解脂耶氏酵母表面展示β-淀粉酶與α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶及一步法由淀粉合成低聚異麥芽糖

劉大文，程海榮，鄧子新

上海交通大學 生命科學技術(shù)學院 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240

低聚異麥芽糖 (Isomalto-oligosaccharides，簡稱IMO) 是一類含有一個或多個α-1,6糖苷鍵的多聚葡萄糖 (Glucose oligomers)，除了含有α-1,6糖苷鍵外，還可以同時含有α-1,4糖苷鍵。IMO通常包括異麥芽糖、潘糖、異潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、異麥芽五糖以及更長糖鏈的低聚糖[1]。另外，國際上通常把含有α-1,2糖苷鍵或α-1,3糖苷鍵的多聚葡萄糖也劃分為低聚異麥芽糖的范疇[2]。IMO的聚合度通常為2–10，但目前由酶轉(zhuǎn)化的IMO聚合度通常為2–4，即異麥芽糖、潘糖、異潘糖、異麥芽三糖以及異麥芽四糖。IMO在食品、醫(yī)藥以及化妝品領(lǐng)域都有應用，在食品領(lǐng)域應用最廣泛。作為一種優(yōu)良的益生元，IMO能顯著提高機體消化道內(nèi)益生菌的群體數(shù)量，維持穩(wěn)定健康的微生態(tài)，促進消化道對礦物質(zhì)的吸收，調(diào)節(jié)膽固醇與甘油三酯的水平，還能提高機體的免疫功能[3-6]?；贗MO的生理功能，IMO已經(jīng)在乳制品、酵素、功能飲品、黃酒等食品中得到非常廣泛的應用。目前世界很多國家都已批準IMO在食品中的應用，因此市場占有量逐年上升[7]。

典型的IMO的合成方法是采用多酶協(xié)同法，出發(fā)原料為玉米淀粉。首先，玉米淀粉經(jīng)過乳化加入中溫或者高溫 α-淀粉酶液化為麥芽糊精(Maltodextrin)，再加入真菌β-淀粉酶 (β-amylase) 與普魯蘭酶 (Pullulanase) 進行糖化，糖化液含有50%以上含量的麥芽糖，最后加入曲霉來源的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶 (α-transglucosidase) 在50 ℃下進行轉(zhuǎn)糖基反應，生成含有α-1,6糖苷鍵的低聚異麥芽糖[8]，這種典型的三步法合成IMO步驟多，使用酶多且過程長。后來又開發(fā)出兩步酶轉(zhuǎn)化法[9]：首先玉米淀粉經(jīng)過乳化加入中溫或者高溫α-淀粉酶液化為麥芽糊精 (Maltodextrin)，然后加入具有水解與轉(zhuǎn)苷酶活性的麥芽糖淀粉酶 (Maltogenic α-amylase)，合成IMO。我國學者Lin等[10]利用水稻淀粉為底物，利用新普魯蘭酶 (Neopullulanase) 與糖化淀粉酶(Saccharifying α-amylase) 組合，加入到水稻淀粉乳中，57 ℃反應72 h能得到純度為59.2%的IMO。該方法不用單獨在高溫下液化淀粉，直接在淀粉乳中加入上述兩種酶，較兩步法更為簡便。

雖然上述合成IMO的方法能夠以淀粉為原料合成IMO，但均首先需要通過發(fā)酵的方法制備酶，制備酶的過程較為費時而且成本較高，轉(zhuǎn)化時間也較長。因此，開發(fā)一種無需制備純酶、轉(zhuǎn)化時間又短的合成方法對于進一步降低成本具有重要的意義。本研究采用食品安全的解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica為出發(fā)菌株，通過將β-淀粉酶與α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶融合在一起，利用酵母展示系統(tǒng)將融合酶固定在細胞表面，培養(yǎng)酵母細胞，轉(zhuǎn)化液化的淀粉一步法合成IMO。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

大腸桿菌Top 10作為質(zhì)粒擴增宿主，BL21(DE3) 作為質(zhì)粒表達宿主，均為本實驗室保存。LB培養(yǎng)基 (10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl) 37 ℃培養(yǎng)，LB中添加100 μg/mL氨芐青霉素用作篩選。

