太平洋牡蠣防御素在畢赤酵母中的重組表達及其抑菌活性

崔旭，陶妍，王強厚，張亞莉，顏倩倩

上海海洋大學 食品學院 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306

防御素是生物機體在長期進化過程中保留下來的自身防御機制中的重要組成成分，是機體抵御外來病原微生物入侵的重要屏障，在機體的先天性免疫中發(fā)揮重要的作用[1-4]。1960年美國洛克菲勒研究所Cohn等[5]首次從兔的多形核白細胞中提取出此類具有殺菌活性的陽離子蛋白，其具有抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的作用，并能抑制蛋白水解酶的作用，他們將其命名為“Phagocytin” (吞噬素)；六年以后，北卡羅萊納大學醫(yī)學院的Zeya等[6-7]經過一系列研究證實了“吞噬素”實際上是存在于胞質顆粒內的富含精氨酸和半胱氨酸的堿性陽離子多肽, 并稱之為“Lysosomal cationic proteins” (溶酶體陽離子蛋白)，且此類多肽顯示了對大腸桿菌的抑制作用。20世紀80年代中期，加州大學洛杉磯分校醫(yī)學院的Ganz等[8]首次以“Defensin” (防御素) 命名此類多肽；之后人體內存在的3種α-防御素(HNP-1、HNP-2、HNP-3) 被證實對病原微生物、流感病毒、巨細胞病毒和水泡型口炎病毒等具有殺滅或抑制作用[9-10]；并且，研究顯示，經HNP免疫的小鼠血清中免疫球蛋白的量明顯增加[11]。21世紀初，美國洛克菲勒大學華人科學家張林琦在Science發(fā)表論文，稱其用蛋白芯片法分離并識別出人體內T-細胞分泌的具有抑制艾滋病病毒復制作用的因子，即為α-防御素，為艾滋病的治療提供了新的方向[12]。綜上所述，防御素具有較廣譜的抑菌作用、抗炎和免疫調節(jié)功能，是開發(fā)天然免疫蛋白和天然抑菌劑的良好候選者。

迄今為止，國內外在防御素的研究方面取得了較大進展，已從多種生物 (人、雞、馬和玉米等) 機體中分離獲得防御素基因[13-16]，其在基因工程研究領域中的應用正在不斷擴大。水產生物的棲息環(huán)境復雜，近年來出現(xiàn)的嚴重水域污染使它們比其他生物更易遭受病原微生物的侵染[17]。換言之，水產生物的機體必須擁有比其他生物更強的免疫系統(tǒng)才能適應這種復雜的生存環(huán)境，尤其是貝類等軟體動物在缺乏具有“記憶效應”的特異性免疫機制的情況下，仍然能抵御各種病原微生物的侵染，而防御素則是其先天性免疫系統(tǒng)中的重要免疫因子[18]。Zhao等[19]從海灣扇貝Argopecten irradians中提取大防御素AiBD基因，構建了重組表達載體，通過在畢赤酵母中的表達獲得重組AiBD，抑菌試驗顯示該重組蛋白對多種革蘭氏陽性和陰性菌具有抑制作用；之后，他們又將從菲律賓蛤仔Venerupis philippinarum中克隆到的大防御素VpBD基因通過大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得重組VpBD，其對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和惡臭假單孢菌Pseudomonasputida具有抑菌活性[20]。據 Guenguen等[21]報道，他們從太平洋牡蠣Crassostrea gigas外套膜中也發(fā)現(xiàn)了一種新型防御素基因，將其命名為Cg-def，通過原核表達系統(tǒng)獲得的重組Cg-def對革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌活性，但對革蘭氏陰性菌無明顯作用。眾所周知，原核表達系統(tǒng)存在一定的缺陷，比如不能對表達產物進行翻譯后加工修飾，以致表達的目的蛋白會形成不溶性的包涵體，需要經過復雜的復性才能恢復構象和活性。而與原核表達系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris作為真核表達的宿主，其有助于表達產物空間構象的形成，進而獲得具有生物學活性的重組蛋白，并可實現(xiàn)目的蛋白的細胞外分泌表達以方便表達產物的后續(xù)處理，是目前公認的外源蛋白表達的良好宿主[22]。最近，我們報道了基于畢赤酵母表達系統(tǒng)獲得的斑馬魚Danio rerio重組β-防御素 (zfDB3)，它對大腸桿菌Escherchia coli、銅綠假單孢菌Pseudomonas aeruginosa和單增李斯特菌Listeria monocytogenes等顯示了良好的抑菌活性[23]。本研究以上述太平洋牡蠣防御素基因作為重組表達的目標，擬通過畢赤酵母表達系統(tǒng)獲得具有生物學活性的重組蛋白，以期為開發(fā)能夠替代或部分替代抗生素的天然抗菌劑提供良好的候選者和技術途徑。

