銅綠假單胞菌MexXY外排泵調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

鞠曉紅 王月華 孫艷美

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 132013)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)廣泛存在于自然環(huán)境，是引起醫(yī)院感染的重要條件致病菌，在免疫功能低下人群具有高感染性和高致死率特點(diǎn)。當(dāng)生存環(huán)境發(fā)生改變，菌細(xì)胞為了維持自身平衡并在劣勢(shì)環(huán)境中獲得生存，許多正常條件下不表達(dá)或低表達(dá)基因被誘導(dǎo)性高表達(dá)，對(duì)抗環(huán)境壓力。其中，耐藥性變異是細(xì)菌最主要的生存手段。在銅綠假單胞菌眾多耐藥機(jī)制的研究中，RND家族的重要地位日益凸顯，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[1-3]。作為RND家族重要成員之一的MexXY外排泵，由于兼具組成性和誘導(dǎo)性表達(dá)雙重性，在銅綠假單胞菌天然耐藥和獲得性耐藥中均發(fā)揮重要作用。本文在簡(jiǎn)要介紹銅綠假單胞菌RND外排泵系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對(duì)近年來(lái)有關(guān)MexXY表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展做一綜述，以期為抗假單胞菌藥物研制提供新靶點(diǎn)、為耐藥逆轉(zhuǎn)提供新思路。

1 銅綠假單胞菌RND外排泵系統(tǒng)簡(jiǎn)介

外排泵系統(tǒng)(efflux pump system)又稱藥物主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(active drug efflux)系統(tǒng)，由細(xì)菌染色體編碼，在革蘭陰性菌中普遍存在。根據(jù)超分子結(jié)構(gòu)及序列同源性將外排泵分為5大家族，即RND家族、主要易化超家族(major facilitator superfamily, MFS)、多藥和毒性化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion, MATE)家族，小多重耐藥家族(small multidrug resistance, SMR)和ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette, ABC)家族。目前，銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的外排泵均屬于RND家族，介導(dǎo)天然耐藥和(或)獲得性耐藥，是其多重耐藥和泛耐藥的物質(zhì)基礎(chǔ)。功能性RND外排泵以跨膜的三聚體形式轉(zhuǎn)運(yùn)底物(圖1)，即位于細(xì)胞膜的RND轉(zhuǎn)運(yùn)子、位于周漿間隙的膜融合蛋白(membrane fusion protein, MFP)和位于外膜的通道蛋白(outer membrane protein, OMP)3部分組成，三聚體鑲嵌在細(xì)胞的內(nèi)外膜上形成外排孔道，減少有害物質(zhì)在菌體內(nèi)積聚。目前已命名的銅綠假單胞菌RND外排泵有12種，分別是MexAB-OprM、MexCDOprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJKOprM、MexVW-OprM、MexGHI-OpmD、MexMNOprM、MexPQ-OpmE、MuxABC-OpmB、TriABCOpmH和CzcCBA，前4種在臨床耐藥菌株中高表達(dá)最為常見(jiàn)[4-6]。其中，MexAB-OprM和MexXY-OprM在野生株中組成性低表達(dá)，誘導(dǎo)后高表達(dá)；MexCD-OprJ和MexEF-OprN屬于誘導(dǎo)性表達(dá)。

4種臨床常見(jiàn)高表達(dá)外排泵中，MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexXY-OprM屬于負(fù)調(diào)節(jié)表達(dá)，分別受負(fù)調(diào)控蛋白MexR、NfxB和MexZ的調(diào)控，編碼基因位于相應(yīng)外排泵編碼區(qū)上游，均與外排泵轉(zhuǎn)錄方向相反。MexEF-OprN屬于正調(diào)節(jié)表達(dá)，受正調(diào)節(jié)蛋白MexT調(diào)控，編碼基因亦位于外排泵上游，但與之轉(zhuǎn)錄方向一致。除此之外，RND外排泵還受到其他調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)節(jié)，如群體感應(yīng)系統(tǒng)、雙組分系統(tǒng)以及生存環(huán)境等。由于MexXY利用MexAB系統(tǒng)的外膜蛋白OprM，故MexAB-OprM表達(dá)下調(diào)影響MexXY系統(tǒng)的表達(dá)水平，而MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN之間表達(dá)存在逆向關(guān)系，暗示RND外排系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其嚴(yán)謹(jǐn)精密，各成員之間存在著極為復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)。目前有關(guān)各外排泵之間調(diào)節(jié)表達(dá)相關(guān)性的研究較少，有待于進(jìn)一步深入探討，明確各成員之間的協(xié)同或拮抗關(guān)系及調(diào)控機(jī)制，為耐藥控制提供思路。