解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaCGMCC7326作為酶表面展示宿主，為本實驗室保存。YPD培養(yǎng)基(10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，20 g/L葡萄糖)30 ℃培養(yǎng)，YPD中添加200 μg/mL潮霉素B作為篩選使用。

1.2 菌株的構(gòu)建

1.2.1 構(gòu)建包含β-淀粉酶基因(β-amylase)的酵母展示菌株

耐熱β-淀粉酶基因來自熱硫嗜熱厭氧桿菌Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes(GenBank Accession No.M22471)，基因大小為1 668 bp[11]。該基因按照酵母Y.lipolytica密碼子進行優(yōu)化并委托安徽通用生物技術(shù)有限公司進行全基因合成，合成后亞克隆到用BamHⅠ與KpnⅠ雙酶切的載體 pINA1313[12]中，構(gòu)成新質(zhì)粒pINA1313-β-amylase。Y.lipolytica的錨定蛋白Pir1基因(GenBank Accession No.AF336989，861 bp)采用一對引物Ppir1-F與Ppir1-R進行PCR擴增并亞克隆到PmlⅠ與BamHⅠ雙酶切的質(zhì)粒pINA1313-β-amylase中，構(gòu)成新質(zhì)粒pINA1313-Pir1-β-amylase。再采用一對引物 Php4d-F與 Phph-R，以質(zhì)粒pUB4-CRE為模板[13]，將抗性篩選標記基因片段擴增 (大小1.5 kb) 后連接到用SalⅠ與ClaⅠ雙酶切的載體pINA1313-Pir1-β-amylase中，最后構(gòu)建成含β-淀粉酶表面展示表達盒與抗性篩選標記的Y.lipolytica酵母整合表達載體pSWV-β-amylase。

1.2.2 構(gòu)建包含 α-葡萄糖苷酶基因 (αtransglucosidase，GTase) 的酵母展示菌株

耐熱 α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因來自黑曲酶Aspergillus niger(GenBank Accession No.D45356，去除信號肽57個堿基后為2 958 bp)[14]。該基因按照酵母Y.lipolytica密碼子進行優(yōu)化并委托安徽通用生物技術(shù)有限公司進行全基因合成，并亞克隆到用BamHⅠ與KpnⅠ雙酶切的載體pSWV-β-amylase 中，構(gòu)成新質(zhì)粒pSWV-GTase。

1.2.3 β-amylase與GTase融合基因質(zhì)粒構(gòu)建

β-amylase與GTase基因融合參考Wang等[15]引入linker (5?-TTAGGATCTAGATCTGCCGAATT A-3?)，融合方式一種是5?-β-amylase-linker-GTase-3?(簡稱為βa-GT)，另一種是5?-GTase-linker-β-amylase-3?(簡稱為GT-βa)，融合所用的引物序列見表1。先以質(zhì)粒pSWV-β-amylase為模板，Pβ1-F/Pβ1-R一對引物擴出β-amylase基因；以pSWV-GTase為模板，以PG1-F/PG1-R一對引物擴出GTase基因；以上述兩輪PCR產(chǎn)物作為混合模板 (含有GTase基因與β-amylase基因)，以Pβ1-F與PG1-R一對引物擴出融合基因βa-GT，采用重組酶克隆法克隆到BamHⅠ與XhoⅠ雙切的載體pSWV-β-amylase中，構(gòu)成重組質(zhì)粒pSWV-βa-GT。

以pSWV-GTase為模板，PG2-F/PG2-R一對引物擴增出GTase基因；以pSWV-β-amylase為模板，Pβ2-F/Pβ2-R為引物擴出β-amylase基因。以上兩輪PCR產(chǎn)物作為混合模板，以PG2-F與Pβ2-R作為引物擴出融合基因GT-βa，采用重組酶克隆法克隆到BamHⅠ與XhoⅠ雙切的載體pSWV-βamylase中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSWV-GT-βa。構(gòu)建示意圖如圖1所示。

表1 構(gòu)建質(zhì)粒所涉及到的引物Table 1 Polymerase chain reaction primers used in this study

圖1 β-amylase-GTase與GTase-β-amylase基因合成、質(zhì)粒構(gòu)建及線性化流程圖Fig.1 Scheme of the synthesis of β-amylase-GTase and GTase-β-amylase plasmid and the linearized functional elements.