為了實現(xiàn)上述目標，首先通過RT-PCR從太平洋牡蠣外套膜中分離編碼防御素的cDNA片段；通過設計添加和不添加6×His標簽的兩種目的基因，以pPICZαA為表達載體，構建重組表達載體；在畢赤酵母X-33中使用甲醇誘導表達重組蛋白，并通過固化金屬離子親和層析 (IMAC) 和MALDI-TOF/TOF質譜分析對表達產物進行純化和結構鑒定，最終檢測太平洋牡蠣重組防御素的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株和載體

鮮活的太平洋牡蠣購自上海市蘆潮港海鮮市場；畢赤酵母X-33和表達載體pPICZαA購自Invitrogen公司 (美國)；克隆載體pMD19-T購自TaKaRa公司 (日本)；大腸桿菌 DH5α購自天根生物科技有限公司 (北京)；金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌由本實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑和設備

RNAiso plus、限制性內切酶(SacⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ)、T4 DNA連接酶和TaqDNA聚合酶均購自TaKaRa公司；3′-RACE試劑盒購自Invitrogen公司；DNA分子量marker、DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒和酵母基因組DNA提取試劑盒均購自天根生物科技有限公司；超低蛋白質分子量marker購自中科瑞泰生物科技有限公司 (北京)；Western blotting試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司 (北京)；PCR儀、聚丙烯酰氨凝膠電泳儀、電轉儀和IMAC柱均來自BIO-RAD公司(美國)。引物合成、DNA測序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成；MALDI-TOF-TOF質譜分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及第一鏈cDNA合成

鮮活太平洋牡蠣運至實驗室后，取其外套膜，采用RNAiso Plus試劑提取總RNA；通過3′-RACE法合成第一鏈cDNA：總RNA 2 μL、通用引物(5 μmol/L) 1 μL、5×PrimeScript緩沖液2 μL、dNTPs (10 mmol/L) 1 μL、RNase抑制劑 (40 U/μL)0.25 μL、PrimeScript RTase (200 U/μL) 0.25 μL，用RNase Free dH2O調至10 μL；42 ℃反應60 min，然后70 ℃保溫15 min，獲得第一鏈cDNA保存于–20 ℃。

1.2.2 添加和不添加6×His標簽的目的基因的cDNA克隆

以第一鏈cDNA為模板，參考多種軟體動物防御素基因設計正向引物CgD-F和反向引物CgD-R (表1)，通過PCR擴增編碼太平洋牡蠣防御素的cDNA片段，反應體系和條件如下：10×Taq緩沖液2 μL、dNTPs (10 mmol/L) 1.6 μL、正向和反向引物 (10 μmol/L) 各0.8 μL、第一鏈cDNA 0.2 μL、TaqDNA聚合酶 (2.5 U/μL) 0.2 μL，無菌水調至20 μL；94 ℃ 3 min、94 ℃ 40 s、53.5 ℃30 s、72 ℃ 1 min、72 ℃ 10 min，反應進行30個循環(huán)；該片段經連接至pMD19-T simple載體后轉入大腸桿菌DH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)后選擇陽性克隆由生工生物工程 (上海) 股份有限公司進行DNA測序。以此cDNA片段為模板、采用CgD-F1和CgD-R1以及CgD-F1和CgD-R2兩對引物 (表1)，通過兩次PCR擴增5′端含XhoⅠ酶切位點和Kex 2信號肽識別位點，3′端含6×His標簽、終止密碼子和XbaⅠ酶切位點的目的基因CgDH+；另一方面，以CgD-F1和CgD-R3為引物 (表1)，通過PCR擴增5′端含XhoⅠ酶切位點和Kex 2信號肽識別位點、3′端含終止密碼子和XbaⅠ酶切位點的目的基因CgDH-。擴增該兩種目的基因的所有PCR反應體系和條件基本同上，除了退火溫度有所改變(擴增CgDH+的兩次PCR的退火溫度分別為56.8 ℃和56.5 ℃；擴增CgDH-的退火溫度為54.2 ℃)。擴增到的兩種目的基因同上處理后由生工生物工程 (上海) 股份有限公司進行DNA測序，通過ExPASy軟件(http://web.expasy.org /compute.pi/)預測它們編碼的蛋白質的分子量和等電點。

