畢赤酵母中tRNA基因的表達及其作用效果

彭夢，譚明，曾艷，鄭宏臣，宋詼

1 天津科技大學(xué)，天津 300457

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

轉(zhuǎn)運核糖核酸 (tRNA) 是在生物體內(nèi)廣泛存在的一類非編碼RNA分子[1]。在基因表達過程中，tRNA是遺傳信息傳遞過程中的重要參與者，是連接核苷酸序列和氨基酸序列的重要紐帶[2]。細胞內(nèi)每種tRNA的數(shù)量存在顯著差異，由于密碼子簡并性的存在，生物體內(nèi)的高表達基因均采用了數(shù)量相對豐富的tRNA所對應(yīng)的密碼子以保證表達過程的高效順利完成，這些密碼子稱為偏好密碼子；與此對應(yīng)的，數(shù)量相對稀少的tRNA對應(yīng)的密碼子生物體一般較少采用，稱為稀有密碼子[3]。這種生物對于使用部分密碼子的傾向性現(xiàn)象被稱為密碼子偏好性，不同生物的密碼子的偏好性存在著顯著差異[4]。將一種生物來源的基因轉(zhuǎn)入另外的宿主中進行外源表達時，經(jīng)常面臨基因來源生物與宿主生物密碼子偏好性不同的問題，這將導(dǎo)致外源基因在核糖體上的翻譯過程因為宿主體內(nèi)對應(yīng)tRNA短缺而出現(xiàn)停滯現(xiàn)象，造成基因低表達或不表達。一般通過將外源基因按照宿主密碼子偏好性進行改造的方式解決[5-6]。另外一種方式是通過提高宿主體內(nèi)稀少tRNA的豐度，從而提高外源基因表達幾率和表達量[7-8]。

例如，精氨酸密碼子AGA/AGG是真核生物中常見的密碼子，但在大腸桿菌中特別罕見[9-11]。Dieci等[12]通過使用攜帶大腸桿菌argU基因 (argU基因編碼的稀少tRNA識別AGA/AGG密碼子)的質(zhì)粒來克服這種限制。用含有大腸桿菌argU基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化已含有外源核糖體蛋白基因的大腸桿菌，使5種真核生物來源的細胞質(zhì)核糖體蛋白表達量提高至總細菌蛋白質(zhì)的50%。Kleber等[13]在細菌中表達不同的花生過敏原時發(fā)現(xiàn)，Arah 1、2、6的成熟基因中含有8%–10%稀有密碼子AGA/AGG，其表達量比含0.8%同樣稀有密碼子AGA/AGG的Arah 5要低很多。在不改變基因密碼子含量的情況下，通過在大腸桿菌細胞中增加稀少tRNAargU、ileY和lueW基因的拷貝數(shù)，使Arah 1、2、6表達量提高了100多倍。Robert等[14]通過補充大腸桿菌缺乏的6種稀少tRNA，構(gòu)建了商業(yè)化的Rosseta大腸桿菌表達系統(tǒng)。實驗結(jié)果驗證Rosseta表達系統(tǒng)能夠緩解由密碼子偏好性導(dǎo)致的蛋白表達量低的問題，可以提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平[15-17]。Constanze等[18]在巨大芽孢桿菌中通過共表達稀少tRNA基因，外源細胞外水解酶 (TFH) 蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加了18倍。但在目前應(yīng)用較廣泛的畢赤酵母真核表達系統(tǒng)中還未有相關(guān)研究報道。

為了實現(xiàn)在畢赤酵母中提高稀少tRNA豐度提高外源基因表達量的目的，需要獲得準(zhǔn)確的畢赤酵母稀少tRNA基因。目前，tRNA基因主要依靠軟件預(yù)測技術(shù)進行發(fā)掘，其中應(yīng)用最為廣泛的是tRNAScan-SE軟件[19]。其預(yù)測結(jié)果被大多數(shù)基因組作為測序分析tRNA基因的注釋依據(jù)而采用。但由于真核生物tRNA基因的轉(zhuǎn)錄后修飾較為復(fù)雜，依靠識別基因組中tRNA基因的第34–37位堿基作為反密碼子的預(yù)測方式偏差較大[20]，因此需要對預(yù)測出的畢赤酵母tRNA基因結(jié)果進行實驗驗證。