1.2.4 大腸桿菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以融合基因片段βa-GT和GT-βa為模板設計引物見表1，引入酶切位點NcoⅠ和XhoⅠ。以βa-GT為模板，PβG-F 和PβG-R作為引物PCR獲得片段，重組連接入NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切載體pET32b得到重組質(zhì)粒pET32b-βa-GT。以GT-βa為模板，PGβ-F 和PGβ-R作為引物PCR獲得片段，重組連接入雙酶切載體pET32b得到重組質(zhì)粒pET32b-GT-βa。以pSWV-β-amylase質(zhì)粒為模板，PβG-F和PGβ-R為引物PCR獲得單個基因片段，連入載體得到重組質(zhì)粒pET32b-β-amylase。以pSWV-GTase 質(zhì)粒為模板，PGβ-F和PβG-R為引物PCR獲得單個基因片段，連入載體得到重組質(zhì)粒pET32b-GTase。

1.3 菌株的純化與表達

1.3.1 酵母菌株的純化與鑒定

將上述質(zhì)粒pSWV-β-amylase、pSWV-GTase、pSWV-βa-GT和pSWV-GT-βa使用EcoRⅠ單酶切獲得線性化片段，參考Chen等[16]報道的“醋酸鋰一步轉(zhuǎn)化法”轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母，將Y.lipolyticaCGMCC7326在30 ℃平板活化生長一夜，取活化的菌株適量加入提前配置好的200 μL轉(zhuǎn)化緩沖液中 (400 g/L PEG 4 000，150 mmol/L pH 6.0醋酸鋰，150 mmol/L二硫蘇糖醇，0.2 mg/mL單鏈DNA)，加入線性化片段3-5 μg，同時用ddH2O作為空白對照，39 ℃孵育90 min，將反應混合物涂布在潮霉素抗性YPD平板進行篩選。30 ℃穩(wěn)定生長3-5 d，可獲得單菌落200-300個，取新的抗性平板純化3-4次后，獲得穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化子約50個。挑取轉(zhuǎn)化子在50 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)1 d，按照Cheng等[17]報道的玻璃珠提取基因組的方法提取酵母轉(zhuǎn)化子基因組，將pSWV-β-amylase以Pβ1-F和Pβ1-R為引物、pSWV-GTase以PG1-F和PG1-R為引物、pSWV-βa-GT以Pβ1和PG1-R為引物、pSWV-GT-βa以PG2-F和Pβ2-R為引物分別進行PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將以上各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母獲得的轉(zhuǎn)化子命名為Yβa、YGT、Yβa-GT和YGT-βa。

1.3.2 酵母菌株活性的表達

為測定不同轉(zhuǎn)化子活力，Yβa、Yβa-GT、YGT-βa各挑選數(shù)個轉(zhuǎn)化子接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d，待OD600達到15-20時，將菌液全部倒入50 mL 離心管內(nèi)，10 000 r/min離心7 min，除去上清，得沉淀細胞，使用無菌水洗滌細胞2次，盡量除去水分后得純凈細胞，濕重約250 mg。配制3%可溶性淀粉溶液作為底物(即3 g淀粉溶解于ddH2O中并定容至100 mL，淀粉需加熱溶解成透明狀)，取15 mL加入上述含純凈細胞的離心管，放在50 ℃、200 r/min反應，定時取1 mL反應液入EP管內(nèi)–20 ℃暫存。

同樣將YGT、Yβa-GT、YGT-βa各轉(zhuǎn)化子得到的純凈細胞加入配制的底物40%麥芽糖溶液中(即40 g麥芽糖溶于100 mL ddH2O)，50 ℃、200 r/min反應，定時取1 mL反應液入EP管內(nèi)–20 ℃暫存以備后續(xù)監(jiān)測產(chǎn)物。根據(jù)產(chǎn)物生成量計算出轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)率，選擇出最優(yōu)轉(zhuǎn)化子。

