當(dāng)歸生藥中兩種PR-10蛋白亞型的純化與表征

王香玲，李嫻，何火聰，李玲玲，呂迪，陳翠煌，葉小強，劉樹滔，潘劍茹

1 福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108

2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/福建省腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)及腫瘤放射治療學(xué)研究室，福建 福州 350014

3 福建省科技廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，福建 福州 350014

病程相關(guān) (PR) 蛋白是宿主植物因各類病原體 (例如病毒、細(xì)菌和真菌) 誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)[1]。目前根據(jù)生物學(xué)活性、物理化學(xué)性質(zhì)及序列同源性將PR蛋白分類為17個家族 (PR-1至PR-17)[2-3]。PR-10家族蛋白屬于其中一個類別，廣泛地存在于不同單、雙子葉植物中[4]，該家族又被稱為多基因家族，例如豌豆中存在至少5種PR-10基因，麝香中有18種Mal d 1基因[5]等。據(jù)報道PR-10蛋白質(zhì)是多功能蛋白，主要參與植物病原體入侵的防御反應(yīng)以及各種生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，但家族成員間沒有統(tǒng)一的生物學(xué)功能[1]。

研究表明，大多數(shù)PR-10蛋白是一類分子量小 (15–18 kDa)、酸性、結(jié)構(gòu)相似且與核糖核酸酶同源的胞內(nèi)蛋白[4]。最早從人參中分離出具有核糖核酸酶活性的PR-10蛋白為IPR 1和IPR 2[6-7]。類似地，從白羽扇豆根中分離的LaPR-10蛋白具有核糖核酸酶活性[8]。

當(dāng)歸[Angelica sinensis (Oliv.) Diels]是傘形科當(dāng)歸屬的一種生多年草本植物。其干燥的貯藏根是我國一味常用的中藥材，素有“十方九歸”之說。性溫，味甘、辛；歸肝、心、脾經(jīng)；具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功能[9-10]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，當(dāng)歸多糖能有效地改善高脂飲食小鼠的脂肪肝并維持體內(nèi)葡萄糖平衡[10-11]；當(dāng)歸揮發(fā)油對高血脂小鼠動脈粥樣硬化具有一定的保護作用[12]；阿魏酸是較早被分離和鑒定的當(dāng)歸有效成分，也是當(dāng)歸有機酸主要成分之一，能抗動脈粥樣硬化[9,13-14]。雖然目前關(guān)于當(dāng)歸多糖和當(dāng)歸藥效小分子已有很多研究，但對于當(dāng)歸中重要的高分子化合物——蛋白質(zhì)的研究卻很少。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸中蛋白含量較為豐富，且當(dāng)歸總蛋白具有清除DPPH自由基能力，可促進人正常肝細(xì)胞L02增殖[15]。

本課題組近期發(fā)現(xiàn)初步純化的當(dāng)歸低分子量蛋白AP可顯著改善小鼠的急性放射損傷[16]，且在當(dāng)歸鮮根中也存在PR-10家族蛋白[17]。本研究對當(dāng)歸生藥中的AP蛋白進行了進一步純化，首次從當(dāng)歸生藥中純化得到兩種PR-10蛋白亞型(命名為ASPR-C-1和ASPR-C-2)，并對二者的理化性質(zhì)進行了表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當(dāng)歸生藥購自甘肅省岷縣琪祥閣食品專營店。蛋白分子量marker購自美國Thermo公司。酵母tRNA購自上海寶曼生物科技有限公司。BCA蛋白含量測定試劑盒選購自美國Thermo公司。Sephadex G-50填料購自美國GE公司。DEAE Sepharose Fast Flow填料購自Pharmacia Biotech公司。其余試劑均為分析純。

1.2 當(dāng)歸蛋白的制備與純化

1.2.1 制備當(dāng)歸蛋白粗提液

將12.96 g當(dāng)歸生藥切成片狀，加入10倍體積 (即130 mL) Tris-HCl緩沖液 (0.05 mol/L，pH 8.0)，4 ℃靜置過夜，次日用4層紗布過濾，濾液于12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清 (蛋白粗提液)，測定其蛋白含量和核糖核酸酶活力。

1.2.2 硫酸銨一步沉淀

將61.71 g硫酸銨加入蛋白粗提液 (110 mL)進行硫酸銨一步沉淀 (0–80%) (即561 g/L)，沉淀過夜后于12 000 r/min、4 ℃離心10 min。收集沉淀，將沉淀溶于2倍體積的Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH 8.0) 中，12 000 r/min、4 ℃離心10 min取上清 (當(dāng)歸生藥蛋白粗提液)，測定其蛋白含量和核糖核酸酶活力。