圖1 銅綠假單胞菌RND外排泵結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of RND effulx pump structure of Pseudomonas aeruginosa

2 MexXY外排泵結(jié)構(gòu)與功能

MexXY外排泵發(fā)現(xiàn)于1999年，由mexXY操縱子編碼，在野生株中低水平組成性表達(dá)，暴露于核糖體靶向藥物后被誘導(dǎo)高表達(dá)[7]。mexXY操縱子全長(zhǎng)5461bp，有2個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading framework,ORF)：mexX(1170bp)和mexY(3141bp)，分別編碼膜融合蛋白MexX和RND轉(zhuǎn)運(yùn)子MexY。由圖1可知，MexY位于細(xì)菌細(xì)胞膜上，由跨膜區(qū)域和突出周質(zhì)區(qū)域兩部分組成，利用質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力為能量，識(shí)別并結(jié)合外排底物，決定外排底物的特異性；MexX位于菌細(xì)胞的周漿間隙，在形成功能性外排泵的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，誘導(dǎo)或穩(wěn)定外膜蛋白的開(kāi)放狀態(tài)，同時(shí)包圍在MexY外面，形成一個(gè)跨越整個(gè)周質(zhì)通道的穩(wěn)定復(fù)合物，將MexY識(shí)別的藥物直接排出細(xì)胞外。MexX包含389個(gè)氨基酸殘基，分子量約41KD，MexY包含1046個(gè)氨基酸殘基，分子量約113KD。mexXY操縱子缺乏編碼通道蛋白的基因，雖可利用OpmB、OpmG、OpmI等作為外膜蛋白，但最主要利用的是MexAB-OprM外排泵組成性表達(dá)的OprM，組成功能性MexXY-OprM三聚體，MexAB-OprM表達(dá)下調(diào)可降低MexXY外排泵表達(dá)水平。在PA7分支，mexXY操縱子有第3個(gè)ORF，編碼OprM樣蛋白OprA作為外膜通道蛋白，組成MexXY-OprA三聚體，OprA與伯克霍爾德菌屬外排泵外膜蛋白高度同源[8]。

MexXY外排泵最主要的功能是通過(guò)外排胞內(nèi)藥物介導(dǎo)銅綠假單胞菌天然和獲得性耐藥，穩(wěn)定高表達(dá)MexXY菌株對(duì)所有底物藥物耐藥性升高2～16倍。核糖體靶位藥物(如四環(huán)素、慶大霉素、紅霉素等)是誘導(dǎo)MexXY高表達(dá)的特異底物，外排氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、氯霉素、替加環(huán)素和兩性離子型頭孢菌素(頭孢吡肟、頭孢吡普)等抗菌藥物。其中氨基糖苷類是MexXY專一的特異底物， 在MexY周質(zhì)連接槽(periplasm-linked cleft)有其識(shí)別區(qū)，是氨基糖苷類耐藥決定子[9-10]。MexXY還可作為MexAB-OprM的補(bǔ)償機(jī)制協(xié)同外排氟喹諾酮類藥物，導(dǎo)致該類藥物耐藥水平升高。高氧環(huán)境亦可誘導(dǎo)MexXY表達(dá)上調(diào)，囊性肺纖維化(CF)患者分離菌株穩(wěn)定高表達(dá)MexXY，可能是細(xì)菌在局部活性氧富集環(huán)境下的應(yīng)激反應(yīng)[11-12]。由此推測(cè)，MexXY可能在細(xì)菌的抗氧化保護(hù)中亦發(fā)揮重要作用。