因β-淀粉酶在50–80 ℃條件下可達到60%以上活性，α-葡萄糖苷酶在40–55 ℃條件下可達到90%以上活性，選擇兩者適宜溫度50 ℃作為實驗溫度，為兩者融合創(chuàng)造最適宜溫度。實驗中以不含任何質(zhì)粒的Y.lipolytica酵母細胞作為空白對照，證明酶是否表達。

1.3.3 大腸桿菌菌株活性的表達

大腸桿菌BL21 (DE3) 作為質(zhì)粒表達宿主，利用載體所含抗性基因，將含質(zhì)粒pET32b-βamylase、pET32b-GTase、pET32b-βa-GT 和pET32b-GT-βa的菌液分別涂布在氨芐抗性LB平板獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，分別命名為Eβa、EGT、Eβa-GT和EGT-βa。

隨機挑取轉(zhuǎn)化子在5 mL LB抗性液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)約3 h，再將上述5 mL菌液接種于含50 mL抗性液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)約6 h，直到大腸桿菌OD600達到約1.0時，加入1 mmol/L IPTG作為誘導劑，轉(zhuǎn)移至16 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，實驗選取5個轉(zhuǎn)化子作為平行對照，含pET32b質(zhì)粒的菌株作為陰性對照，不含質(zhì)粒的菌株作為空白對照。

為測定大腸桿菌融合基因的表達，對Eβa-GT、EGT-βa所表達酶進行SDS-PAGE分析，具體操作如下：將誘導后的菌株細胞等細胞量各取兩個平行樣品，10 000 r/min離心2 min，棄上清，用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液洗滌細胞一次后加入20 μL懸浮細胞，加入上樣緩沖液(50 mmol/L pH 6.8 Tris-HCl，100 mmol/L二硫蘇糖醇，2% SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油)在沸水中煮10 min，離心所得上清即為上樣樣品。電泳使用金斯瑞ExpressPlus?蛋白預制膠，12%聚丙烯酰胺凝膠，一切操作流程按照說明書具體要求操作。

將誘導后的菌液倒入50 mL離心管內(nèi)，6 000 r/min離心5 min，去除上清培養(yǎng)基成分，加入無菌水洗滌細胞2次，獲得純凈大腸桿菌細胞約100 mg，在Eβa、Eβa-GT、EGT-βa細胞中加入5 mL 3%可溶性淀粉溶液，EGT、Eβa-GT、EGT-βa細胞中加入5 mL 40%麥芽糖溶液，分裝于1.5 mL EP管內(nèi)，每管約800 μL，50 ℃、200 r/min反應，定時取樣品–20 ℃暫存。

1.3.4 一步法由淀粉合成低聚異麥芽糖 (IMO)

取6個500 mL燒杯，分別加入150 mL ddH2O和40 g玉米淀粉，95 ℃預熱5 min，加入0.2 g耐高溫α-淀粉酶 (Sigma-A3306，>10 000 U/mL)95 ℃繼續(xù)反應，用玻璃棒攪拌使反應充分，在 2、4、6、10、15、20 min時分別從中取出一只燒杯，加入HCl使酶失去活性，NaOH調(diào)pH至7.0，降至室溫，用ddH2O定容至200 mL。取1 mL樣品4 ℃暫存待測，確定最適的玉米淀粉液化時間。將玉米淀粉按最適時間液化，獲得高濃度液化液，加入到依照上述實驗方法處理得到的Yβa-GT、YGT-βa純凈酵母細胞中，50 ℃、200 r/min反應，定時取1 mL反應液入EP管內(nèi)4 ℃暫存。

1.4 產(chǎn)物的分析方法及酶活檢測

將上述–20 ℃暫存樣品室溫溶解，10 000 r/min離心10 min，取上清入新EP管內(nèi)離心2次，獲得純凈樣品，使用HPLC檢測產(chǎn)物成分。色譜柱1：Shodex KS802 (8 mm×300 mm)，RI101型示差折光檢測器，流動相ddH2O；流速1.0 mL/min，柱溫70 ℃，進樣量20 μL。色譜柱2：Hydrophobic polystyrene gel (Shodex Rspak DC-613)，RI101型示差折光檢測器，流動相75%乙腈，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μL。