1.2.3 凝膠過濾層析分離

將當(dāng)歸生藥蛋白粗提液流經(jīng)以Tris-HCl緩沖液 (0.05 mol/L，pH 8.0) 預(yù)先平衡的Sephadex G-50層析柱 (3 cm×105 cm)，流速為0.25 mL/min，收集第二個洗脫峰 (P2)，測定其蛋白含量和核糖核酸酶活力，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 弱陰離子交換柱分離

將樣品 (P2) 上柱于用 Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.3) 預(yù)先平衡的DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱 (2.5 cm×10 cm)，流速為1 mL/min，收集穿透峰 1 (C1)、穿透峰 2 (C2)，直至OD280<0.035，最后以含1 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液 (0.05 mol/L，pH 7.3) 洗脫結(jié)合的雜蛋白，分別測定穿透峰1和穿透峰2的蛋白含量和核糖核酸酶活力，并于4 ℃保存。

1.3 PAGE和SDS-PAGE

PAGE分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%；SDS-PAGE分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為4%。以考馬斯亮藍(lán)R-250染色鑒定蛋白，結(jié)合PAGE和SDS-PAGE結(jié)果檢測蛋白純度；用高碘酸-希夫 (PAS) 染色鑒定糖蛋白[18]；以Carestream MI SE 軟件通過還原與非還原條件下 (即有無β-巰基乙醇) SDS-PAGE結(jié)果計算蛋白質(zhì)分子量。

1.4 蛋白質(zhì)及糖基含量測定

以BCA試劑盒測定粗提液和每一步純化得到的當(dāng)歸蛋白的蛋白含量。以蒽酮硫酸法測定蛋白中糖基含量[19]。

1.5 質(zhì)譜鑒定

相關(guān)蛋白經(jīng)PAGE電泳后，剪下膠上對應(yīng)目的蛋白質(zhì)的條帶，送至復(fù)旦大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心使用MALDI-TOF-TOF? (AB SCIEX) 進行質(zhì)譜鑒定，并用GPS Explorer (V 3.6) 數(shù)據(jù)庫檢索分析。

1.6 核糖核酸酶活性的活性表征

1.6.1 核糖核酸酶活力測定

1.6.2 反應(yīng)pH的影響

以酵母tRNA為底物，使用緩沖體系 (0.1 mol/L磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液，pH 3.0–7.0；0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.0–8.0) 分別將兩種蛋白調(diào)至pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。按照本文方法1.6.1，在37 ℃反應(yīng)15 min測定蛋白的核糖核酸酶活性。以最適pH條件下的酶活性為100%，計算各處理的相對酶活性。

1.6.3 反應(yīng)溫度的影響

以酵母tRNA為底物，將兩種蛋白分別調(diào)至其最適pH，然后分別在溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下反應(yīng)15 min，測定蛋白的核糖核酸酶活性。測定方法參照本文方法1.6.1，以最適溫度條件下的酶活性為100%，計算各處理的相對酶活性。

1.6.4 溫度穩(wěn)定性研究

將ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白分別在常溫(25 ℃)、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃下水浴30 min，待樣品冷卻至室溫，4 ℃離心 (12 000 r/min，5 min)取上清，以酵母tRNA為底物，分別于最佳反應(yīng)條件下測定當(dāng)歸蛋白核糖核酸酶活性。測定方法參照本文方法1.6.1，兩種蛋白均以其最適反應(yīng)條件下的酶活性為100%，計算各處理的相對酶活性。

1.6.5 金屬離子、螯合劑、表面活性劑和還原劑等對ASPR-C-1和ASPR-C-2酶活性的影響

過腔的特征主要有音調(diào)的依附性、或0性（即可去過腔）、音樂材料的以主調(diào)和級音為主性、構(gòu)式的多樣性、音數(shù)的不定性、起音的眼位性、樂音進行的級進性、節(jié)奏的頓逗性等。下面僅以音調(diào)的依附性、音數(shù)的不定性、結(jié)構(gòu)的類型性和構(gòu)式的多樣性三點為例。

各種試劑對ASPR-C-1和ASPR-C-2酶活性的影響是分別在最適反應(yīng)體系中加入含1 mmol/L(終濃度) 的金屬離子 (Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ag+、Cu2+、Fe2+)、螯合劑EDTA、蛋白還原劑DTT和表面活性劑SDS下測定當(dāng)歸蛋白核糖核酸酶活性。測定方法參照本文方法1.6.1，兩種蛋白均以其最適反應(yīng)條件下的酶活性為100%，計算各處理的相對酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸蛋白的純化

