蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵產蟲草素的優(yōu)化

楊 帆，劉金彬，管政兵，廖祥儒，蔡宇杰

（江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

蛹蟲草是一種眾所周知的藥食用真菌，屬于蟲草屬真菌，通常寄生于鱗翅目昆蟲的幼蟲或蛹。蛹蟲草被廣泛用作草藥和補品，研究發(fā)現(xiàn)其具有多種多樣的生物活性，如抗腫瘤[1]，抗病毒[2]，輻射防護[3]，抗炎癥[4]，抗氧化[5]，降血壓[6]，增強免疫力[7]，以及抗真菌活性[8]等。在蛹蟲草中發(fā)現(xiàn)了一系列藥理活性成分，包括蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、類胡蘿卜素、溶栓酶[6]，以及超氧化物歧化酶[9]等。由于蛹蟲草具有吸引力的有益效果，在自然界很稀有，被認為是一種非常昂貴的真菌，同時被添加到功能性食品和保健品中[9-10]。

蟲草素在蛹蟲草藥理性質上起特別重要的作用，其所具有的重要的藥理價值被揭示，包括抗腫瘤，免疫調節(jié)，抗炎癥，抗氧化，降血脂，抗衰老，神經保護功能，腎臟保護作用[11]，抗菌活性[12]，抗病毒活性[13]，促進學習和記憶[14]，細胞凋亡[15]，和減輕類風濕性關節(jié)炎[16]。研究還將蟲草素作為治療白血病的藥物[17]。此外，蟲草素和噴司他丁聯(lián)合治療二期非洲錐蟲病的臨床前評估已進行[18]。上述研究都預示著蟲草素在未來有著良好的應用前景，實現(xiàn)蟲草素高效合成才能滿足大量的需求。

蟲草素的合成主要有化學合成和生物發(fā)酵。由于化學合成得到的蟲草素較難純化，且成本較高于生物發(fā)酵，所以主要研究集中到生物發(fā)酵上。生物發(fā)酵主要包括寄主培養(yǎng)、液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。寄主培養(yǎng)主要用來獲得蛹蟲草子實體，但蟲體感染成功率低，生產周期長，且蟲草素含量較低[19]。目前，液態(tài)發(fā)酵蟲草素產量最高達到14.3 g/L[20]，但是其發(fā)酵周期很長，生產效率較低。用固態(tài)發(fā)酵法生產蟲草素的文獻較少，且產量很低[21]。與其他發(fā)酵過程相比，固態(tài)發(fā)酵具有以下有點：體積較小，耗水量更低，減少污水處理成本，并能降低能耗。此外，固態(tài)發(fā)酵水活度低，不易染菌，產物濃度較高，下游處理較易進行。在自然條件下，蛹蟲草在僵硬的昆蟲上生長，分解昆蟲的尸體。而固態(tài)發(fā)酵條件與蛹蟲草生長的自然條件有相似之處，是蛹蟲草生長的理想發(fā)酵方式。本實驗室前期進行了一系列液態(tài)發(fā)酵的工作[22-24]，且通過誘變獲得一株性狀穩(wěn)定，具有高產潛力的菌株[24]。

綜上所述，本研究采用固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)蛹蟲草，對培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期得到較高的蟲草素產量，為蟲草素的大規(guī)模生產打下一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 蛹蟲草Cordyceps militaris JN168：保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO：M2011333。

1.1.2 主要材料及試劑 大米、小米、玉米、高粱、小麥、蕎麥：市售食品級，作基質用；蟲草素標準品：購自中國藥品生物制品檢定所；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（g/L）：PDA 培養(yǎng)基。

2）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，酵母浸膏10，七水硫酸鎂1.0，磷酸氫二鉀1.0，磷酸二氫鉀1.0。

3）固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：組培瓶體積350 mL，基質20 g，料液比1∶1.2。

實驗中所用培養(yǎng)基均在115 ℃，20 min 條件下滅菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及發(fā)酵方法

1）斜面菌種培養(yǎng)：取保藏的Cordyceps militaris JN168 菌株，挑5 mm 見方的菌塊接種到斜面培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，每天光照12 h 轉色，選菌體顏色為橘黃色或橘紅色的斜面?zhèn)溆谩?/p>

2）種子培養(yǎng)：用10 mL 無菌水沖洗斜面上的孢子，得均勻的孢子懸液，按10%的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，在25 ℃下，200 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d，備用。

3）固態(tài)發(fā)酵：接種量25%，25 ℃培養(yǎng)16 d，相對濕度80%左右，無通風。

1.2.2 蟲草素含量的測定

1）蟲草素提取。將發(fā)酵產物攪碎，60 ℃烘干至恒重，粉碎過篩，準確稱取1.0 g，加30 mL 蒸餾水，40 ℃水浴提取1 h，8 000 r/min 離心的上清液。

