燈照射的條件下，光敏劑不會(huì)產(chǎn)生單線態(tài)氧而殺傷細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞核圓潤(rùn)，可以清晰地看見(jiàn)細(xì)胞整體外形（圖6（a））；而當(dāng)對(duì)癌細(xì)胞給予LED 光照30 min 時(shí)，光敏劑BTA將能量轉(zhuǎn)移給胞質(zhì)中的基態(tài)氧而產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2），進(jìn)而殺傷癌細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞整體形態(tài)萎縮，細(xì)胞明顯變小，細(xì)胞核也嚴(yán)重蜷縮變小，出現(xiàn)明顯的光動(dòng)力治療效果（圖6（b））。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)CLSM 直接觀察到MDA-MB-231 癌細(xì)胞在黑暗環(huán)境和給予光照條件下，癌細(xì)胞大小與形態(tài)以及細(xì)胞核大小與形態(tài)均出現(xiàn)明顯差異。表明BTA@C3-CD-Man7在體外細(xì)胞水平上有明顯的光動(dòng)力治療效果，初步滿足光敏劑用于光動(dòng)力治療的要求。

圖6 B TA@C3-CD-Man77（160 μg/mL）與癌細(xì)胞MDAMB-231 共培養(yǎng)24 h 后在黑暗環(huán)境或665 nm LED燈光照30 min 條件下的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.6 CLSM images about PDT of MDA -MB -231 cancer cells incubated with BTA@C3-CD-Man7（160 μg/mL）for 24 h followed

2.7 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

用于光動(dòng)力治療的光敏劑應(yīng)具有低的暗毒性，以及高的光動(dòng)力治療性能[24]。實(shí)驗(yàn)采用MTT 法分別考察空白膠束C3-CD-Man7和負(fù)載光敏劑BTA 膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7分別在黑暗和665 nm LED燈光照30 min 條件下對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7a 可知，隨C3-CD-Man7和BTA@C3-CDMan7劑量的增加，在不給予LED 燈光照的黑暗條件下，MDA-MB-231 癌細(xì)胞存活率略有降低；當(dāng)膠束的質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL（此時(shí)BTA@C3-CDMan7中BTA 的質(zhì)量濃度約為25 μg/mL）時(shí)，細(xì)胞存活率仍大于90%。這表明C3-CD-Man7具有良好的生物相容性，是一種優(yōu)良的靶向輸送載體；而且BTA@C3-CD-Man7表現(xiàn)為低暗毒性，滿足光敏劑低暗毒性的條件。而由圖7（b）可知，將甘露糖受體過(guò)度表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 分別與相同劑量的兩種膠束共同孵育后，在665 nm LED 光照條件下，癌細(xì)胞存活率表現(xiàn)出明顯差異；孵育有BTA@C3-CD-Man7的癌細(xì)胞存活率大大降低，當(dāng)其濃度達(dá)到200 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率僅為7%，表現(xiàn)出極高的光療效果；而LED 燈光照對(duì)孵育有C3-CD-Man7的癌細(xì)胞幾乎無(wú)毒副作用。

由于BTA@C3-CD-Man7能通過(guò)甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將光敏劑BTA 輸送進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)，在特定波長(zhǎng)（665 nm）光照下，BTA 能大量誘導(dǎo)單線態(tài)氧的產(chǎn)生，進(jìn)而殺傷癌細(xì)胞，表現(xiàn)出優(yōu)良的光動(dòng)力治療性能。因此，BTA@C3-CD-Man7是一種優(yōu)良的光動(dòng)力治療材料，可以靶向性地光動(dòng)力治療人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞。

圖7 C3-CD-Man7和BTA@C3-CD-Man7分別與MDAMB-231 癌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 后黑暗環(huán)境或665 nm LED 燈照射30 min 的細(xì)胞存活率（n=6）Fig.7 Viability of MDA-MB-231 cells after 24 h of incubation with C3-CD-Man7or BTA@C3-CDMan7at different doses followed byincubation in the dark or irradiation with LED light for 30 min（n=6）

3 結(jié)語(yǔ)

借助具有良好生物相容性的藥物輸送載體，靶向性地將用于光動(dòng)力治療的光敏劑輸送進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞中，減少其在正常組織和細(xì)胞中的分布，可以提高光動(dòng)力治療效率，同時(shí)降低毒副作用。本研究利用β-CD 與Ad 之間主客體識(shí)別原理制備BTA@C3-CD-Man7，其負(fù)載BTA 的量明顯提高，并將BTA@C3-CD-Man7應(yīng)用于人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的光動(dòng)力治療，考察其用于光動(dòng)力治療的性能。結(jié)果顯示，BTA@C3-CD-Man7能與MDA-MB-231 癌細(xì)胞表面的甘露糖受體特異性識(shí)別，而被人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 大量攝入并釋放BTA，在665 nm LED 光照下，表現(xiàn)出對(duì)乳腺癌細(xì)胞的靶向光動(dòng)力治療效果。因此，利用甘露糖的靶向作用以及環(huán)糊精與金剛烷的特異識(shí)別作用，新型高負(fù)載BTA 膠束B(niǎo)TA@C3-CD-Man7在乳腺癌的光動(dòng)力治療中具有極大的應(yīng)用潛力。