Constanze等在巨大芽孢桿菌構(gòu)建了一種以GFP為報告基因的tRNA基因驗證方法，該驗證方法在GFP基因序列5?端15個堿基后加入多個連續(xù)稀有密碼子，在GFP基因序列之后加入待驗證的稀有密碼子對應(yīng)tRNA的基因，構(gòu)建表達載體后轉(zhuǎn)入巨大芽孢桿菌共表達。若與未轉(zhuǎn)入tRNA基因的帶有連續(xù)稀有密碼子的GFP對照組相比GFP的表達量有提高，則表明待驗證的tRNA基因轉(zhuǎn)錄出的成熟tRNA可識別相應(yīng)稀有密碼子，能夠克服由于連續(xù)稀有密碼子對其表達造成的阻遏效果[18]。

NFATc3T是活化T細胞核因子NFAT家族成員，是一組在哺乳動物組織細胞中廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，在免疫反應(yīng)中對誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄起重要作用[21]。NFAF在多種免疫細胞中均有表達，如T細胞、B細胞、NK細胞、肥大細胞、單核細胞和嗜酸粒細胞等，在細胞分化、生長過程中起重要作用，已成為腫瘤研究中的熱點，并有可能成為新的腫瘤治療靶點[22]。NFAT保守型較高，在氨基端約100個殘基區(qū)域為一個很強的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(Trans-activation domain，TAD)，在該區(qū)域基因內(nèi)有多個連續(xù)脯氨酸稀有密碼子CCG，進行畢赤酵母外源表達時會造成極大概率的翻譯提前終止[23]。

本研究在畢赤酵母中優(yōu)化了以GFP為報告基因的稀少tRNA基因驗證方法，比較了將帶有連續(xù)稀有密碼子阻遏區(qū)的GFP基因和待驗證tRNA基因使用同一載體共表達和使用不同載體共表達兩種方式，并對畢赤酵母tRNA基因進行了驗證。完成了人類活化T細胞核因子TAD區(qū)域NFATc3T和GFP融合基因與tRNA基因在畢赤酵母GS115中的共表達。驗證了在畢赤酵母中表達tRNA基因?qū)B續(xù)稀有密碼子CCG導(dǎo)致翻譯提前終止現(xiàn)象的去阻遏作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

畢赤酵母GS115 (P.pastorisGS115)，大腸桿菌DH5α (Escherichia coliDH5α) 及穿梭質(zhì)粒pPIC9K、pFLDα均為中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶工程研究組實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與耗材

D-葡萄糖、YNB、氨芐青霉素 (Amp)、博來霉素 (Zeosin) 購自 Solarbio (美國)。生物素(D-Biotin) 購自BIO BASIC INC公司 (加拿大)；甲醇購自國藥集團化學(xué)有限公司。

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB (美國)；高保真DNA聚合酶購自康為世紀(jì)生物科技有限公司 (中國)。

質(zhì)粒小提試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司 (中國)。

PCR所需引物均由北京華大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建

為了在畢赤酵母GS115中建立tRNA表達體系，選擇綠色熒光蛋白GFP基因作為報告基因。GFP基因由安徽通用生物公司進行全序列合成，并克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點EcoRⅠ和NotⅠ之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-GFP (簡寫pGFP)。同時在GFP基因序列5?端的15個堿基對下游插入4個連續(xù)的畢赤酵母脯氨酸稀有密碼子CCG作為基因表達的阻遏區(qū)，構(gòu)建基因GFP4CCG(圖1)。

人類活化T細胞核因子TAD區(qū)域NFATc3T基因 (Gene ID: 100458008) 及綠色熒光蛋白GFP基因的融合基因NFATc3T-GFP由安徽通用生物公司進行全序列合成，并克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點的EcoRⅠ和NotⅠ之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-NFATc3T-GFP。

利用tRNAScan-SE 2.0軟件檢索GS115基因組序列后獲得待驗證的基因序列以及作為對照組的基因序列。設(shè)計PCR引物 (表1)后，以酵母基因組DNA提取試劑盒提取的畢赤酵母GS115基因組為模板PCR擴增獲得基因和基因 (圖1)。

圖1 PCR擴增得到的基因序列Fig.1 The gene sequence amplified by PCR.The gray broken arrow represents the open reading frame of GFP.Four identical consecutive rare codons CCG are integrated into the coding region of GFP.The blue arrow indicates the tRNA gene.