1.2.3 重組表達載體的構建及電轉至畢赤酵母X-33

采用XhoⅠ和XbaⅠ分別對pMD19-T-CgDH+和pMD19-T-CgDH-進行雙酶切，獲得目的基因CgDH+和CgDH-后，在T4 DNA連接酶作用下，將其與經同樣限制性酶處理過的pPICZαA按1∶1(V/V) 連接 (16 ℃，1 h) 以構建重組表達載體pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-；兩者被轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，通過菌落PCR對其進行鑒定并測序。經確證的pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-用限制性內切酶SacⅠ處理后，分別與畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞以1∶8 (V/V)混合，轉入預冷的0.2 cm電轉杯中冰浴5 min，2 000 V、25 μF和200 Ω條件下電擊5 ms；立即加入1 mL預冷的1 mol/L山梨醇。另外，將pPICZαA(空載體) 電轉至畢赤酵母X-33，以此作為陰性對照。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.4 高拷貝酵母轉化子的篩選

將上述電轉后的溶液置于30 ℃恒溫箱中保溫2 h，離心后將菌體涂于含100 μg/mL博來霉素的YPD平板(酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L)上，于29 ℃孵育至單克隆產生；選擇長勢良好的菌落分別接種至含高濃度博來霉素(1000 μg/mL)的YPD及MM(YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg /L、甲醇5 mL/L、瓊脂15 g/L)和MD(YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L)平板上，29 ℃培養(yǎng)8 h。對篩選獲得的甲醇利用快速型高拷貝酵母轉化子提取基因組DNA，并以此為模板，采用pPICZαA上的通用引物5?AOX1和3?AOX1 (表1)進行PCR鑒定。

1.2.5 目的蛋白在畢赤酵母X-33中的表達及表達條件的優(yōu)化

將上述經PCR鑒定獲得的兩株酵母轉化子(含pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-)分別接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，29 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h后，取500 μL轉接至50 mL MGY培養(yǎng)基 (酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg /L、甘油 10 mL/L、磷酸鉀緩沖液100 mmol/L，pH 6.0) 中，相同條件下培養(yǎng)24 h；全部轉入MM培養(yǎng)基 (配方同MGY培養(yǎng)基，除了10 mL/L的甲醇取代甘油) 中，29 ℃、250 r/min培養(yǎng)72 h，每隔24 h補加甲醇至1.0%。培養(yǎng)液經超濾濃縮后，通過Tricine-SDS-PAGE對其進行分析，電泳條件：0.1 mol/L N-三(羥甲基) 甲基甘氨酸，濃縮膠、夾層膠和分離膠的濃度分別為4%、10%和16.5%。同時，將MM培養(yǎng)基中的甲醇濃度設為0%、0.5%、1%、1.5%和2%，選取含pPICZαA-CgDH-的酵母轉化子同上條件進行培養(yǎng)，以確定最適甲醇濃度；在此基礎上，進一步對同一酵母轉化子進行不同時間段的培養(yǎng)，以確定最佳表達時間。

1.2.6 表達產物的純化及Western blotting分析和結構鑒定

將上述篩選到的含pPICZαA-CgDH+的酵母轉化子擴大培養(yǎng)至1 L，在最適條件下進行培養(yǎng)；培養(yǎng)液經離心后收集上清，經賽多利斯切向回流超濾器濃縮后，通過Profina蛋白質純化儀進行固化金屬離子親和層析 (IMAC)；純化產物經Tricine-SDSPAGE分析后，切下目的條帶由上海中科新生命生物科技有限公司進行MALDI-TOF- TOF質譜分析。采用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。此外，將電泳后的凝膠電轉至PVDF膜上 (100 V，1 h)，采用Western blotting試劑盒進行分析，具體操作如下：加封閉液反應1 h后洗膜，加入鼠單克隆抗體 (一抗) 室溫孵育2 h；洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG (二抗) 室溫孵育1 h；洗膜后用HRP-DAB顯色試劑盒進行顯色。