2）高效液相色譜檢測條件。色譜柱：江蘇漢邦Megres C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；柱溫30 ℃，紫外檢測器波長為260 nm，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，流動相為20%的甲醇，保留時間30 min。利用外標法計算提取液中蟲草素質量濃度[22]。

3）蟲草素產量計算。

式中：C 為提取液中蟲草素質量濃度，g/mL；V 為提取液體積，mL；M 為發(fā)酵產物質量，g。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化

1）培養(yǎng)基組成優(yōu)化

（1）基質篩選。將1.1.2 中基質粉碎過篩，選0.80～0.90 mm 粒徑，進行固態(tài)發(fā)酵，根據蟲草素產量確定發(fā)酵基質。

（2）基質粒徑優(yōu)化。根據上一步結果確定的基質，將其粉碎過篩，粒徑分別為1.25～1.60、0.90～1.25、0.80～0.90、0.60～0.80、0.36～0.60 mm，發(fā)酵選擇最佳基質粒徑。

（3）料液比優(yōu)化。將基質粉碎到上一步中的最佳粒徑，調節(jié)料液比分別為1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2.1 進行發(fā)酵，選擇最適料液比。

（4）碳源篩選。在最佳發(fā)酵基質及最適料液比的基礎上，向培養(yǎng)基中分別加入1%的葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和淀粉，以不加碳源為對照，確定最佳碳源。之后碳源濃度為0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%添加到培養(yǎng)基中，選定最適濃度。

（5）氮源篩選。選擇最適碳源濃度后，在培養(yǎng)基中分別添加0.5%蠶蛹粉、黃豆粉、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨，以不加氮源為對照，以確定最佳氮源。添加最佳氮源，濃度分別為0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%進行發(fā)酵，確定最適濃度。

（6）輔料篩選。確定上述培養(yǎng)基后，選取稻殼、甘蔗渣、麥麩、稻稈、玉米稈和木屑為輔料，添加量0.5%，不加輔料作為對照，選擇最佳輔料。以最佳輔料添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%發(fā)酵，以確定最適添加量。

2）培養(yǎng)條件優(yōu)化

①裝料量優(yōu)化。在最適培養(yǎng)基組成基礎上，分別稱取10、20、30、40、50 g 基質，其他成分按相同比例添加，以確定最適裝料量。

②接種量優(yōu)化。在最適裝料量上，分別加入1、2、3、4、5、6、7、8 mL 種子液，以確定最佳接種量。

③種齡優(yōu)化。在種子培養(yǎng)的第0、1、2、3、4 d 取種子液，按最佳接種量接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵，選擇最佳的接種時間。

④發(fā)酵時間優(yōu)化。在培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件最適的情況下進行發(fā)酵，分別在第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 d 取樣，確定最適的發(fā)酵時間。

以上所有實驗同一水平均做3 次。

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)基組成優(yōu)化

2.1.1 基質對蟲草素產量的影響 在固態(tài)發(fā)酵過程中，基質為微生物的生長提供營養(yǎng)，形成適宜微生物生長的環(huán)境，同時基質還能為發(fā)酵產物的生物合成提供條件，因此選擇合適的基質是固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的基礎，基質對蟲草素產量的影響見圖1。由圖1可知，6 種基質中，以大米作基質時，蟲草素產量為0.74%，小麥和蕎麥次之，小米、高粱和玉米都很低，其中大米比高粱高出近10 倍，且大米廉價易得，最適合作為發(fā)酵基質。

圖1 基質對蟲草素產量的影響Fig.1 Effects of substrate on cordycepin production

2.1.2 大米粒徑對蟲草素產量的影響 基質粒徑的大小直接影響到微生物的生長。只有基質表面能接觸空氣，對于蛹蟲草等好氧微生物，只能在基質表面生長?；|粒徑過大不利于營養(yǎng)物質的利用，較小的粒徑有利于微生物分解基質，吸收營養(yǎng)物質，但基質孔隙率下降，不利于氧的傳遞，同樣影響微生物的生長。大米粒徑對蟲草素產量的影響見圖2。如圖2 所示，蟲草素的產量在大米粒徑為0.90～1.25 mm 左右時最高，達到1.05%，隨著粒徑變小，大米的粘度增大，基質結團嚴重，蟲草素的產量明顯降低。本文選擇0.90～1.25 mm 作為最佳大米粒徑。

