可用于二氧化碳捕獲過程的微生物碳酸酐酶的挖掘與改造

蔡麗希，楚云猛，張光亞

華僑大學 化工學院 生物工程與技術(shù)系，福建 廈門 361021

自工業(yè)革命以來，人類主要依賴應用煤炭、石油與天然氣等化石燃料，導致大氣中CO2的濃度急劇上升，加重地球表面的溫室效應，引起全球氣候變暖，海平面不斷上升和病蟲害增多等現(xiàn)象[1-3]?；鹆Πl(fā)電是目前最大的人為CO2排放源[4]。到2014年為止，全球火力發(fā)電比例仍然占了總供電量的66.7%，而且短期內(nèi)這一比重并不會有所變化。在這樣一個高度依賴化石燃料發(fā)電模式的大環(huán)境下，碳捕獲和封存技術(shù) (Carbon capture and storage，CCS) 在近些年來一直是碳減排等研究領(lǐng)域中的一個備受關(guān)注的熱點問題[2,5-6]。

碳捕獲和封存技術(shù)指的是將CO2從火力發(fā)電廠、鋼鐵廠、化工廠等排放源頭分離出來，輸送到封存地點并與大氣長期隔絕的過程。主要分為捕集、運輸、封存和監(jiān)測四部分[7]。燃燒前CO2捕集技術(shù) (PCC)，特別是化學胺法捕集CO2技術(shù)是目前公認的最適合于捕集火電廠煙氣中CO2的手段。CO2捕集一般常見于堿性溶液的吸收和隨后的高溫解吸塔解吸并壓縮和封存，然而此過程面臨一些技術(shù)挑戰(zhàn)，首要問題是CO2解吸過程中高熱能的損失[8]?？煞律V化CO2的碳酸酐酶具有解決熱能損失的潛力，嗜熱又耐堿的碳酸酐酶可以加速CO2在高溫化學吸收劑的吸收速率，并催化CO2轉(zhuǎn)化為HCO3-，最終模擬地質(zhì)學過程并生物礦化形成CaCO3沉淀，其終產(chǎn)物在整個地質(zhì)學周期內(nèi)性質(zhì)非常穩(wěn)定，對環(huán)境友好，因此利用碳酸酐酶的生物礦化CO2法是目前最具前景的CO2減少排放技術(shù)手段之一[9]。本文先簡要介紹了碳酸酐酶，再從碳酸酐酶的挖掘、改造及固定化3個方面綜述了國內(nèi)外最新研究進展。

1 碳酸酐酶簡介

碳酸酐酶(Carbonic anhydrases，CA，EC4.2.1.1)是一類能高效催化二氧化碳與水和碳酸與氫質(zhì)子之間的可逆反應的鋅金屬酶，pH值介于4–9之間，且在溫度低于65 ℃的條件下可以保持較高的活性和穩(wěn)定性[10]。它是1933年由Meldrum和Roughton從牛紅細胞中發(fā)現(xiàn)的第一個鋅金屬酶。在人類和動物的血液中，碳酸酐酶是紅細胞中含量與功能重要性僅次于血紅蛋白的最主要的蛋白質(zhì)組分。碳酸酐酶是目前為止反應速率最快的幾種酶之一，它的反應速率受到底物的擴散速率限制。不同家族的碳酸酐酶的催化速率為104–106/s[11]。CA在真核生物體中幾乎是無所不在的，主要在生物體內(nèi)起二氧化碳濃縮、光合作用、離子交換、呼吸作用以及pH穩(wěn)定等作用。