110 mL當(dāng)歸生藥蛋白粗提液經(jīng)過80%硫酸銨沉淀后，復(fù)溶，離心取上清，進行Sephadex G-50凝膠過濾層析，收集Sephadex G-50第二峰 (P2)，色譜及SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示。由圖1B可知，P2峰中含有分子量約為17 kDa蛋白，在PAGE中顯示為兩條條帶 (圖2B)。

圖1 當(dāng)歸生藥蛋白粗提液的Sephadex G-50凝膠過濾層析圖譜 (A) 與SDS-PAGE分析 (B)Fig.1 Sephadex G-50 gel filtration chromatography (A) and SDS-PAGE (B) of crude extracts of Angelica sinensis.M:protein weight markers; 1: P2 fractions.

圖2 P2組分的DEAE-Sepharose陰離子交換柱圖譜 (A) 與PAGE分析 (B)Fig.2 DEAE-Sepharose chromatography (A) and PAGE (B) of P2 fractions.P2: P2 fractions; 58–188: fractions of DEAE-Sepharose chromatography.

將Sephadex G-50第二峰進行DEAE-Sepharose弱陰離子交換層析，分別收集穿透峰1 (67–82管，C1) 和穿透峰2 (88–121管，C2)，其色譜結(jié)果和PAGE分析結(jié)果如圖2所示。由圖2B可知，DEAE-Sepharose可將PAGE上對應(yīng)的兩種蛋白分離開，穿透峰1 (C1) 和穿透峰2 (C2) 均為PAGE純的蛋白，將其分別命名為ASPR-C-1和ASPR-C-2。為進一步驗證其純度，分別取兩個峰的組分進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3A所示，由圖可知，ASPR-C-1 (泳道1) 和ASPR-C-2 (泳道2) 在還原條件下為SDS-PAGE純的組分。兩種蛋白的純化過程如表1所示，ASPR-C-1比活力為73.69 U/mg，純化倍數(shù)為5.35，ASPR-C-2酶的比活力為146.68 U/mg，純化倍數(shù)為10.64。

2.2 蛋白二聚體和糖基分析

如圖3所示，ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白在還原條件下經(jīng)Carestream MI SE 軟件計算得出分子量分別為17.33 kDa和17.18 kDa。在非還原條件下，ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白都出現(xiàn)了少量高分子量條帶，分子量分別為35.66 kDa和35.32 kDa，是ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白分子量的2倍，可知高分子量的蛋白是ASPR-C-1和ASPR-C-2在溶液中部分聚集所形成的二聚體。

表1 兩種蛋白亞型的純化表Table 1 Purification summary of two isoforms.

圖3 兩種蛋白亞型的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of two isoforms.(A) SDS-PAGE of the isoforms with β-mercaptoethanol.(B) SDS-PAGE of the isoforms without β-mercaptoethanol.(C) PAS staining of the isoforms.M: protein weight marker, 1: ASPR-C-1, 2:ASPR-C-2.

如圖3C所示，ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白在SDS-PAGE上的條帶經(jīng)PAS染色后均呈紫紅色，表明兩種蛋白均為糖蛋白。經(jīng)蒽酮硫酸法檢測，ASPR-C-1和ASPR-C-2糖基含量分別為2.6%和8.2%。

2.3 質(zhì)譜鑒定

對純化的當(dāng)歸生藥蛋白進行AB SCIEX 5800 TOF/TOF質(zhì)譜分析，得到其肽指紋圖譜 (PMF，并將PMF質(zhì)荷比為1 861.69 (ASPR-C-1)、952.52(ASPR-C-2) 的肽段作為母離子進行MALDI-TOF-MS(AB SCIEX) 二級質(zhì)譜分析，用Masoct軟件搜索NCBI nr 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，鑒定結(jié)果如表2所示。由表2結(jié)果可知，與ASPR-C-1最為匹配的蛋白是來自胡蘿卜Daucus carota的分子量為16 508 Da、得分為100、登錄號為gi/18652047的Dau c 1.0201蛋白。同樣的，與ASPR-C-2相匹配的除了與ASPR-C-1相似的major allergen isoform Dau c 1.0201蛋白外，還有來自芹菜Apium graveolens的分子量為17 079 Da、得分為102、登錄號為gi/14423646的Api g 1蛋白和同樣來自Apium graveolens、登錄號為gi/1769847的Api g 1.0201。這些蛋白均屬于PR-10家族蛋白。由此可知ASPR-C-1和ASPR-C-2均為PR-10類蛋白，是當(dāng)歸PR-10蛋白的兩個亞型。