3 MexXY外排泵的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制

MexXY外排泵表達(dá)受基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的復(fù)雜調(diào)控，任一環(huán)節(jié)突變都可能導(dǎo)致MexXY高表達(dá)。目前已鑒定的MexXY高產(chǎn)突變株有3型，分別是agrZ、agrW1和agrW2突變型[13]。agrZ型是負(fù)調(diào)控基因mexZ自身突變，導(dǎo)致基因失活或編碼蛋白改變；agrW1型是各種原因?qū)е碌暮颂求w缺陷，通過(guò)PA5471通路解除MexZ蛋白的阻遏作用，本質(zhì)上是對(duì)核糖體損傷的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)；agrW2型與雙組分系統(tǒng)ParRS突變有關(guān)。最近，Lau等[14]發(fā)現(xiàn)一條新的調(diào)控途徑-AmgRS雙組分系統(tǒng)，不依賴上述已知的調(diào)節(jié)基因，說(shuō)明MexXY的表達(dá)調(diào)控可能還涉及更多的未知因素，在局部或全局水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

3.1 MexZ通路

MexZ蛋白是負(fù)調(diào)控基因mexZ的編碼產(chǎn)物，屬于TetR超家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，包含178個(gè)氨基酸殘基，分子量約19KD，N端有典型的DNA結(jié)合域，即高度保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序，強(qiáng)效抑制mexXY轉(zhuǎn)錄。編碼基因mexZ位于mexXY操縱子上游，是mexXY的轉(zhuǎn)錄抑制子。無(wú)誘導(dǎo)因素存在時(shí)，MexZ以同源二聚體形式結(jié)合在mexX上游的mexZ～mexX間隔區(qū)域DNA上，結(jié)合位點(diǎn)是mexX翻譯起始點(diǎn)上游-104～66bp之間的20bp回文序列，mexXY啟動(dòng)子所在區(qū)域[15]。MexZ直接抑制mexXY轉(zhuǎn)錄或通過(guò)阻斷RNA聚合酶進(jìn)入啟動(dòng)子結(jié)合點(diǎn)阻遏mexXY操縱子轉(zhuǎn)錄。各種原因誘導(dǎo)mexZ變異、MexZ結(jié)合DNA能力下降或mexZ～mexX間隔區(qū)DNA突變，均可解除MexZ的抑制，暴露mexXY啟動(dòng)子DNA，轉(zhuǎn)錄翻譯MexXY。耐藥菌株mexZ測(cè)序結(jié)果顯示[16]，57.9%菌株存在變異，以移碼突變?yōu)橹?87.9%)，其中19.3%發(fā)生錯(cuò)義突變，主要位于二聚體功能區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)，46位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸(G46V)菌株MexZ結(jié)合DNA能力完全喪失。抗菌藥物不能通過(guò)直接作用于mexZ，抑制MexZ表達(dá)或干擾MexZ與間隔區(qū)mexXY啟動(dòng)子DNA結(jié)合誘導(dǎo)MexXY高表達(dá)，而是通過(guò)蛋白-蛋白的相互作用間接對(duì)抗MexZ的阻遏作用上調(diào)MexXY表達(dá)，這一過(guò)程的關(guān)鍵蛋白是ArmZ，由PA5471基因編碼[15,17]。藥物或活性氧濃度升高可提高mexZ突變率，CF患者高表達(dá)MexXY的主要原因是mexZ突變，可能是在肺部活性氧富集的特殊環(huán)境下促進(jìn)mexZ趨同進(jìn)化(convergent evolution)的結(jié)果[18]。

3.2 PA5471通路

PA5471又稱為armZ基因，長(zhǎng)度1140bp，編碼抗阻遏蛋白ArmZ。ArmZ直接與阻遏蛋白MexZ結(jié)合，將其從mexXY啟動(dòng)子DNA上解離，下游mexXY基因去阻遏后大量表達(dá)。PA5471基因本身受核糖體功能調(diào)節(jié)，核糖體障礙是誘導(dǎo)ArmZ表達(dá)的關(guān)鍵因素。目前已知能引起核糖體機(jī)能障礙的因素除核糖體靶向藥物外，還有參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯的基因發(fā)生突變，如編碼50S核糖體蛋白L21、L27的rplU-rpmA操縱子突變；全局調(diào)控基因suhB(PA3818)突變、參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的fmt和folD突變等均可通過(guò)PA5471解除阻遏，上調(diào)MexXY表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)菌多重耐藥或泛耐藥[19-20]。PA5471缺失菌株MexXY表達(dá)顯著降低，對(duì)絕大多數(shù)底物藥物敏感。各種機(jī)制導(dǎo)致的核糖體結(jié)構(gòu)或功能異常主要通過(guò)影響PA5471.1mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)控PA5471轉(zhuǎn)錄和翻譯，解除MexZ對(duì)mexXY的抑制，清除核糖體損傷因素。