到目前為止，已發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶有α、β、γ、δ、ζ、η等6個不同家族，每個家族之間的氨基酸序列無明顯同源性，是趨同進化的典型代表[7]。六大家族的碳酸酐酶的特點見表1，α-CA常見于哺乳動物、原生動物、藻類、植物、細菌、真菌、古菌的胞漿中，所有動物來源的碳酸酐酶都出自α-CA，是現(xiàn)今研究最透徹的家族，人體中含有分布于多種器官中的α-碳酸酐酶，其中催化活性最高且研究最為透徹的為人碳酸酐酶Ⅱ(hCAⅡ)；β-CA首先發(fā)現(xiàn)在高等植物的葉綠體中，隨后又在細菌、真菌、藻類、古菌中找到，在植物光合作用中，主要起 CO2固定及維持CO2濃度等作用；γ-CA則主要存在于一些細菌和古菌中；δ-CA 與ζ-CA主要存在于海洋的硅藻中；η-CA是近年來才發(fā)現(xiàn)的類型，主要存在于瘧原蟲中。這六大家族的酶結(jié)構(gòu)雖然相似度不高，但每種酶的活性中心都會結(jié)合一個對催化過程起著重要作用的金屬離子。其中加快CO2水合的核心機理就是金屬離子對CO2的親核攻擊[9]。

碳酸酐酶生物礦化本質(zhì)是催化Ca2+與水中的CO2之間發(fā)生的反應[7]。反應歷程可以用如下方程式描述：

1) 氣態(tài)的CO2溶于水，形成松散的水化CO2狀態(tài)：

2) 在堿性條件下，CO2與水反應生成H2CO3：

3) H2CO3電離為質(zhì)子和 HCO3-：

4) 在堿性條件下，HCO3-進一步電離形成CO32-和H2O：

5) 在Ca2+存在的情況下，生成CaCO3沉淀：

該反應的限速步驟為第2步CO2與水反應生成H2CO3。在自然界，CO2的水合反應速率相當緩慢[16-17]，其轉(zhuǎn)化數(shù)僅為1.3×10–1/s[18]，當碳酸酐酶催化上述反應時，CO2水合轉(zhuǎn)化數(shù)顯著提高至1.4×107/s，約是自然界的107倍。但CA礦化過程中極度依賴反應液pH值，當pH<8時，反應2中CA活性明顯降低，培養(yǎng)液中無機碳主要以CO2形式存在[19]。當pH>8時，由于反應液中含有OH-，反應2速率加快，HCO3-與CO32-不斷生成促成CaCO3沉淀。

因此，微生物在仿生生成碳酸鹽的過程中需要在堿性條件下進行，碳酸酐酶在pH值大于8的情況下才能保持較高的活性。而火電廠排出的煙氣溫度較高，接近60 ℃，一般的碳酸酐酶在高熱與高堿下穩(wěn)定性與活力較差，這極大地限制了碳酸酐酶的應用。有3種方法解決這個問題：1)從極端微生物(環(huán)境)中篩選出能夠在溫度高于50 ℃且pH>8條件下穩(wěn)定發(fā)揮功能的碳酸酐酶；2) 使用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造現(xiàn)有酶，使它變成熱、堿穩(wěn)定性酶[20]，3) 通過固定化技術(shù)提高酶穩(wěn)定性及增加重復使用性，降低成本。

2 微生物來源的嗜熱、耐堿碳酸酐酶

近年來，極端微生物來源的碳酸酐酶因其獨特的優(yōu)勢引起了廣泛關(guān)注。極端微生物主要來源于深海、上下對流層、火山、礦井等極端環(huán)境，地球上的極端環(huán)境孕育了豐富的極端微生生物資源，這成為嗜熱耐堿碳酸酐酶的重要來源。目前文獻報道的已篩選到的嗜熱、耐堿碳酸酐酶及其酶學性質(zhì)見表2。其中幾個比較有趣的碳酸酐酶描述如下。

表1 六大家族碳酸酐酶的性質(zhì)與特點Table 1 Properties and characteristics of the six classes of carbonic anhydrases