1.2.7 重組蛋白的抑菌活性測定

以金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌為試驗菌，將兩者分別接種于5 mL Luria-Bertani (LB)液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期；菌液經10倍稀釋后取1 μL分別與100 μL的含重組蛋白CgDH+和含重組蛋白CgDH-的培養(yǎng)液上清 (蛋白質總濃度分別為2.4 mg/mL和2.69 mg/mL) 混合，37 ℃保溫2 h，取30 μL涂于LB平板，再37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況。另外，以含pPICZαA (空載體) 的酵母轉化子的培養(yǎng)液上清作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 目的基因CgDH+和CgDH–的PCR擴增及其序列分析

以太平洋牡蠣外套膜的第一鏈cDNA為模板，使用引物CgD-F和CgD-R，擴增到146 bp的編碼防御素的cDNA片段。以此cDNA片段為模板，一方面通過使用兩對引物CgD-F1和CgD-R1以及CgD-F1和CgD-R2，擴增得到含6×His標簽的171 bp的目的基因CgDH+；另一方面，通過使用CgD-F1和CgD-R3引物，擴增得到不含6×His標簽的目的基因CgDH-。DNA測序結果顯示相關酶切位點和6×His標簽被正確添加(圖1)；CgDH+和CgDH-分別編碼了由49個和43個氨基酸殘基組成的多肽，內含8個高度保守的半胱氨酸殘基，它們在空間上可以形成4對二硫鍵，以穩(wěn)定蛋白質結構并賦予其生物學活性。經ExPASy軟件預測，兩種目的蛋白CgDH+和CgDH-的理論分子量分別為5.78 kDa和4.95 kDa，等電點分別為7.77和7.70。

圖1 目的基因CgDH+和CgDH–的核苷酸及推斷的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of target genes, CgDH+ and CgDH-.Underlines represent restriction sites; italics represent Kex 2 protease recognition site; shaded letters represent conserved cysteine residues;box represents 6×His; asterisks represent stop codons.

2.2 重組表達載體和高拷貝酵母轉化子的鑒定

使用載體上的通用引物5?AOX1和3?AOX1對pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-進行大腸桿菌菌落PCR鑒定，獲得4個含pPICZαA-CgDH+的陽性菌落和3個含pPICZαA-CgDH-的陽性菌落；各選1株菌用于DNA測序，結果顯示兩個目的基因分別與表達載體pPICZαA正確連接，未發(fā)現(xiàn)任何核苷酸突變。將純化的pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-分別電轉入畢赤酵母X-33后，經含高濃度博來霉素的MM和MD平板篩選，各取3株長勢良好的菌株提取其基因組DNA為模板，使用5?AOX1和3?AOX1進行PCR鑒定，結果證明pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-已成功嵌合進畢赤酵母X-33基因組。

2.3 在畢赤酵母X-33中表達目的蛋白及其表達條件的優(yōu)化

從上述兩種酵母轉化子中各選1株用于目的蛋白的表達，經Tricine-SDS-PAGE分析表明 (圖2A)，含pPICZαA-CgDH–和pPICZαA-CgDH+的兩種酵母轉化子的培養(yǎng)液上清均在近7.8 kDa處有明顯蛋白質條帶，前者位置略低于后者 (兩者理論上相差0.83 kDa)，而含空載體的酵母轉化子的培養(yǎng)液上清則無此條帶。鑒于后者培養(yǎng)液上清中的目的蛋白含6×His標簽，在對其擴大至1 L培養(yǎng)后，通過IMAC法獲得純化產物，電泳結果顯示該純化產物為分子量近7.8 kDa的單一條帶，證明其純度較高，該條帶用于Western blotting和MALDI-TOF/TOF質譜鑒定。經BCA法測得純化的重組蛋白濃度為0.58 mg/mL，推算至表達量為2.32 mg/L。

圖2 純化的CgDH+(A) 以及不同甲醇濃度 (B) 和不同表達時間 (C) 下的培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.2 Tricine-SDS-PAGE analysis for the purified CgDH+ (A) and culture medium supernatants from yeast transformants induced with different concentrations of methanol (B) and expressed for different time (C).M: protein marker; CK: yeast transformant harboring pPICZαA; 1: yeast transformant harboring “pPICZαA-CgDH-”; 2: yeast transformant harboring “pPICZαA-CgDH+”; 3: purified CgDH+.