β-淀粉酶的一個活力單位 (U) 指在50 ℃反應條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol麥芽糖所需的酵母細胞或者大腸桿菌細胞干重 (mg)；α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的一個活力單位 (U) 指在50 ℃反應條件下每分鐘轉(zhuǎn)移1 μmol麥芽糖所需的細胞干重 (mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合基因質(zhì)粒表達盒的構(gòu)建與表達

構(gòu)建融合基因質(zhì)粒表達盒需先擴增β-amylase與GTase基因片段，如圖2所示，左為1.6 kb大小的β-amylase片段與2.9 kb大小的GTase片段，右為融合PCR獲得的融合片段βa-GT與GT-βa約4.5 kb，且融合質(zhì)粒上下游測序結(jié)果與NCBI-GenBank進行匹配一致性為100%，說明序列正確。在β-amylase-GTase融合中，β-amylase的C端與GTase的N端融合，GTase-β-amylase的融合方式與之相反。Linker序列的加入目的是加快重組DNA的構(gòu)建，且不刪除任何氨基酸，插入的片段表達的氨基酸為LGSRSAEL[15]。

融合質(zhì)粒在E.coli胞內(nèi)表達蛋白SDS-PAGE分析如圖3所示，Lanes 1–2為β-amylase-GTase蛋白，Lanes 3和4為GTase-β-amylase蛋白，去掉pET32b自身載體蛋白后大小約為170 kDa，與理論值相一致。

圖2 βa-GT和GT-βa基因擴增Fig.2 DNA gel electrophoresis of βa-GT and GT-βa gene.Lanes 1–2 : two parts PCR product of βa-GT,β-amylase and GTase; lanes 3–4: two parts PCR product of GT-βa, GTase and β-amylase; lanes 5–6: the whole PCR product of βa-GT and GT-βa.

圖3 E.coli表達βa-GT和GT-βa蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of the fusion protein βa-GT and GT-βa.Lanes 1–2, 3–4, 5: the supernatant (soluble proteins) of E.coli containing pET32b-βa-GT,pET32b-GT-βa and pET32b; lane 6: the supernatant(soluble proteins) of E.coli.

2.2 Y.lipolytica工程菌合成IMO

2.2.1 含β-amylase與GTase單基因的酵母展示菌株Yβa和YGT的選擇

經(jīng)過潮霉素抗性平板篩選得到約300個轉(zhuǎn)化子，選取50個較大的轉(zhuǎn)化子進一步純化，PCR驗證獲得陽性克隆30-40個不等。轉(zhuǎn)化子進行底物轉(zhuǎn)化實驗，根據(jù)轉(zhuǎn)化效率選出最優(yōu)轉(zhuǎn)化子。如圖4A所示，32個Yβa轉(zhuǎn)化子中有10個轉(zhuǎn)化子與空白對照相同，未表現(xiàn)出活性，其他由底物可溶性淀粉可產(chǎn)生約62%麥芽糖產(chǎn)率，選出最優(yōu)轉(zhuǎn)化子Yβa19，其酶活力為0.03 U/mg。通過對YGT(圖4B) 共40個轉(zhuǎn)化子添加底物40%麥芽糖溶液反應檢測，除了5個轉(zhuǎn)化子只表現(xiàn)出水解酶活性，即將麥芽糖水解產(chǎn)生葡萄糖外，其他均有IMO產(chǎn)生，產(chǎn)率在30%上下浮動，選出最優(yōu)轉(zhuǎn)化子YGT7，其酶活力約為0.023 U/mg。

圖4 不同酵母轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化淀粉或麥芽糖合成產(chǎn)物的差異分析Fig.4 Comparative analysis of different Y.lipolytica transformants.(A) Yields were obtained when various Yβa transformants converting 3% soluble starch to maltose.(B) Yields were obtained when various YGT transformants converting 40% maltose to IMO.