2012年分離自美國黃石公園溫泉的Sulfurihydrogenibium yellowstonenseYO3AOP1的碳酸酐酶 (SspCA) 是熱穩(wěn)定性最高的幾種酶之一[21]，以CO2為底物時，當溫度為20 ℃、pH為7.5時，酶的動力學參數(shù)為kcat=9.35×105/s;kcat/Km=1.1×108/((mol/L)·s)，同時SspCA具有酯酶活性，最適pH為9.6，最適溫度為95 ℃[22]。酶的熱穩(wěn)定性實驗表明SspCA在40 ℃與70 ℃的半衰期分別為53 d與8 d。SspCA的晶體結(jié)構(gòu)顯示了該酶高熱穩(wěn)定性的機理，如圖1A所示，SspCA具有α-CA典型的二聚體結(jié)構(gòu)，每個單體含有一個三角錐活性中心，由Zn2+與His89、His91、His108組成畸變四面體，其中使二氧化碳水化的機理核心便是Zn2+對于CO2的親核攻擊。乙磺酰唑胺 (AZM) 為活性中心共價結(jié)合的抵制劑。SspCA組成一個具有大界面區(qū)域特征的二聚體。主要由周圍環(huán)繞著α-螺旋和小β-折疊的10個平行的β-折疊組成，活性中心位于從蛋白質(zhì)表面至中心的一個圓錐體腔里，其蛋白質(zhì)表面含有較多的帶電氨基酸，形成一個較復雜的離子網(wǎng)絡，這就是為什么相比與其他常溫CA其熱穩(wěn)定性更高的原因。

從來自亞速爾群島溫泉極端微生物Sulfurihydrogenibium azorense中分離的碳酸酐酶(SazCA)是世界上現(xiàn)今為止催化活力最高的，它是典型的α-CA。以CO2為底物時，在20 ℃、pH為7.5條件下，酶動力學參數(shù)分別為kcat=4.40×106/s–1；kcat/Km=3.5×108/((mol/L)·s)，最適pH為9.6，可以在0–100 ℃范圍內(nèi)保持活力。陰離子抑制實驗表明HCO3-、CO32-、SO42-均對酶無明顯的抑制作用。SazCA既嗜熱又耐堿，酶活力又高，若能進一步提高其熱穩(wěn)定性，將是一個極具潛力的可應用于工業(yè)CO2捕集的碳酸酐酶[22-23]。

2015年，Simone課題組[38]揭示了SazCA的晶體結(jié)構(gòu)，豐富了來自極端微生物的α-CA的結(jié)構(gòu)信息。如圖1B所示，SazCA的單體結(jié)構(gòu)主要是由10個平行的β-折疊組成，周圍環(huán)繞著3個α-螺旋、310-螺旋和小β-折疊。由Cys24與Cys178所組成的二硫鍵在不同來源的α-CA中相對保守。SazCA與SspCA的結(jié)構(gòu)具有61.3%的相似度，SspCA上的Glu2和Gln207殘基被SazCA的His2和His207取代，這種取代可能影響了His64的pKa值進而增強其質(zhì)子穿梭能力，這些結(jié)構(gòu)信息為設(shè)計高催化活性的α-CA提供了誘人的前景。

Littlechild課題組報道了一個現(xiàn)今催化活性居第二的碳酸酐酶(TaCA)，該酶源于Thermovibrio ammonificans，熱穩(wěn)定性較高[24]。當溫度為25 ℃、pH為7.5時，酶的動力學參數(shù)為kcat=1.6×106s–1；kcat/Km=1.6×/((mol/L)·s)，TaCA在40 ℃與60 ℃的半衰期分別為152 d與77 d。而且在保溫60 d后，酶在40 ℃與60 ℃的殘余活性分別為91%與62%。與其他α-CA不同，TaCA具有特殊的四聚體結(jié)構(gòu)，由2個與SspCA和SazCA結(jié)構(gòu)相似的二聚體以二硫鍵連接形成，值得提及的是，形成分子間二硫鍵的2個保守的Cys殘基Cys202和Cys47在SspCA和SazCA中未出現(xiàn)，四聚體結(jié)構(gòu)可能是其保持高熱穩(wěn)定性的原因[24]。分析這些熱穩(wěn)定性CA的結(jié)構(gòu)，一方面可以了解它們高熱穩(wěn)定性的分子機理，同時也為碳酸酐酶的改造提供了重要信息和方向。