PA5471.1位于PA5471與PA5472之間367bp的間隔序列中，在PA5472下游114～155bp處，啟動(dòng)子距離PA54723'端20bp，編碼一個(gè)含13個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)肽(leader peptide)，是PA5471的翻譯弱化子[21]。細(xì)菌生活在不存在核糖體受損因素環(huán)境時(shí)，轉(zhuǎn)錄的PA5471.1mRNA與鄰近區(qū)域形成1～2區(qū)配對(duì)、3～4區(qū)配對(duì)的兩個(gè)莖-環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)，配對(duì)的4區(qū)在靠近PA5471翻譯起始位點(diǎn)形成富含尿嘧啶的轉(zhuǎn)錄終止子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制(transcriptional attenuation mechanism)阻止PA5471轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細(xì)菌處于氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等核糖體靶向藥物環(huán)境或其他損傷核糖體的環(huán)境時(shí)，由于蛋白質(zhì)合成功能受損、異常多肽出現(xiàn)，菌體正在合成新生肽鏈的核糖體停止活動(dòng)，前導(dǎo)肽翻譯受阻，大量核糖體與tRNA、前導(dǎo)肽等結(jié)合成復(fù)合物停滯在PA5471.1的mRNA上，即通過(guò)核糖體?？?ribosome stalling)機(jī)制，改變前導(dǎo)肽mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，阻礙1～2區(qū)配對(duì)形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，游離的2區(qū)與3區(qū)配對(duì)形成反終止子(antiiterminator)，3～4區(qū)解離，轉(zhuǎn)錄終止子無(wú)法形成，對(duì)下游PA5471轉(zhuǎn)錄的抑制作用解除，PA5471轉(zhuǎn)錄翻譯挽救停靠的核糖體，實(shí)質(zhì)是細(xì)菌啟動(dòng)的核糖體保護(hù)機(jī)制(ribosome protection mechanisms)。大量翻譯的ArmZ蛋白與阻遏蛋白MexZ結(jié)合，mexXY啟動(dòng)子暴露，RNA聚合酶進(jìn)入啟動(dòng)子位點(diǎn)，下游mexXY轉(zhuǎn)錄、翻譯，高表達(dá)MexXY外排泵。

3.3 ParRS通路

ParRS雙組分系統(tǒng)由位于同一操縱子的parR(PA1799)和parS基因(PA1798)編碼反應(yīng)器蛋白ParR和傳感器激酶ParS。Fernández等[22]在研究銅綠假單胞菌多黏菌素耐藥機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，多黏菌素可以不依賴MexZ和PA5471，通過(guò)激活雙組分系統(tǒng)ParRS獨(dú)立上調(diào)mexXY表達(dá)介導(dǎo)獲得性耐藥。雖然多黏菌素并非MexXY的特異底物，但多黏菌素耐藥菌株mexXYmRNA表達(dá)水平明顯上升[23]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[24]，ParRS變異菌株mexZ、PA5471基因序列及mRNA表達(dá)水平均未見(jiàn)改變；敲除ParRS變異株的PA5471、mexZ基因，mexY表達(dá)水平僅升高2倍，耐藥水平也未見(jiàn)明顯變化，mexY的表達(dá)水平和耐藥性變化明顯低于ParRS未變異PA5471、mexZ基因敲除菌株。上述結(jié)果說(shuō)明，ParRS變異株MexXY高表達(dá)與已知的mexXY調(diào)控因子PA5471和mexZ無(wú)關(guān)，存在獨(dú)立的調(diào)節(jié)通路。變異株測(cè)序結(jié)果顯示，ParS蛋白L50P、A138T、R185G、A215T、A324V變異后組成性激活ParRS，上調(diào)mexXY表達(dá)，除A138T外均發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物菌株[25]。