2.2.2 含βa-GT 和GT-βa融合基因的酵母展示菌株YGT-βa和Yβa-GT的選擇與表達差異

含融合基因酵母展示菌株經(jīng)多次純化獲得穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化子，對于YGT-βa，經(jīng)多次轉(zhuǎn)化獲得不同批次轉(zhuǎn)化子約100個均進行了底物轉(zhuǎn)化實驗，未見反應，懷疑是GTase基因先表達影響了整體的活性。

對于Yβa-GT，選取30個轉(zhuǎn)化子以3%可溶性淀粉溶液作為底物的產(chǎn)物組成見圖5A，不同的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)物表現(xiàn)各異，除去無反應的和只有麥芽糖一種產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子，有10個轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)物中觀測到了麥芽糖與葡萄糖，且葡萄糖占比約為麥芽糖的2倍；有11個在產(chǎn)物中只觀測到了葡萄糖，約占43%(淀粉不能完全轉(zhuǎn)化，有一部分底物殘留)。由此可認為此21個轉(zhuǎn)化子是兩個基因均發(fā)揮了作用，首先β-淀粉酶將淀粉水解產(chǎn)生麥芽糖，而耐熱α-葡萄糖苷酶對于低濃度的麥芽糖轉(zhuǎn)苷酶活性較弱，主要發(fā)揮了水解酶的活性，將得到的麥芽糖進一步水解產(chǎn)生葡萄糖。挑選其中的轉(zhuǎn)化子以麥芽糖作為底物實驗得到的結(jié)果與單個YGT7菌株基本無異 (圖5B)，證明了Yβa-GT融合菌株的確是兩個基因均可以表達，選出最優(yōu)轉(zhuǎn)化子Yβa-GT29。

2.2.3 不同轉(zhuǎn)化子合成IMO的差異可能是由于外源基因插入染色體的位置不同而造成的

以上轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗證基因組中均含有相應目的基因表達盒，但是不同的轉(zhuǎn)化子底物合成產(chǎn)物的性能存在較大的差異。圖4A中第19號含β-amylase基因的轉(zhuǎn)化子 (Yβa19)，由可溶淀粉轉(zhuǎn)化生成麥芽糖產(chǎn)率為71%，而有的轉(zhuǎn)化子雖然含有目的基因卻不能合成IMO。對于含GTase基因的轉(zhuǎn)化子 (圖4B) 以及含融合基因βa-GT的轉(zhuǎn)化子(圖5A) 情況類似，不同轉(zhuǎn)化子合成產(chǎn)物的性能差距很大。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是表達盒雖然整合到了Y.lipolytica基因組中，但其表達差異很大。我們選取了3個均含有β-amylase基因的轉(zhuǎn)化子 (Yβa2、Yβa13、Yβa19) 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄進行β-amylase基因表達水平熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)Yβa2轉(zhuǎn)化子的β-amylase基因相對表達水平為0，即沒有得到表達，Yβa19的相對表達水平為4.2，Yβa13的相對表達水平為1.7，與產(chǎn)物產(chǎn)率相一致。因此可以看出，雖外源基因均整合到基因組中，但由于其表達水平的差異而導致不同轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化性能差異。產(chǎn)生這些差異的根本原因很可能是基因插入到基因組中的位置效應而導致的。染色體中有的位置基因活躍，而有的位置沉默，外源基因所處的位置對于其表達水平至關(guān)重要。Wu等[18]利用熒光蛋白作為標記研究了釀酒酵母6條染色體中的不同的位置對于熒光蛋白基因的表達水平的影響，發(fā)掘了一批活躍表達與沉默的位置，為外源基因在釀酒酵母中的表達奠定了基礎(chǔ)。因此，為了獲得外源基因的最高水平的表達，應該將外源基因插入到染色體的活躍區(qū)域。

2.3 E.coli工程菌合成IMO

2.3.1 含β-amylase與GTase單基因的大腸桿菌菌株Eβa和EGT合成麥芽糖與IMO的性能

為比較酵母與大腸桿菌細胞的表達差異，將單個基因利用載體pET32b在BL21 (DE3) 表達宿主內(nèi)表達。值得注意的是，EGT菌株在添加麥芽糖作為底物后，完全沒有產(chǎn)物IMO產(chǎn)生，原因可能是GTase基因為真菌米曲霉的基因，在大腸桿菌中不能正確折疊因而沒有活性。含β-amylase基因的Eβa細胞轉(zhuǎn)化淀粉的效率反而大幅度提高，如圖6，在加入底物的瞬間即能檢測到麥芽糖產(chǎn)物的產(chǎn)生，20 min時已有60.5%麥芽糖產(chǎn)生，其酶活為0.398 U/mg，為酵母展示菌株的13.3倍，可用作由淀粉生產(chǎn)麥芽糖的工程菌株。