上述基于微生物培養(yǎng)篩選的嗜熱、耐堿的碳酸酐酶取得了長足進步，但從環(huán)境樣品中 (宏基因組) 獲取該酶的研究非常匱乏。最近，本課題組從幾個深海熱液口樣品的宏基因組中篩選到16個疑似碳酸酐酶的基因，序列比對結(jié)果顯示，其中1個與目前數(shù)據(jù)庫中實驗驗證的碳酸酐酶相似度為46.9%，可能是一些新的嗜熱碳酸酐酶并命名為VaCA。通過在線服務器SWISS-MODEL以Streptococcus mutans(PDBID：3LAS) 為模板同源建模，發(fā)現(xiàn)VaCA是一個相比TaCA結(jié)構(gòu)較小但相對致密的四聚體結(jié)構(gòu)，每個單體由1個類似右手的5個相互平行的β-折疊組成，周圍環(huán)繞著3個α-螺旋和1個310-螺旋，分子內(nèi)沒有二硫鍵連接。目前正在進行相關(guān)的實驗驗證。從宏基因組中獲取CA將進一步拓展其來源，為挖掘性能更佳的CA提供了可能。

表2 嗜熱、耐堿的微生物碳酸酐酶的特性Table 2 Charactoristic features of the thermostable and alkalible of microbial carbonic anhydraes

圖1 四種典型的極端碳酸酐酶的四級結(jié)構(gòu) (藍色為鋅離子，紅色為抑制劑AZM)。(A) SspCA的二聚體結(jié)構(gòu)，一個單體以黃色表示，另一個單體以綠色表示。(B) SazCA的二聚體結(jié)構(gòu)。(C) TaCA的四聚體結(jié)構(gòu)，四個單體分別以洋紅色、綠色、藍綠色和黃色表示。(D) VaCA的四聚體結(jié)構(gòu)。Fig.1 The four typical quaternary structure of carbonic anhydrase.The zinc ion display in blue, and the inhibitor AZM are also shown in red.(A) The dimer structure of SspCA with one monomer shown in yellow, the other one in green.(B) The dimer structure of SazCA.(C) The tetramer structure of TaCA with four monomers shown in magenta, green,cyan and yellow respectively.(D)The tetramer structure of VaCA with four monomers.

3 蛋白質(zhì)工程技術(shù)

盡管目前已經(jīng)從自然界篩選到了大量的新型碳酸酐酶，但仍不能有效地滿足環(huán)境應用與工業(yè)化生產(chǎn)中的迫切需求。蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，讓研究者可以按照預期來調(diào)整并設(shè)計蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[39]。蛋白質(zhì)工程大致可分為定向進化和理性設(shè)計兩大類。定向進化無需事先了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，在實驗室條件下模擬自然進化過程，通過隨機突變和定向篩選獲得更加適應環(huán)境壓力的新的蛋白質(zhì)[40-41]。Newman等[42]通過定向進化技術(shù)獲得的碳酸酐酶突變體在工業(yè)條件下的CO2捕獲能力提高了25倍，熱穩(wěn)定性提高了1000萬倍，突變體可在50 ℃、4.2 mol/L濃度下的N-甲基-二烷酰胺 (MDEA) 下保持穩(wěn)定，在75 ℃ 和4.2 mol/L MDEA 下半衰期為 20 h。這種策略可用來獲得嗜熱又耐堿的碳酸酐酶的高效催化酶。Alvizo等[43]對來自Deulfovibrio vuglaris中的β-CA進行定向進化來增加熱穩(wěn)定性，經(jīng)過10輪的突變與篩選獲得的碳酸酐酶可耐受107 ℃、pH大于10.0和4.2 mol/L濃度下MDEA等嚴苛環(huán)境，熱穩(wěn)定性與堿耐受性相比野生型酶提高了400萬倍，同時CO2水合酶的能力也提高了24倍。這個熱穩(wěn)定性CA可以在高溫 (87 ℃) 下用于CO2的生物礦化。Protelica 公司啟動使用定向進化改造的碳酸酐酶用于碳捕獲與封存這個項目(http://www.protelica.com/Carbonicanhydrase)，旨在挖掘可耐受嚴苛的工業(yè)環(huán)境下的嗜熱耐堿型碳酸酐酶。