在上述實驗的基礎上，考察不同甲醇濃度對含pPICZαA-CgDH-的酵母轉化子表達量的影響，結果如圖2B所示。1.0%甲醇濃度下的表達產物中雜蛋白較少，并且目的蛋白的條帶最清晰，故在分時段表達時采用1.0%的甲醇濃度。同樣以該酵母轉化子為例，考察不同培養(yǎng)時間對表達量的影響，由圖2C可見，培養(yǎng)24-120 h時都有目的蛋白表達，在48 h時表達量已較高，之后隨著培養(yǎng)時間的延長，表達量并無明顯增加。據此，一方面考慮到雜蛋白的影響和降低成本，另一方面據文獻報道[21]，防御素對真菌有一定的抑制作用，隨著防御素含量的增加，酵母細胞的生長可能會受到影響，并且目的蛋白可能會被蛋白酶降解。因此，選擇最佳的誘導培養(yǎng)時間為48-72 h。

2.4 重組蛋白CgDH+的Western blotting分析及MALDI-TOF-TOF質譜鑒定

含重組蛋白CgDH+的培養(yǎng)液上清和純化產物經Western blotting分析后顯示 (圖3A、3B)，在10 kDa附近都存在單一明顯條帶，此位置的分子量明顯高于理論分子量5.78 kDa，究其原因可能是因為超低分子量蛋白質marker與顯色染料共價偶聯(lián)，在電泳時影響了其遷移速度，以致顯示目的蛋白的分子量比理論分子量高。純化產物的MALDI-TOF-TOF質譜分析顯示 (圖4)，在m/z799.0-4 013.0之間捕捉到7個肽段，其覆蓋的殘基數(shù)約占重組蛋白CgDH+氨基酸序列總長的83.67%；其中m/z為841.3713和1217.540 9的兩個峰分別代表自N端起44-49殘基 (HHHHHH)和22-31殘基 (AGYCDFWTVR) 的肽段，該兩段序列分別與相應位置的理論序列相符，由此證明，純化產物即為預期的重組蛋白CgDH+。

圖3 含pPICZαA-CgDH+的酵母轉化子的培養(yǎng)液上清 (A) 和純化CgDH+(B) 的Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis for the culture medium supernatant from yeast transformant harboring pPICZαA-CgDH+(A) and purified CgDH+ (B).M: protein marker; CK: yeast transformant harboring pPICZαA; 1:yeast transformant harboring “pPICZαA-CgDH+”; 2:purified CgDH+.

圖4 純化的CgDH+的MALDI-TOF-TOF質譜分析Fig.4 MALDI-TOF-TOF analysis for the purified CgDH+.

2.5 重組蛋白CgDH+和重組蛋白CgDH–的抑菌活性

由圖5所示，與陰性對照 (兩種試驗菌與含空載體的酵母轉化子的培養(yǎng)液上清作用) 相比，革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的銅綠假單孢菌經與含重組蛋白CgDH+和重組蛋白CgDH-的培養(yǎng)液上清作用，平板上的菌落數(shù)明顯減少，表明這兩種培養(yǎng)液上清顯示的抑菌活性分別來源于重組蛋白CgDH+和重組蛋白CgDH-。另一方面，該結果也初步證明重組蛋白中6×His標簽的存在與否并不影響其生物學活性。