表2 ASPR-C-1和 ASPR-C-2質(zhì)譜分析結(jié)果Table 2 Mass spectrometry analysis results of ASPR-C-1 and ASPR-C-2

2.4 ASPR-C-1和ASPR-C-2的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 反應(yīng)pH的影響

圖4所示的pH-活性曲線的結(jié)果表明，ASPR-C-1在pH 5.8左右相對酶活性最高，在pH 4.0–5.8之間，該酶相對酶活性隨pH的增加而快速增加，pH 5.8–7.0之間，該酶相對酶活性隨pH的增加反而急劇減少，當(dāng)pH＜4.0或pH＞7.0時，其活性變化緩慢，該酶的相對酶活性均不到30%。反應(yīng)pH 對ASPR-C-2核糖核酸酶活性的影響與ASPR-C-1的相似，但ASPR-C-2的最適反應(yīng)pH為5.5。

2.4.2 反應(yīng)溫度的影響

圖4 兩種蛋白亞型核糖核酸酶活性的最適pHFig.4 The optimum pH of the ribonuclease activity of two isoforms.

圖5 兩種蛋白亞型核糖核酸酶活性的最適溫度Fig.5 The optimum temperature of the ribonuclease activity of two isoforms.

分別在最適pH的條件下進一步研究反應(yīng)溫度對兩種蛋白核糖核酸酶活性的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)反應(yīng)溫度為30–50 ℃時，ASPR-C-1的相對酶活性隨反應(yīng)溫度的增高而增加，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到50 ℃時，該酶的相對酶活性最高，當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)增大時，ASPR-C-1的相對酶活性反而隨著溫度的增高而降低。ASPR-C-2酶活性的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)溫度低于或高于60 ℃都會使其相對酶活性下降。

2.4.3 溫度穩(wěn)定性研究

在兩種蛋白的最適pH與最適溫度下，兩種蛋白的核糖核酸酶活性的熱穩(wěn)定性如圖6所示。實驗結(jié)果表明，兩種蛋白在60 ℃下均有最佳的穩(wěn)定性。其中ASPR-C-1在30–70 ℃保持15 min后剩余酶活性均大于50%，但是當(dāng)溫度超過70 ℃后，剩余酶活力急劇下降，表明ASPR-C-1在30–70 ℃時有較好的熱穩(wěn)定性；而ASPR-C-2在20–100 ℃保持15 min后剩余酶活性均大于50%，且在50–100 ℃的剩余酶活力均大于80%，表明ASPR-C-2在20–100 ℃時有較好的熱穩(wěn)定性活性。比較二者而言，ASPR-C-2具有良好的熱穩(wěn)定性，100 ℃處理后仍余80%以上活力。

2.4.4 金屬離子、螯合劑、表面活性劑和還原劑等對ASPR-C-1和ASPR-C-2酶活性的影響

圖6 兩種蛋白亞型核糖核酸酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 The thermal stability of the ribonuclease activity of two isoforms.

圖7 金屬離子、螯合劑、表面活性劑和還原劑等對ASPR-C-1和ASPR-C-2酶活性的影響Fig.7 Influence of metal ions, chelating agent,surfactant and protein reducing agent on ribonuclease activity of ASPR-C-1 and ASPR-C-2.EDTA: elhylene diamine tetraacetic acid; SDS: sodium dodecylsulphate;DTT: dithiothreitol.

如圖7所示，F(xiàn)e2+對ASPR-C-1和ASPR-C-2的核糖核酸酶活性有激活作用，分別使ASPR-C-1和ASPR-C-2的相對酶活性提高近60%和70%。而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對二者的酶活性顯示輕微抑制作用，二者在這四種離子下相對酶活性均保留在80%以上。但二者的酶活性受Ag+、Cu2+、EDTA和SDS的抑制程度較強，特別是ASPR-C-1在有DTT存在下相對酶活性僅剩15%，而ASPR-C-2有50%的酶活性殘留。