表1 實驗所用引物Table 1 PCR primers used in the experiment

在Constanze等的同一載體共表達方法中，帶稀有密碼子阻遏區(qū)的GFP基因與待驗證tRNA基因距離太近，tRNA基因回文序列可能對GFP基因的轉(zhuǎn)錄和表達造成影響[24]。為了驗證這一影響，分別構(gòu)建了利用同一載體表達GFP4CCG基因和基因的載體pPIC9K-GFP4CCG-tRNA(簡寫為pGFP4CCG-tRNA)，以及利用不同載體表達GFP4CCG基因和基因的載體pPIC9KGFP4CCG(簡寫pGFP4CCG) 和pFLDα-tRNA(簡寫ptRNA)。

為了給待驗證的基因提供對照，構(gòu)建了包含不能識別密碼子CCG的的基因的載體pFLDα-tRNA(簡寫ptRNA)。

1.2.2 電擊轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定

重組質(zhì)粒pPIC9K-GFP、pPIC9K-GFP4CCG、pPIC9K-GFP4CCG-tRNA以限制性內(nèi)切酶SalⅠ作為線性化位點酶切后進行濃縮，通過電擊轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，通過在MD篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)分別獲得GS115/pGFP、GS115/pGFP4CCG和GS115/pGFP4CCG-tRNA轉(zhuǎn)化子。

電擊轉(zhuǎn)化：取80 μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞與10 μL (約2 μg) 線性化DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電擊杯中，在冰上放置5 min，電壓1500 V進行電擊，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇至電轉(zhuǎn)杯中，將內(nèi)容物涂于篩選平板，在30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單克隆產(chǎn)生。

轉(zhuǎn)化子鑒定：挑取篩選平板上的單菌落接種于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，29 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，取出1 mL用于保菌后，剩余菌液采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。并以酵母基因組DNA為模板，以通用引物AOX和FLDα引物 (pFLDα骨架引物，于tRNA基因上下游各150 bp處設(shè)計引物) (表2) 對轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證。PCR擴增體系：5×Cobuddy HF緩沖液10 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物各1.5 μL，模板1 μL，Cobuddy 0.5 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止。1%瓊脂糖凝膠電泳120 V、30 min，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.2.3 菌株培養(yǎng)及GFP基因甲醇誘導(dǎo)表達

大腸桿菌培養(yǎng)：將驗證正確的轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基中 (Amp，100 μg/mL)，37 ℃、220 r/min搖床中過夜培養(yǎng)，用于質(zhì)粒提取。

畢赤酵母培養(yǎng)及誘導(dǎo)：將重組畢赤酵母菌株劃線于YPD平板，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2–3 d至單菌落長出，挑取單菌落于10 mL BMGY液體培養(yǎng)基(100 mL三角瓶)，于29 ℃、220 r/min培養(yǎng)40 h，轉(zhuǎn)接于20 mL BMMY液體培養(yǎng)基 (250 mL避光擋板三角瓶) 測每個菌液OD600光吸收值，并將每個菌液調(diào)到同一個OD600水平。29 ℃、220 r/min，每隔24 h添加甲醇至終濃度為2%誘導(dǎo)培養(yǎng)，同時測OD600光吸收值作菌液生長曲線。

1.2.4 GFP4CCG基因與tRNA基因共表達的熒光檢測

每隔24 h取2 mL誘導(dǎo)表達菌液于包有鋁箔的避光EP管中，12 000 r/min離心10 min，無菌注射器小心吸取菌液上清，用已滅菌的0.22 μm的濾器進行過濾除菌及雜質(zhì)。并將過濾后的上清轉(zhuǎn)至新的包有鋁箔的避光EP管，分別取200 μL樣品于96孔熒光酶標(biāo)板，以BMMY培養(yǎng)基 (已過濾除菌) 為空白對照，采用連續(xù)多功能酶標(biāo)儀Flex Station 3進行熒光值的檢測，檢測激發(fā)光為485 nm，發(fā)射光為523 nm。

表2 AOX與FLDα引物Table 2 Primers: AOX and FLDα

熒光顯微鏡下觀察畢赤酵母細胞內(nèi)熒光，取誘導(dǎo)表達相同時間的重組畢赤酵母菌液，12 000 r/min離心10 min，收集菌體，ddH2O懸浮菌體，洗滌，離心收集菌體，重復(fù)洗滌3遍，重懸菌體于1 mL ddH2O，熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光。

1.2.5 SDS-PAGE驗證

三氯乙酸沉淀：取發(fā)酵上清液1 mL，加入100%三氯乙酸 (TCA) 溶液150 μL (終濃度13%)，充分混勻，–20 ℃沉淀10 min，4 ℃沉淀12–24 h，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL丙酮吹懸洗滌沉淀，12 000 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)洗滌3次，室溫干燥至丙酮完全揮發(fā)，所得沉淀即為蛋白樣品。