3 討論

軟體動物進化地位較低，而它們在生物界中發(fā)展和進化的歷史卻比脊椎動物長得多；它們雖然缺乏特異性的免疫系統(tǒng)，但從物種生存以及繁衍的角度看，其機體的防御體系并不遜色于脊椎動物，而防御素則是它們機體細胞中關鍵的免疫因子[18,24]。由此可以推測，較脊椎動物而言，來自軟體動物的防御素具有更為天然的優(yōu)勢成為天然抗菌劑開發(fā)的良好候選者。本研究聚焦于太平洋牡蠣防御素的重組表達，經優(yōu)化表達條件，建立了畢赤酵母表達系統(tǒng)；通過該系統(tǒng)獲得了含6×His和不含6×His的兩種重組太平洋牡蠣防御素。根據ExPASy軟件預測，這兩種重組蛋白的理論分子量分別為5.78 kDa和4.95 kDa，但Tricine-SDS-PAGE分析顯示目的條帶的分子量偏高 (圖2)，其原因可能是因為目的蛋白的分子量過小且?guī)д姾桑琒DS不能完全屏蔽蛋白質分子間的電荷差異和結構差異，導致其電泳時的位置偏高[25]?；贛ALDI-TOF-TOF質譜分析的結構鑒定進一步證明了上述目的條帶為預期的目的蛋白。另一方面，通過本研究建立的畢赤酵母表達系統(tǒng)，獲得了表達量僅為2.32 mg/L的重組蛋白CgDH+，這種低表達量的現(xiàn)象可能與本研究使用的編碼太平洋牡蠣防御素的天然cDNA有關；根據Graphical Codon Usage Analyser (http://www.gcua.schoedl.de/)預測，該cDNA中存在17個低頻密碼子，它們可能影響了目的蛋白在畢赤酵母中的高效表達。Yang等[26]對黑曲霉Aspergillus nigerlip2基因的密碼子進行優(yōu)化后在畢赤酵母細胞中表達重組蛋白，發(fā)現(xiàn)其表達量和生物學活性分別提高了11.6和5.3倍；王方芹等[27]根據釀酒酵母的密碼子偏愛性優(yōu)化了黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶基因rha，發(fā)現(xiàn)重組rha的表達量提高了2.9倍，并且其酶活力也提高了2.7倍。此外，我們最近報道的在畢赤酵母X-33中表達的斑馬魚重組β-防御素 (zfDB3) 與本研究獲得的兩種重組目的蛋白相比，顯示了更好的抑菌活性[23]，而zfDB3的編碼基因中有28個密碼子是被優(yōu)化過的。據此，后續(xù)研究將根據畢赤酵母的密碼子偏愛性進一步對目的基因進行密碼子優(yōu)化，以期提高表達量。

圖5 含重組目的蛋白的培養(yǎng)液上清的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of the culture medium supernatants containing recombinant target proteins.CK: yeast transformants harboring pPICZαA; 1: yeast transformants harboring “pPICZαA-CgDH-”; 2: yeast transformants harboring “pPICZαA-CgDH+”.

眾所周知，對重組蛋白添加6×His標簽將有利于其純化及其結構鑒定，但是否會影響重組蛋白的生物學活性依據各種蛋白質的結構和性質是不同的[28-30]。本研究設計了C端含6×His和不含6×His的重組蛋白CgDH+和CgDH-，抑菌試驗顯示兩者對金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌都具有抑菌活性 (圖5)，與馬君燕等[30]的研究結果一致。在過去的兩年中，我們曾開展了斑點叉尾鮰 C型溶菌酶在畢赤酵母X-33中的表達研究，獲得了含6×His和不含6×His的3種重組溶菌酶，發(fā)現(xiàn)不含6×His和C端含6×His的重組溶菌酶均具有抑制枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的活性，而N端含6×His的重組溶菌酶則無抑菌活性[31]。產生上述現(xiàn)象的原因被推測為可能是N端的6×His在一定程度上改變了蛋白質的一級結構，進而影響了溶菌酶活性中心的形成；而C端存在的6×His并不影響重組溶菌酶和重組蛋白CgDH+的空間結構。

考慮到對目的蛋白進行大規(guī)模發(fā)酵時不可能對其進行純化處理，故本研究分別考察了含重組蛋白CgDH+和重組蛋白CgDH-的培養(yǎng)液上清的抑菌活性，證明兩者均顯示了抑制革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的銅綠假單孢菌的活性，該結果為今后進一步通過發(fā)酵罐發(fā)酵制備產品及確定產品的形式提供了重要的依據。

4 結論

本研究從太平洋牡蠣外套膜中分離獲得防御素基因，確定其在畢赤酵母X-33中的最適表達條件為：29 ℃、250 r/min、1.0%甲醇、培養(yǎng)72 h；表達的兩種目的蛋白(CgDH+和CgDH-)均顯示了對于金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌的抑菌活性。根據純化的重組蛋白CgDH+的蛋白質濃度推算表達量為2.32 mg/L。本研究結果為軟體動物防御素的基因工程制備奠定了重要的研究基礎。