圖2 大米粒徑對蟲草素產量的影響Fig.2 Effect of rice particle size on cordycepin production

2.1.3 料液比對蟲草素產量的影響 水分是固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成。水可以將營養(yǎng)物質溶解便于微生物利用；水的比熱容較高，能調節(jié)培養(yǎng)基的溫度。料液比對蟲草素產量的影響見圖3。由圖3 可知，料液比過低或過高都會影響蟲草素的生成。料液比過低，培養(yǎng)基過于干燥，不利于蛹蟲草的生長；料液比過高，物料結塊嚴重，空氣不流通，菌體不能再基質內部生長，同樣造成蟲草素產量較低。所以，料液比定為1∶1.5，蟲草素產量約為1.52%。

圖3 料液比對蟲草素產量的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on cordycepin productio n

2.1.4 碳源對蟲草素產量的影響 碳源能夠為微生物的生長提供物質基礎，能被微生物分解轉化成能量，同時也是微生物代謝產物中碳的來源。碳源對蟲草素產量的影響見圖4。如圖4 所示，與對照相比，單糖和雙糖均能不同程度的提高蟲草素的產量，其中葡萄糖的效果最明顯，蟲草素產量為1.88%；而淀粉是多糖，分解利用較難，不利于蟲草素的合成。故選擇葡萄糖為發(fā)酵碳源。

圖4 碳源對蟲草素產量的影響Fig.4 Effects of carbon sources on cordycepin production

2.1.5 葡萄糖濃度對蟲草素產量的影響 葡萄糖最容易被微生物分解利用，為微生物的生長提供能量和物質來源，所以它常被添加到培養(yǎng)基中。葡萄糖不足，微生物生長緩慢，過多則會抑制微生物生長，不利于產物生成。圖5 反映了葡萄糖濃度對蛹蟲草產蟲草素的影響，隨著葡萄糖濃度的升高，蟲草素產量逐漸增加，到3%時達到2.37%，之后由于葡萄糖的抑制作用而迅速降低。選擇葡萄糖濃度為3%左右較合適。

圖5 葡萄糖濃度對蟲草素產量的影響Fig.5 Effects of glucose concentration on cordycepin production

2.1.6 氮源對蟲草素產量的影響 微生物生命活動所需的蛋白質、酶、核酸及其他含氮物質的合成都需要氮源作為物質基礎。氮源對蟲草素產量的影響見圖6。通過圖6 對比發(fā)現(xiàn)，有機氮源對蟲草素生成有促進作用，而無機氮源則沒有效果，甚至有抑制作用。有機氮源中，黃豆粉效果最佳，蟲草素產量為2.68%，選作氮源進一步優(yōu)化。

圖6 氮源對蟲草素產量的影響Fig.6 Effects of nitrogen sources on cordycepin production

2.1.7 黃豆粉添加量對蟲草素產量的影響 黃豆粉中含有豐富的蛋白質，能被微生物分解成氨基酸吸收利用。此外，黃豆粉中還含有核黃素、硫胺素、泛酸、尼克酸等重要物質，也能促進微生物生長代謝。黃豆粉添加量對蟲草素產量的影響見圖7。如圖7 所示，黃豆粉添加量為2%時，蟲草素產量達3.02%，確定黃豆粉最適添加量在2%左右。

2.1.8 輔料對蟲草素產量的影響 固態(tài)發(fā)酵中大多會選擇添加合適的輔料，因為輔料質地疏松，能有效增加發(fā)酵界面，有利于培養(yǎng)基的高效利用，提高培養(yǎng)基中氧氣含量，還能提供少量營養(yǎng)，促進微生物的生長代謝。輔料對蟲草素產量的影響見圖8。圖8 所列均是常用輔料，可見除玉米稈和木屑外，稻殼、甘蔗渣、麥麩和稻稈均有利于蟲草素的產生，且麥麩效果最優(yōu)，蟲草素產量為3.35%，選擇麥麩作為輔料。

圖7 黃豆粉添加量對蟲草素產量的影響Fig.7 Effects of soybean meal concentration on cordycepin production

圖8 輔料對蟲草素產量的影響Fig.8 Effects of auxiliary materials on cordycepin production

2.1.9 麥麩添加量對蟲草素產量的影響 麥麩是一種常用的輔料，其能形成較大的發(fā)酵界面，提高培養(yǎng)基的利用率，而且含有一定量的淀粉、粗蛋白等營養(yǎng)物質，使得微生物生長良好，提高產物產量。麥麩添加量對蟲草素產量的影響見圖9。在圖9 中，隨著麥麩添加量的增加，蟲草素產量逐漸提高，在1%添加量時，蟲草素產量為3.85%，再增加添加量，蟲草素產量明顯下降，故麥麩添加量1%左右為好。