SDS-PAGE驗證：將所得到的蛋白樣品用20 μL 6 mol/L的尿素溶解，并加入7 μL 4×蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min；待樣品冷卻后，短暫離心，取12 μL蛋白樣品上樣并開始電泳。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R-250染色液染色2 h，然后換脫色液，脫色至條帶清晰可見，期間更換1–2次脫色液。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建

GFP4CCG基因和GFP4CCG-tRNA基因分別克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點EcoRⅠ和NotⅠ之間，得到的重組質(zhì)粒pPIC9K-GFP4CCG、pPIC9KGFP4CCG-tRNA分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株，應(yīng)用AOX引物 (表2) 進行PCR篩選轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子在瓊脂糖凝膠電泳中可見兩條帶，一條為含有目的基因加492 bpAOX部分基因序列的基因片段，其中GFP4CCG和GFP4CCG-tRNA的基因驗證條帶大小應(yīng)分別為1221 bp (729 bp+492 bp)和1374 bp (882 bp+492 bp)，另一條為AOX1基因片段，大小約為2 200 bp (圖2A，2B)。將驗證正確的重組菌株送樣測序，從而成功得到重組菌株GS115/pGFP4CCG和GS115/pGFP4CCG-tRNA。

同樣，將基因和基因克隆到穿梭質(zhì)粒pFLDα多克隆位點BamHⅠ處，得到的重組質(zhì)粒pFLDα-tRNA、pFLDα-tRNA分別轉(zhuǎn)入到重組菌株GS115/pGFP4CCG中，經(jīng)FLDα引物(表2) PCR篩選轉(zhuǎn)化子，基因和基因大小分別為147 bp和150 bp，加上pFLDα骨架上的300 bp，目的條帶分別為447 bp和450 bp(圖2C)。將驗證正確的重組菌株送樣測序，最終成功構(gòu)建了重組菌株GS115/pGFP4CCG/ptRNA和GS115/ pGFP4CCG/ptRNA。

圖2 重組畢赤酵母的PCR驗證Fig.2 PCR identification of the positive recombinant P.pastoris strains.M: nucleic acid molecular weight marker; +: positive control; –: negative control.(A) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCG.(B) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCGtRNA.(C) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCG/ptRNA; 3: recombinant strain GS115/pGFP4CCG/ptRNA.

2.2 重組畢赤酵母表達水平檢測

2.2.1 重組畢赤酵母的生長曲線

在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基中進行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)前將各個菌液的OD600調(diào)整為同一水平 (7.35左右)。在誘導(dǎo)過程中，各個重組表達菌株生長狀態(tài)情況 (圖3) 基本一致，添加tRNA基因與目的基因共表達沒有對菌株的生長產(chǎn)生負(fù)面影響。

2.2.2 帶有連續(xù)稀有密碼子阻遏的GFP表達

通過熒光顯微鏡 (圖4) 和SDS-PAGE (圖5)比較誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h左右菌株GS115/pGFP和GS115/pGFP4CCG受激發(fā)光源激發(fā)后熒光值和GFP表達水平 (GFP理論分子量約為27 kDa)，結(jié)果顯示，加入連續(xù)稀有密碼子后，GFP的表達受到了明顯阻遏。

圖3 重組畢赤酵母生長曲線Fig.3 The growth curve of recombinant P.pastoris.

圖4 GS115/pGFP轉(zhuǎn)化子和GS115/pGFP4CCG轉(zhuǎn)化子熒光對比Fig.4 Fluorescence comparison between GS115/pGFP and GS115/pGFP4CCG.

圖5 SDS-PAGE比較GFP基因添加連續(xù)稀有密碼子前后表達水平Fig.5 Comparing the expression levels of GFP gene before and after adding continuous rare codons by SDS-PAGE.M: protein molecular weight marker; 1:GS115/Pgfp; 2: GS115/pGFP4CCG.