3 討論

本研究中通過硫酸銨一步沉淀 (0–80%)、Sephadex G-50凝膠過濾層析和DEAE-Sepharose陰離子交換柱三步純化從當(dāng)歸生藥中分離純化得到ASPR-C-1和ASPR-C-2兩種蛋白，經(jīng)質(zhì)譜測序鑒定均為PR-10類蛋白，得率分別為16.44%和39.13% (圖1，圖2，表1)。兩種蛋白在SDS-PAGE中分子量分別為17.33 kDa (ASPR-C-1)和17.18 kDa(ASPR-C-2) (圖3A)，與已報道的大多數(shù)PR-10蛋白的分子量相似[21-26]。

PR-10蛋白通常以單體形式存在，但也有一些例外。例如豆薯Pachyrrhizus erosus中的PR-10蛋白質(zhì) SPE-16[27]、黃芪 AmPR-10[26]和綠豆CSBP[28]在溶液中均為同二聚體，人參PgPR-10.1和PgPR-10.2蛋白在溶液中既能以同二聚體形式存在，又能因為相互作用彼此間形成異二聚體[29]，樺樹花粉過敏原Bet v 1在溶液中則既以單體存在又能形成二聚體[30]。

由于凝膠過濾層析Sephadex G-50分級分離的范圍為1.5–30 kDa，本研究中所得的G-50第二峰中的蛋白分子量應(yīng)低于30 kDa，但最終該峰中除了存在17 kDa左右的蛋白還存在35 kDa左右的蛋白 (圖1B)，由于后者的分子量為前者的兩倍，可知后者應(yīng)該為前者在溶液中形成的二聚體。最終純化得到的蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果(圖3B) 也證實了這一點，兩種當(dāng)歸生藥PR-10蛋白在溶液中的存在形式與樺樹花粉過敏原Bet v 1類似，在溶液中主要以單體形式存在，但會部分形成二聚體[30]。

在已發(fā)現(xiàn)的植物PR-10家族的蛋白中具有糖基化的只有黃芪AmPR-10，糖基含量為13.7%[26]，本課題組發(fā)現(xiàn)，源于當(dāng)歸的PR-10蛋白也是糖蛋白，且源于當(dāng)歸生藥的兩種PR-10蛋白 (糖基含量分別為2.6%和8.2%) 比鮮根中的PR-10蛋白[17]糖基含量高。

PR-10家族蛋白具有多種功能，其中核糖核酸酶活力是許多PR-10蛋白共同具有的生物學(xué)功能，例如黃芪AmPR-10[24]、羽扇豆根LaPR-10[8]、棉花GaPR-10[23]、豆薯中的 SPE16[24-27]、辣椒CaPR-10[25]等均具有核糖核酸酶活性。本研究純化得到的兩種當(dāng)歸生藥PR-10蛋白也具有核糖核酸酶活性，與同為糖基化蛋白的黃芪AmPR-10蛋白 (74.11 U/mg)[22]相比，ASPR-C-1的比活(73.60 U/mg) 與之相當(dāng)，ASPR-C-2的比活(146.76 U/mg) 是其近2倍 (表1)。當(dāng)歸生藥PR-10蛋白也比當(dāng)歸鮮根中的PR-10蛋白具有更高的核糖核酸酶活性。當(dāng)歸生藥PR-10蛋白核糖核酸酶活性的最適pH相近，均為5.6左右，但二者的最適溫度不同，ASPR-C-1的為50 ℃，ASPR-C-2的為60 ℃ (圖4，圖5)。與ASPR-C-1以及當(dāng)歸鮮根中的PR-10蛋白[17]相比，當(dāng)歸生藥中的ASPR-C-2具有最佳的耐熱性能，在50–100 ℃熱處理后的剩余酶活力均大于80% (圖6)。

不同金屬離子、螯合劑和表面活性劑、還原劑對PR-10蛋白的核糖核酸酶的影響有顯著差異。有研究表明Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、EDTA、Cu2+、Ag+和SDS對玉米Zm PR10和Zm PR10.1有輕微的抑制活性[31]，但Cu2+、Ag+對黃芪AmPR-10有強烈的抑制活性[26]。在本研究中，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對二者的活性都輕微抑制作用，Cu2+、Ag+、EDTA、DTT和SDS對二者酶活性的抑制程度較強。而Fe2+對二者的核糖核酸酶活性有明顯的激活作用 (圖7)。

當(dāng)歸中不同PR-10蛋白PR-10蛋白核糖核酸酶活性的酶學(xué)參數(shù)及穩(wěn)定性的差異可能源于二者不同的氨基酸組成及糖基含量。未來將進一步測定當(dāng)歸中不同PR-10蛋白的全序列、三維結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能，以進一步揭示當(dāng)歸中不同PR-10蛋白之間的結(jié)構(gòu)與功能的異同點。