2.3.2 含βa-GT和GT-βa融合基因的E.coli菌株EGT-βa和Eβa-GT合成IMO的性能

含β-淀粉酶與α-葡糖糖轉(zhuǎn)苷酶基因的酵母菌株Yβa-GT具有良好活性 (圖5)，能將液化的淀粉轉(zhuǎn)化為IMO。而對于含β-淀粉酶與α-葡糖糖轉(zhuǎn)苷酶基因的E.coli菌株，不同融合方式的EGT-βa、Eβa-GT菌株均能轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成麥芽糖，表明EGT-βa、Eβa-GT菌株的β-amylase基因均能表達成具有活性的淀粉酶；但是均不能轉(zhuǎn)化麥芽糖生成IMO，表明GTase基因雖然能得到融合表達(圖3)，但是無活性，與單基因GTase在大腸桿菌內(nèi)表達的結(jié)果相符。值得注意的是，β-淀粉酶基因與α-葡糖糖轉(zhuǎn)苷酶基因以GTase-β-amylase順序在酵母中融合表達時，這兩個基因均未表現(xiàn)出活性，而在大腸桿菌中融合表達時，β-amylase有活性，而GTase沒有活性。

圖5 選取不同的酵母轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化淀粉合成產(chǎn)物的分析Fig.5 Comparative analysis of different Y.lipolytica transformants.(A) Yield of products by the Yβa-GT transformants with the 3% starch.(B) Yield of products by the Yβa-GT 2,10,11,17, 29 transformants and YG7 with the 40% maltose.

圖6 大腸桿菌Eβa轉(zhuǎn)化可溶性淀粉時產(chǎn)物生成色譜圖Fig.6 HPLC analysis of maltose products by E.coli Eβa cells with soluble starch.(A) 0 min.(B) 5 min.(C)20 min.(D) 40 min.

2.3.3 不同的基因融合順序?qū)Ρ磉_的酶活性的影響

將基因進行融合共同表達成為多功能融合酶，在蛋白質(zhì)工程中具有很大的潛力。融合酶由于其物理鄰近效應[19]，可以通過促進反應中間體轉(zhuǎn)移到下一種酶的活性位點使得融合酶催化的反應速率大幅度提高，該技術(shù)已經(jīng)在海藻糖以及長鏈低聚異麥芽糖的合成得到應用[15,20-21]。也可以使用兩種展示蛋白將兩個酶進行共展示在細胞表面，但融合酶由于更加鄰近，因而在反應中間體的轉(zhuǎn)移過程中可更快速到達下一個酶，反應效率更高。

本研究將合成低聚異麥芽糖的兩種關(guān)鍵酶β-淀粉酶基因與α-葡萄糖苷酶基因進行融合，在Y.lipolytica中進行表面展示表達以及在E.coli中進行胞內(nèi)表達。有趣的是，融合基因在酵母表面展示表達時，基因的不同融合順序?qū)γ傅幕钚跃哂泻艽蟮牟町?。當以?amylase-GTase的先后順序進行融合表達時，兩種酶均有活性；而當以GTase-β-amylase的先后順序在酵母表面進行融合表達時，均未發(fā)現(xiàn)有催化活性。然而，當融合基因在大腸桿菌進行胞內(nèi)融合表達時，無論以哪種融合順序 (GTase-β-amylase或β-amylase-GTase)，發(fā)現(xiàn)β-amylase均有催化活性，而GTase均無活性 (表2)。造成這種酶活性因融合順序不同而不同的原因，很可能是融合順序影響了GTase的正確折疊。無論是GTase-β-amylase或β-amylase-GTase融合方式，在大腸桿菌中GTase均不能正確折疊，即使能夠表達也沒有活性。而β-amylase能夠正確折疊，從而在這兩種不同的融合方式中均表現(xiàn)出活性。因此，在進行酶融合表達研究時，需要對不同的融合順序研究，以確定最佳的融合方式。