研究認(rèn)為[22]，ParRS活化具有環(huán)境誘導(dǎo)性，陽(yáng)離子抗菌肽是ParRS活化的強(qiáng)誘導(dǎo)劑。銅綠假單胞菌一旦在環(huán)境中檢測(cè)到特定信號(hào)，如多黏菌素，ParS傳遞信號(hào)激活ParR，活化的ParR主要作用是激活脂多糖修飾操縱子(lipopolysaccharide, LPS)arnBCADTEF-ugd基因、下調(diào)孔蛋白OprD和上調(diào)外排泵mexXY表達(dá)，通過(guò)改變藥物靶位、降低膜通透性和主動(dòng)外排抵抗藥效、降低胞內(nèi)毒性物質(zhì)累積，介導(dǎo)對(duì)多黏菌素、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等藥物的多重耐藥。在沒(méi)有多黏菌素環(huán)境下，ParRS變異株mexXY轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化；敲除未接觸多黏菌素野生株的parRS基因，細(xì)菌耐藥性及mexY也無(wú)改變；動(dòng)物來(lái)源銅綠假單胞菌耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OprD表達(dá)下調(diào)的ParS變異菌株mexYmRNA水平顯著上升(升高9.44～72.57倍)[24]。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)，ParRS誘導(dǎo)mexXY高表達(dá)的目的并非針對(duì)MexXY的底物，可能只是細(xì)菌抵抗多黏菌素的伴隨結(jié)果，在對(duì)靶位的修飾或下調(diào)孔蛋白的過(guò)程中碰巧影響了與mexY表達(dá)有關(guān)的某個(gè)基因或蛋白。關(guān)于ParRS激活mexXY啟動(dòng)子的機(jī)制尚不清楚，ParRS與眾多的上下游調(diào)節(jié)基因和蛋白相關(guān)，是否通過(guò)其中的某一種或幾種基因發(fā)揮作用，目前均不可知，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

3.4 AmgRS通路

AmgRS是銅綠假單胞菌中普遍存在的包膜壓力應(yīng)激調(diào)節(jié)雙組分系統(tǒng)，功能類似于大腸埃希菌的CpxRA，是對(duì)氨基糖苷類等藥物作用后產(chǎn)生異常多肽造成細(xì)胞膜損傷的一種適應(yīng)性反應(yīng)[14]。在amgR基因缺失菌株，慶大霉素對(duì)菌細(xì)胞膜的損傷明顯加重[26]。PA5471基因缺失菌株AmgS出現(xiàn)錯(cuò)義突變(V121G)可3倍上調(diào)mexXY表達(dá)水平，說(shuō)明AmgRS是不依賴ArmZ上調(diào)mexXY表達(dá)的又一通路。氨基糖苷類藥物暴露和amgS變異是激活A(yù)mgRS的主要途徑，活化的AmgRS通過(guò)增強(qiáng)MexXY表達(dá)外排藥物減輕因異常多肽插入細(xì)胞膜造成的菌體損傷。RNA聚合酶抑制劑利福平存在時(shí)，氨基糖苷類藥物巴龍霉素的活性明顯增強(qiáng)(MIC下降8倍)，推測(cè)可能是利福平干擾蛋白質(zhì)合成的同時(shí)抑制了巴龍霉素誘導(dǎo)的異常多肽合成，包膜壓力應(yīng)激反應(yīng)未啟動(dòng)的結(jié)果。非氨基糖苷類藥物不能通過(guò)AmgRS途徑誘導(dǎo)mexXY表達(dá)，主要依賴ArmZ蛋白的抗阻遏作用，MexXY表達(dá)不受amgS、amgR影響。

AmgRS可能通過(guò)htpX、yccA、PA55283個(gè)靶基因間接調(diào)控mexXY的表達(dá)，三者是雙組分系統(tǒng)介導(dǎo)氨基糖苷類固有耐藥的主要因素[27]。htpX和yccA分別編碼大腸埃希菌胞漿膜相關(guān)蛋白酶和FtsH蛋白酶調(diào)節(jié)子的同源物，負(fù)責(zé)膜質(zhì)量監(jiān)控；PA5528編碼一種功能未知的膜相關(guān)蛋白。慶大霉素誘導(dǎo)后，amgR 陽(yáng)性菌株htpX和PA5528表達(dá)水平升高2～3倍，amgR陰性菌株未見(jiàn)變化，推測(cè)AmgRS介導(dǎo)的mexXY表達(dá)可能依靠靶基因編碼的蛋白酶完成。在對(duì)amgRS、htpX、yccA和PA5528基因影響巴龍霉素耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)[28]，amgR敲除菌株MIC下降8倍；htpX和PA5528單獨(dú)缺失菌株MIC分別上升和下降2倍，yccA單獨(dú)缺失MIC不受影響；htpX-PA5528雙缺失菌株MIC升高2倍，htpX-yccA或yccA-PA5528雙缺失MIC均下降4倍；三者同時(shí)缺失MIC下降32倍。據(jù)此證實(shí)，amgR通過(guò)3個(gè)靶基因介導(dǎo)耐藥，而三者在結(jié)構(gòu)、作用底物或編碼產(chǎn)物等方面必然有相同之處，能部分功能互補(bǔ)，完成AmgRS依賴的MexXY表達(dá)調(diào)控。另外，3個(gè)靶基因同時(shí)缺失與amgR敲除株相比，藥物敏感性上升了4倍，說(shuō)明可能存在amgR之外的調(diào)節(jié)因素，也可能氨基糖苷類藥物本身能影響其中的某個(gè)或某幾個(gè)基因表達(dá)，單獨(dú)存在時(shí)介導(dǎo)低水平耐藥。htpX敲除菌株P(guān)A5528表達(dá)上調(diào)，而PA5528敲除菌株htpX基因無(wú)明顯變化，說(shuō)明二者可能部分共享調(diào)節(jié)基因。