理性設(shè)計基于己知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的機理，并應用它們對突變位點進行設(shè)計，最終獲得的突變體具有所預期的功能[44]。有研究者把常溫CA改造成嗜熱嗜堿型酶并獲得成功。美國專利[45](專利號:7521217)調(diào)整人碳酸酐酶Ⅱ(hCAⅡ)分子表面的氨基酸，分別使Ala65、Phe93、Gln136、Lys153、Leu198、Ala247各自突變成Thr、Leu、His/Tyr、Asn、Met和Thr。使酶突變?yōu)闃O端嗜熱酶，能在90 ℃穩(wěn)定保持活性24 h。二氧化碳解決方案公司 (CO2Solutions Inc.) 將這個嗜熱型碳酸酐酶投放至洗滌器的預分離高溫煙氣中，其CO2吸收率是以往技術(shù)的40倍 (http://www.CO2solutions.com/en/the-process)。Fisher等[46]在保證人碳酸酐酶Ⅱ (hCAⅡ) 原有的高酶活性和溶解性的情況下突變遠離活性中心的表面氨基酸，將分子表面的氨基酸Tyr7、Leu224、Leu100、Leu240、Asn67和Asn62各自突變?yōu)镻he、Ser、His、Pro、Glu和Leu。使疏水性氨基酸突變成親水性氨基酸來增加熱穩(wěn)定性，突變體融解溫度上升 6 ℃。Kanth等[18]將Persephonella marinaEX-H1的碳酸酐酶 (PmCA) 的信號肽去除后在大腸桿菌表達，獲得的無信號肽的同源二聚體PmCA (sp–) 其堿耐受性增強，熱穩(wěn)定性也大幅提高，在100 ℃中其半衰期為88 min，融解溫度為84.5 ℃。Luca等[47]以現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)催化活性很高的碳酸酐酶SazCA為模本，在其N端引入熱穩(wěn)定性最高的SspCA中所獨有的6個His，準備設(shè)計1個超級碳酸酐酶SupCA。然而，SupCA的催化活性與熱穩(wěn)定性比原有兩種酶均低，這可能是由于過多His的引入破壞了活性中心周圍的氫鍵網(wǎng)絡，SupCA的設(shè)想雖然失敗，但也為后繼酶設(shè)計提供一定的參考。Jo等[25]利用來源于淋病奈瑟氏菌Neisseria gonorrhoeae中的NgCA開展全細菌細胞催化分析，從E.coli中篩選，全細胞催化在低pH下穩(wěn)定，即使在pH值小于HCO3-與CO32-的pKa下，全細胞催化系統(tǒng)可以有效地礦化CO2。因此，可以降低用于維持高pH值的費用。應用以上策略調(diào)整CA的結(jié)構(gòu)可以有效地捕獲CO2，但是改造成功并獲得應用的例子較少。