2.4 一步法合成IMO

將優(yōu)選出的Yβa-GT29酵母菌株培養(yǎng)獲得大量細胞，使用液化的玉米淀粉作為底物。根據(jù)玉米淀粉乳液化時間圖譜分析選定15 min為最適液化時間，圖7中A、B、C、D為添加Yβa-GT29細胞在50 ℃反應時所得產(chǎn)物的HPLC分析圖，淀粉被轉(zhuǎn)化生成低聚葡萄糖。用色譜柱Shodex DC613、乙腈作為流動相將7 D產(chǎn)物進行分析，可清晰看出各低聚糖的含量 (圖8A)。將異麥芽糖、潘塘、異麥芽三糖、異麥芽四糖及以上的寡糖歸為IMO，可占總產(chǎn)物的75.3%，即200 g/L玉米淀粉最終可產(chǎn)150.6 g/L IMO。轉(zhuǎn)化過程中IMO各組分含量隨時間變化見圖8B，麥芽糖在7 h后開始減少，慢慢轉(zhuǎn)化成其他低聚糖。

表2 Y.lipolytica和E.coli中基因表達活性情況匯總表Table 2 The outline of genes expression in Y.lipolytica and E.coli

如前言所說，低聚異麥芽糖目前通過淀粉以多酶有序進行轉(zhuǎn)化合成，步驟較多，操作比較復雜，增加了生產(chǎn)成本。由于α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶是合成低聚異麥芽糖的關(guān)鍵酶，也是成本較高的酶之一，為了減少該酶的成本，有人研究采用化學戊二醛酶固定化的方式增加轉(zhuǎn)苷酶的使用次數(shù)[22-23]，但是當酶失效后，產(chǎn)生大量的固定化介質(zhì)廢棄物難以處理或增加廢棄物處理成本。而采用本研究開發(fā)的雙酶融合共表達并展示固定在酵母表面的方法，能夠減少酶純化的成本，無需化學固定酶的步驟，展示的酶能夠多次反復利用。當酶失效后，酵母細胞仍然能夠制成酵母干粉或者酵母浸膏，當成培養(yǎng)基使用，整個過程持續(xù)循環(huán)，綠色環(huán)保，基本無廢棄物排放(Waste-Zero)。

解脂耶氏酵母Y.lipolytica是一種研究最廣泛的酵母之一，被美國食品藥品監(jiān)督局認定為公認安全的食品微生物，已經(jīng)在食品工業(yè)得到廣泛的應用，如合成有機酸、赤蘚糖醇、Ω-3多不飽和脂肪酸 (如二十碳五烯酸EPA)、β-胡蘿卜素等[24-28]。我們研究小組利用該酵母作為微生物細胞工廠，將果糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、海藻糖合成酶以及異麥芽酮糖合成酶表面展示在解脂耶氏酵母細胞表面，分別得到合成低聚果糖、低聚半乳糖、海藻糖以及異麥芽酮糖的工程菌株[29-32]。本研究將β-淀粉酶與α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶進行融合，同時表面展示在解脂耶氏酵母細胞上，對轉(zhuǎn)化子進行篩選得到一株由液化淀粉為底物一步法合成低聚異麥芽糖的菌株Yβa-GT29，轉(zhuǎn)化率達到75.3%，為工業(yè)合成IMO提供了一種新的方法。

圖7 Yβa-GT29細胞轉(zhuǎn)化玉米淀粉液化液生成產(chǎn)物的色譜圖Fig.7 HPLC analysis of products obtained by Yβa-GT29 cells with the liquefied maize starch.(A) 0 h.(B) 5 h.(C)10 h.(D) 20 h.

圖8 Yβa-GT29細胞轉(zhuǎn)化玉米淀粉液化液的IMO各組分色譜圖 (A) 及時間變化圖 (B)Fig.8 HPLC analysis of carbohydrates in the IMO syrup obtained by Yβa-GT29 cells with the liquefied maize starch (A)and changes in the content during the bioconversion time (B).