2.2.3 tRNA基因效果驗證

各重組畢赤酵母的表達水平通過報告基因GFP的熒光值來體現(xiàn)。采用連續(xù)多功能酶標(biāo)儀在485 nm激發(fā)光源照射下，檢測523 nm發(fā)射光數(shù)據(jù)作為熒光值。誘導(dǎo)表達過程中各重組畢赤酵母的熒光值變化趨勢高度一致。

其中同載體共表達菌株GS115/pGFP4CCGtRNA與對照菌株GS115/pGFP4CCG相比，GFP表達量平均提高4.9%，不同載體共表達菌株GS115/pGFP4CCG/ptRNA與對照菌株GS115/pGFP4CCG相比GFP表達量平均提高12.5%。而共表達GFP4CCG和的菌株熒光值與對照菌株GS115/pGFP4CCG相比有所降低 (圖6)。

取誘導(dǎo)表達168 h的各菌液上清，通過SDS-PAGE檢測各重組畢赤酵母菌株中目的蛋白最終表達水平 (圖7)。GFP理論分子量約為27 kDa，從圖中可以看出4個重組畢赤酵母菌株都成功表達了GFP，其中GS115/pGFP4CCG/ptRNA菌株的GFP表達量最高，其次是GS115/pGFP4CCG-tRNA，都高于GS115/pGFP4CCG，而GS115/pGFP4CCG/ptRNA菌株的GFP表達量最低。經(jīng)軟件Quantity One對蛋白膠圖進行定量分析，其中，菌株GS115/pGFP4CCG、GS115/pGFP4CCG-tRNA和 GS115/pGFP4CCG/ptRNA的蛋白表達量分別為2.43、2.45、2.99 μg/mL，與檢測的熒光值結(jié)果一致。

圖6 重組畢赤酵母表達GFP熒光值對比Fig.6 Comparison of fluorescence values of GFP expressed in recombinant P. pastoris.*P≤0.05, **P≤0.01 and***P≤0.001(Student’s t-test).Error bars indicate standard deviations from three parallel experiments.

2.3 tRNA共表達系統(tǒng)驗證

2.3.1 融合基因NFATc3T-GFP表達菌株的構(gòu)建

圖7 SDS-PAGE比較GFP表達水平Fig.7 Comparing the expression levels of GFP by SDS-PAGE.M: protein molecular weight marker.1:GS115/pGFP4CCG.2: GS115/pGFP4CCG-tRNA.3: GS115/pGFP4CCG/ptRNA.4: GS115/pGFP4CCG/ptRNA.

重組質(zhì)粒pPIC9K-NFATc3T-GFP以限制性內(nèi)切酶SalⅠ作為線性化位點酶切后進行濃縮，通過電擊轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115和畢赤酵母重組菌株GS115/pFLDα-tRNA中，通過在MD篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化子 GS115/pNFATc3T-GFP和GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNA。其中，融合基因NFATc3T-GFP序列全長為1170 bp，由北京華大基因公司測序驗證正確。

2.3.2 NFATc3T-GFP融合蛋白表達水平檢測

圖8 重組畢赤酵母表達NFATC3T-GFP融合蛋白的熒光值對比Fig.8 Fluorescence contrast of NFATc3T-GFP expressed in recombinant P. pastoris.*P≤0.05, **P≤0.01 and ***P≤0.001 (Student’s t-test).Error bars indicate standard deviations from three parallel experiments.

誘導(dǎo)表達過程中各重組畢赤酵母的熒光值變化見圖8，熒光值變化趨勢高度一致。重組菌株GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNA表達NFATC3T-GFP融合蛋白的熒光值與重組菌株GS115/pNFATC3TGFP相比，平均提高了21.3%。

取誘導(dǎo)表達 168 h的菌液上清，通過SDS-PAGE檢測各重組畢赤酵母中目的蛋白最終表達水平 (圖9)。NFATc3T-GFP融合蛋白理論分子量約為43 kDa，從圖中可以看出2個重組菌株均成功表達出了目的蛋白。通過軟件Quantity One對蛋白膠圖進行定量分析，菌株GS115/pNFATc3TGFP/ptRNA的融合蛋白表達量約為2.59 μg/mL，與菌株GS115/pNFATC3T-GFP的融合蛋白表達量2.19 μg/mL相比，提高了18.3%，與檢測的熒光值結(jié)果相近。

3 討論

本文以帶有連續(xù)稀有密碼子CCG的GFP基因為報告基因，分別構(gòu)建了利用同載體表達GFP4CCG基因和基因的載體pPIC9K-GFP4CCGtRNA，以及利用不同載體表達GFP4CCG基因和基因的載體pPIC9K-GFP4CCG和pFLDαtRNA，并將重組載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進行表達。結(jié)果顯示，與單獨表達GFP4CCG相比，兩種共表達方式的GFP表達量均有提高，同載體共表達GFP表達量可提高4.9%，不同載體共表達GFP表達量可提高12.5%。采用不同載體共表達的方式優(yōu)于同一個載體共表達方式，SDS-PAGE定量分析GFP表達量的結(jié)果也得到相同結(jié)論。這一結(jié)果顯示tRNA基因與預(yù)表達的目的基因不在同一轉(zhuǎn)錄單元下表達，有利于其發(fā)揮抗阻遏的作用，這與Shin等[25]在大腸桿菌中獲得的結(jié)果一致。