圖9 麥麩添加量對蟲草素產量的影響Fig.9 Effects of the wheat bran amount on cordycepin production

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 裝料量對蟲草素產量的影響 裝料量的多少影響培養(yǎng)基的多少，在發(fā)酵容器不變情況下，培養(yǎng)基的厚度會隨之改變，會給發(fā)酵過程帶來一系列變化，如氧的傳遞、水分蒸發(fā)速率都不同，從而影響產物的生成。裝料量對蟲草素產量的影響見圖10。如圖10 所示，裝料量為10 g 時，培養(yǎng)基迅速干結，蛹蟲草停止生長，蟲草素產量低；而裝料量為50 g時，培養(yǎng)基底部含氧量低，蛹蟲草無法生長，蟲草素產量也較低。裝料量為30 g 時，蟲草素產量為4.16%，最適合蟲草素生成。

圖10 裝料量對蟲草素產量的影響Fig.10 Effects of medium account on cordycepin production

2.2.2 接種量對蟲草素產量的影響 接種量的大小直接影響到菌體生長延滯期的長短。較大的接種量能大大縮短延滯期，產物迅速合成，發(fā)酵時間縮短；但過多的接種量，會導致菌體提前衰老，使產物合成減少。另外，適當增加接種量還能抑制雜菌的生長繁殖。接種量對蟲草素產量的影響見圖11。如圖11 所示，接種量為30%時，蟲草素產量達到4.39%。接種量小于或大于30%，均導致蟲草素產量偏低，故接種量定在30%左右。

圖11 接種量對蟲草素產量的影響Fig.11 Effects of inoculation amount on cordycepin production

2.2.3 種齡對蟲草素產量的影響 接種時，一般選擇處于對數(shù)生長期的菌體為好。種齡過長，菌體衰老，在培養(yǎng)基中不能正常生長，導致產量偏低；種齡太短，增加發(fā)酵延滯期，菌體生長緩慢，增加發(fā)酵時間。種齡對蟲草素產量的影響見圖12，由圖12 可知，種齡為2 d 時最適合蟲草素的合成，產量達到4.67%，明顯高于其他種齡接種發(fā)酵后的蟲草素產量。所以種子培養(yǎng)2 d 左右即可接種。

圖12 種齡對蟲草素產量的影響Fig.12 Effects of seed age on cordycepin production

2.2.4 發(fā)酵時間對蟲草素產量的影響 合理的發(fā)酵時間，就是在最短的時間內，用最低的成本，達到最大的生產強度，獲得最高的產物產量。蟲草素產量隨發(fā)酵時間的變化見圖13，自第6 天起，蟲草素開始大量合成，至第12 天達到4.69%，之后隨時間延長變化較小，故12 d 是最佳發(fā)酵時間。

圖13 發(fā)酵時間對蟲草素產量的影響Fig.13 Effects of time course of fermentation on cordycepin production

3 結語

因為蛹蟲草是好氧微生物，也是異樣微生物，所以固態(tài)發(fā)酵過程實際上是為蛹蟲草提供營養(yǎng)物質和氧氣。例如，大米、麥麩都能為蛹蟲草生長和蟲草素的合成提供營養(yǎng)物質，而大米粒徑和麥麩添加量都可以改變整個基質的空隙，提高空氣交換效率，提供充足的氧氣，利于蛹蟲草生長代謝。料液比以另一種方式提供營養(yǎng)和氧氣，因為水可以溶解營養(yǎng)物質，同時適當?shù)暮坎粫钃跹鯕饬魍?。添加葡萄糖和黃豆粉主要是提供營養(yǎng)，裝料量和發(fā)酵時間可以提高生產強度，接種量和種齡則影響菌株生長和產蟲草素的活力。而溫度、濕度等條件需要培養(yǎng)箱等設備的控制?？梢?，本文基本上是通過提供營養(yǎng)和氧氣兩方面對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵產蟲草素的條件進行優(yōu)化，對后續(xù)的發(fā)酵研究具有一定的借鑒意義。

通過對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵產蟲草素的研究，優(yōu)化了培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件，得到最優(yōu)條件：大米粒徑0.90～1.25 mm，料液比1∶1.5，葡萄糖3%，黃豆粉2%，麥麩1%，裝料量30 g，接種量6 mL，種齡2 d，發(fā)酵時間12 d，蟲草素產量達到4.69%，約為優(yōu)化前的6.3 倍。另外，本文發(fā)現(xiàn)葡萄糖、黃豆粉和麥麩等對蟲草素產量有較顯著的影響，將通過正交試驗考查這些因素的相互作用，進一步提高蟲草素產量。