AmgRS調(diào)控MexXY表達(dá)的本質(zhì)是對(duì)異常蛋白干擾膜正常結(jié)構(gòu)的應(yīng)激反應(yīng)。氨基糖苷類藥物作用核糖體后出現(xiàn)翻譯錯(cuò)誤，產(chǎn)生的異常多肽插入細(xì)胞膜，膜功能異常激活包膜應(yīng)激反應(yīng)AmgRS雙組分系統(tǒng)，AmgS、AmgR依次激活，啟動(dòng)靶基因htpX、yccA、PA5528轉(zhuǎn)錄，翻譯的活性蛋白酶降解插入細(xì)胞膜的異常多肽減輕菌細(xì)胞膜損傷，同時(shí)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物可能是mexXY的底物或誘導(dǎo)劑，上調(diào)其高表達(dá)外排藥物。不造成膜損傷的氨基糖苷類不能啟動(dòng)AmgRS，主要依賴PA5471途徑上調(diào)MexXY。

綜上所述，MexXY外排泵高表達(dá)本質(zhì)上是細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力的一種自我保護(hù)措施。目前已知誘導(dǎo)MexXY高表達(dá)的因素有3個(gè)(圖2)：一是局部調(diào)節(jié)基因mexZ突變；二是核糖體結(jié)構(gòu)或功能障礙；三是細(xì)菌胞膜受損。各種原因?qū)е碌暮颂求w功能障礙主要依賴PA5471途徑調(diào)控，通過(guò)核糖體?？扛淖兦皩?dǎo)肽mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，解除對(duì)下游PA5471的轉(zhuǎn)錄抑制。胞膜受損因機(jī)制不同啟動(dòng)路徑亦有差異，異常多肽插入引起的膜損傷激活A(yù)mgSR通路；多黏菌素造成的胞膜破壞啟動(dòng)ParRS通路，但機(jī)制不清。最近有研究顯示[29]，鈣離子濃度升高mexXYmRNA表達(dá)上調(diào)，推測(cè)可能與鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，具體機(jī)制有待研究。

圖2 銅綠假單胞菌MexXY外排泵表達(dá)調(diào)控機(jī)制Fig.2 Regulation mechanism of MexXY ef flux pump expression of Pseudomonas aeruginosa

4 問(wèn)題與展望

MexXY外排泵的表達(dá)調(diào)控涉及眾多基因和蛋白，共同組成了一個(gè)復(fù)雜、多水平的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在生存環(huán)境存在不利因素時(shí)，通過(guò)某些基因的激活和失活清除有害物質(zhì)、維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。目前關(guān)于MexXY表達(dá)調(diào)控研究得較為清楚的是PA5471通路，新發(fā)現(xiàn)的AmgRS和ParRS雙組分系統(tǒng)誘導(dǎo)MexXY表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，尤其是ParRS系統(tǒng)。闡明確切的調(diào)控機(jī)制是相關(guān)抑制劑研發(fā)，逆轉(zhuǎn)耐藥的前提和基礎(chǔ)。ParRS和AmgRS通路的基因調(diào)控、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中各調(diào)節(jié)基因?qū)ζ渌鸕ND外排泵的影響以及有效外排泵抑制劑的篩選是未來(lái)研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。