在蛋白質(zhì)工程改造探索過程中，也有研究者們從不同角度與層次分別對CA的熱穩(wěn)定性機制進行了頗有價值的研究和探索。文中通過對現(xiàn)有研究結(jié)果進行總結(jié)和分析，得出以下可能因素：1) 二硫鍵可穩(wěn)定CA的結(jié)構(gòu)，降低解旋狀態(tài)下CA的構(gòu)象熵以維持其熱穩(wěn)定性[57]。二硫鍵能夠維持CA的熱穩(wěn)定性機制已通過實驗獲得驗證，如Jo等[48]在NgCA中成功引入二硫鍵后，使得該酶的融解溫度較引入二硫鍵之前提高了7.8 ℃，熱穩(wěn)定性也得到相應的提高。2) CA熱穩(wěn)定性主要取決于其分子構(gòu)象的剛性程度，生物信息學揭示酶的剛性越強其熱穩(wěn)定性越強，而在CA表面的連接α-螺旋與β-折疊的loop圈具有很大的柔性，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可以通過添加脯氨酸殘基提高表面loop圈的剛性，或者通過減少loop圈的方式來增強蛋白質(zhì)的表面致密性，因此，Boone等[49]用脯氨酸取代hCAⅡ表面loop圈的Glu234，設(shè)計出新穎的hCAⅡ突變體，熱穩(wěn)定性分析表明該突變體的融解溫度相比野生型提高了3 ℃。另一方面，包含230–240個氨基酸殘基的區(qū)域形成了一個舒展的loop圈，具有特殊的熱不穩(wěn)定特征。刪除后其熱穩(wěn)定性增高，這一影響因素在熱穩(wěn)定性高的SspCA中得到了進一步的支持。其蛋白質(zhì)的表面致密性較高，且無此loop圈。這一發(fā)現(xiàn)對改善野生型酶的融解溫度具有一定的指導意義。3)溫度B因子 (B-factor) 的影響，B-factor是理性改造酶熱穩(wěn)定性的一個重要指標，氨基酸的B-factor值越大，它的柔性就越大，不利于CA的熱穩(wěn)定性，因此Jo等[48]利用從頭設(shè)計的方法在NgCA中計算出溫度B因子 (B-factor) 與氨基酸殘基對柔韌度大于25的3對氨基酸殘基，各自突變成3對Cys，成功引入二硫鍵并形成3個突變體，其中1個突變體的熱動力學與熱穩(wěn)定性都大幅增強，這可能歸功于B-factor與二硫鍵的引入。

4 碳酸酐酶的固定化

除了通過篩選和改造獲得嗜熱、耐堿的碳酸酐酶外，對CA進行固定化也可以一定程度上達到上述目的。而且，游離酶在強酸堿、高溫、高壓、有機溶劑等條件下易失活，且由于直徑過小(接近于50 ?)，很難從吸收塔中回收，其工業(yè)化應用被大大地限制了。但固定化技術(shù)不僅有利于酶穩(wěn)定性的提高，也有助于酶的分離，且固定化酶具有不溶性和一定的機械強度，可循環(huán)應用于反應器中[50-51]。

近年來，采用固定化CA 仿生法來捕集 CO2的技術(shù)成為了研究熱點，國內(nèi)外眾多學者對固定化材料、固定化酶的制備方法和CO2的礦化效率展開了研究，為常溫CA在工業(yè)上的應用提供了更具潛力的方法[52]。Prabhu等[53]將來源于短小芽孢桿菌Bacillus pumilus常溫CA吸附在殼聚糖的表面，固定化酶對熱和抑制劑作用的穩(wěn)定性均有所提高，在50 ℃同等條件保溫90 d后，固定化酶可保持60%的初始酶活，而游離酶只有30%，同時在5 min內(nèi)CaCO3沉淀生成速率是游離酶的2倍。Ozdemir等[54]將來源于牛的碳酸酐酶 (BCA)固定在聚氨酯 (PU) 泡沫上，固定化酶相比游離酶的動力學參數(shù)有所下降，Km由12.2 mmol/L下降至9.6 mmol/L，但固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯增強，在反應器中連續(xù)工作7個循環(huán)后或在室溫貯存45 d后，還可保持100%的酶活性，而游離酶即使在4 ℃貯存45 d后完全失活。Vinoba等[55]將BCA固定到經(jīng)化學處理的磁性微球上，該固定化酶在反應器工作30個循環(huán)后，其CO2捕獲能力是游離酶的26倍。且固定化酶在室溫貯存30 d后，仍能保持82% 的初始酶活性。Yadav等[56]將BCA包埋于3種不同粒徑海藻酸鈉微球上，結(jié)果顯示：粒徑最小的微球上酶活性最高，相比游離酶，固定化酶熱穩(wěn)定性顯著增強，其最適溫度提高了近10 ℃，固定化酶在工作42 d后仍能保持67%的初始酶活。Capasso等[57]將SspCA固定在聚氨酯(PU) 泡沫上，其熱穩(wěn)定大大增強，可以在100 ℃下存活48 h，在70 ℃下長期工作，并可用于火電廠高溫捕獲CO2的反應器中。酶在載體上的固定化往往會讓酶發(fā)生一定程度的構(gòu)象變化，與底物的接觸效率降低，促使催化活性降低?？茖W家發(fā)現(xiàn)納米顆粒可以克服以上問題。Shanbhag等[58]將BCA溶解于自組裝肽P114中形成50–200 nm的納米顆粒，粒徑越小，酶越不容易發(fā)生構(gòu)象變化，該固定化酶可保持98%水化酶活性，并在低溫 ((22±2) ℃) 和高溫 (50 ℃) 下保持自組裝狀態(tài)。近年來，基于R5介導的二氧化硅納米球的仿生制備原理，國內(nèi)外學者做了二氧化硅為基質(zhì)的酶自固定化研 究[59]。Jo等[60]成功地將R5和目標酶基因融合，經(jīng)表達和純化后，由 R5介導的二氧化硅納米球自固定化酶，固定化后的碳酸酐酶可在50 ℃貯存5 d后仍保持80%的活性，且在60 ℃時酶活性是25 ℃的11倍，這有利于應用于后繼工業(yè)化生產(chǎn)。