圖9 SDS-PAGE比較NFATc3T-GFP融合蛋白表達水平Fig.9 Comparing the expression levels of NFATc3T-GFP by SDS-PAGE.M: protein molecular weight marker.1:GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNA; 2: GS115/pNFATc3T-GFP.

為了進一步驗證不同載體共表達稀少基因的畢赤酵母表達體系可以提高含連續(xù)稀有密碼子CCG外源基因的表達，以含有多個連續(xù)脯氨酸稀有密碼子CCG的NFATc3T基因為例，構(gòu)建融合基因NFATc3T-GFP表達菌株GS115/pNFATc3TGFP/ptRNA和GS115/pNFATc3T-GFP。實驗結(jié)果表明，通過不同載體共表達NFATc3T-GFP融合蛋白的表達水平可提高21.3%。此結(jié)果進一步驗證了共表達稀少基因?qū)μ岣吆B續(xù)稀有密碼子CCG外源基因表達量的有效性。

在動植物中，基因上游出現(xiàn)連續(xù)多個畢赤酵母稀有密碼子的情況是較為常見的，例如本文中表達的活化T細胞核因子NFATc3T基因 (含連續(xù)CCG)、菊科植物糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1基因 (含連續(xù)CGG)、擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白SUC1編碼基因(含連續(xù)GCG) 等。這些基因在畢赤酵母中進行外源表達時，連續(xù)的稀有密碼子極易導(dǎo)致表達過程的提前終止。文中在畢赤酵母細胞中初步建立了提高外源基因表達的稀有tRNA共表達系統(tǒng)，并驗證了其有效性，通過該策略可有效改善畢赤酵母表達過程中由于連續(xù)稀有密碼子存在導(dǎo)致的表達提前終止現(xiàn)象。

與目前普遍采用的密碼子優(yōu)化后進行全基因合成的方法相比，文中提供的策略在實驗周期和成本方面具有一定優(yōu)勢，可作為一種備選和補充方案。同時，本策略更適用于除基因合成外的各種功能基因的高通量篩選工作，理論上可有效提高功能基因表達的成功率，進而擴大篩選庫的容量，提高篩選目的基因的成功率。

同時，在部分表達系統(tǒng)中，共表達多個優(yōu)化的稀少tRNA提高了宿主總體mRNA的翻譯效率，提高了部分已經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因的表達和分泌量[18]。目前畢赤酵母中是否同樣會出現(xiàn)這種情況還有待研究。

將含有稀有密碼子的目的基因與對應(yīng)tRNA共表達以提高表達量的策略在原核表達系統(tǒng)中有較多報道，例如前文提到的Stratagene等[13]的大腸桿菌CodonPlus菌株、Novagen等[14]的大腸桿菌Rosetta菌株、以及Finger等[18]報道的巨大芽孢桿菌等，均是通過共表達多個經(jīng)優(yōu)化后的稀少tRNA，最終顯著提高了目的蛋白表達量。本研究完成了在畢赤酵母表達系統(tǒng)中目的基因與稀少tRNA共表達的初步探索，為下一步工作提供了研究基礎(chǔ)，經(jīng)不斷優(yōu)化稀少tRNA的種類和數(shù)量，將會達到更為理想的效果，極具研究潛力和開發(fā)前景。

4 結(jié)論

本研究通過同一載體和不同載體兩種共表達方式，構(gòu)建了畢赤酵母稀少tRNA基因與外源基因共表達體系。得到一種適用于含連續(xù)稀有密碼子CCG的基因與基因共表達的畢赤酵母表達體系，提高了外源基因表達量，從而為提高外源基因表達量提供新的思路。該方法不局限于含連續(xù)稀有密碼子CCG的外源基因與稀少基因共表達，還可給其他含連續(xù)稀有密碼子的外源基因與其相對應(yīng)的稀少tRNA基因在畢赤酵母中共表達提供方法。

從基因工程的角度改變tRNA豐度能夠影響畢赤酵母基因表達水平，對于完善畢赤酵母表達系統(tǒng)和提高外源基因的表達量都具有十分重要的意義。