我們課題組將CA和類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides，ELPs) 融合表達，借助ELPs自分離技術(shù)經(jīng)離心純化目標酶，通過ELPs獨特的仿生硅化能力，在形成二氧化硅粒子的同時實現(xiàn)CA的自固定化，固定化酶的最適溫度較游離酶提高了10 ℃，可達80 ℃，其熱穩(wěn)定性大幅提高，但酶催化效率略有下降，酶活回收率為64.9%，固定化過程工藝參數(shù)仍有較大的優(yōu)化空間。制備的固定化碳酸酐酶在酶濃度達到9 mg/mL時，封裝率達到91%，在4 ℃放置72 h后，泄漏的酶蛋白僅為0.96%。由于ELPs介導的仿生硅化現(xiàn)象尚未見報道，其介導仿生硅化的分子機制及所得載體對酶活性影響規(guī)律仍有待深入，本課題組也將會持續(xù)探究。

5 展望

綜上所述，在CO2濃度居高不下、全球溫室效應加劇，但各項碳捕集技術(shù)尚不完善且成本較高的今天，碳酸酐酶作為一種新型的高效生物催化劑應用于CCS的前景格外引人注目。而極端微生物的挖掘、蛋白質(zhì)工程技術(shù)和酶固定化技術(shù)的發(fā)展又恰恰為碳酸酐酶的工業(yè)化應用提供了誘人的前景。然而，當前大數(shù)據(jù)顯示地球極端生境中還存在大量的CA基因等著被發(fā)現(xiàn)。這些大多是不可培養(yǎng)的微生物。宏基因組學與生物信息學工具在基因識別方面具備獨特能力，一旦識別出新型的CA編碼基因，就容易在不同的微生物宿主中克隆并表達，從而研究它們的性質(zhì)及在二氧化碳生物礦化中的潛在用途。目前，尚未發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)很多，甚至有可能存在目前發(fā)現(xiàn)的6個家族之外的新的CA。與此同時，碳酸酐酶固定化可實現(xiàn)其重復利用，提高了操作穩(wěn)定性，降低了運行成本。但是傳統(tǒng)的固定化方法往往會導致酶活力降低或催化性能的下降。因此，拓展搜尋碳酸酐酶的范圍，改良蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)，研發(fā)廉價、高效的固定化方法仍是后續(xù)研究的重點，這些技術(shù)和方法的創(chuàng)新將為減輕溫室效應、延緩全球變暖這一迫切需解決的問題提供新思路。