雷帕霉素生物合成及其分子調(diào)控的研究進(jìn)展

田進(jìn)忠 姜衛(wèi)紅 蘆銀華

(1 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所，上海 200032；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

雷帕霉素是由雷帕鏈霉菌(之前被稱(chēng)為Streptomyces hygroscopicusATCC29253或NRRL5491)、伊氏鏈霉菌和游動(dòng)放線菌N902-109等放線菌菌株產(chǎn)生的31元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，生物活性非常多樣，具有抗真菌、免疫抑制、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和抗衰老等多種功效[1-2]。目前，雷帕霉素及其衍生物臨床上主要用作免疫抑制劑及抗腫瘤藥物。它生物活性的多樣性極大激發(fā)了科研工作者對(duì)其分子靶點(diǎn)及其作用機(jī)制的研究興趣。研究證實(shí)，雷帕霉素首先結(jié)合于胞內(nèi)受體FKBP12(FK506-binding protein 12)，形成FKBP12-雷帕霉素復(fù)合體，然后再與mTOR(mammalian target of rapamycin, 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)的FRB結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而抑制mTOR與下游靶蛋白之間的相互作用[3]。mTOR的靶蛋白往往參與細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過(guò)程，這是雷帕霉素呈現(xiàn)廣泛生物學(xué)活性的原因所在。

雷帕霉素分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，難以化學(xué)合成，主要依賴(lài)于放線菌的發(fā)酵法生產(chǎn)。為實(shí)現(xiàn)雷帕霉素的高效生物合成，許多科研工作者對(duì)其生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究，目前其生物合成過(guò)程已被清楚解析[4-8]。首先，聚酮合酶(PKS)加載起始單元，即莽草酸途徑來(lái)源的DHCHC[(4R,5R)-4,5-dihydroxycyclohex-1-ene-carboxylic acid][5]；然后，通過(guò)14步反應(yīng)依次加載7分子丙二酰輔酶A和7分子甲基丙二酰輔酶A，縮合形成聚酮鏈；接著，在非核糖體肽合成酶(NPRS)RapP的作用下，將L-派可酸與聚酮鏈縮合成環(huán)，生成雷帕霉素大環(huán)內(nèi)酯母核；最后，經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素氧化酶P450的氧化、甲基轉(zhuǎn)移酶的甲基化等一系列后修飾過(guò)程，形成雷帕霉素[4-10]。另外，在雷帕霉素生物合成的分子調(diào)控研究方面也取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，對(duì)其生物合成基因簇內(nèi)部的5個(gè)調(diào)控基因進(jìn)行了功能鑒定，并對(duì)其可能的調(diào)控機(jī)制開(kāi)展了初步研究[11-12]。這些研究成果為運(yùn)用基因工程或代謝工程手段進(jìn)行雷帕霉素高產(chǎn)菌株的分子育種奠定了良好的基礎(chǔ)。

本文將重點(diǎn)介紹雷帕霉素生物合成基因簇、生物合成途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究方面的最新研究進(jìn)展，并將就該重要抗生素產(chǎn)品的發(fā)現(xiàn)及其類(lèi)似物的功能、高產(chǎn)菌株育種等方面的研究進(jìn)行簡(jiǎn)要回顧，同時(shí)，也對(duì)未來(lái)雷帕霉素高產(chǎn)菌株的分子育種以及新型類(lèi)似物的開(kāi)發(fā)進(jìn)行了展望。

1 雷帕霉素及其衍生物的發(fā)現(xiàn)與功能

1964年，科學(xué)家從雷帕努伊(Rapa Nui，復(fù)活節(jié)島)的土壤樣品中分離得到產(chǎn)生抗真菌活性產(chǎn)物的菌株，并將該活性物質(zhì)以雷帕努伊命名，稱(chēng)為雷帕霉素。1975年，Vézina等[13-15]研究者在Ayerst研究所分離鑒定了雷帕霉素的產(chǎn)生菌，屬于吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus，后被命名為雷帕鏈霉菌)。起初，雷帕霉素顯示出很強(qiáng)的抗人類(lèi)致病性酵母的活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該抗生素及其類(lèi)似物可以抑制多種真菌的生長(zhǎng)，包括新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、念珠菌(Candida stelloidea)和青霉菌(Penicilliumsp.)[16-18]。因此，雷帕霉素作為一種抗真菌劑逐漸走進(jìn)人們的生活。除了抗真菌活性以外，Ayerst研究所科研人員發(fā)現(xiàn)該化合物還具有極強(qiáng)的免疫抑制活性。在大鼠模型中，雷帕霉素可抑制實(shí)驗(yàn)性免疫病(過(guò)敏性腦脊髓炎和佐劑性關(guān)節(jié)炎)的發(fā)展及IgE抗體的形成，從而發(fā)揮其免疫抑制作用；深入研究表明，它是通過(guò)抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答而發(fā)揮免疫抑制功能[19]。隨后，該抗生素作為人類(lèi)器官移植術(shù)后的免疫抑制劑進(jìn)入臨床應(yīng)用。雷帕霉素作為免疫抑制劑具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，比鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑-環(huán)孢菌素A作用強(qiáng)10～100倍[20]。不僅可以有效抑制急性器官移植免疫排斥反應(yīng)，還可以有效抑制FK506和環(huán)孢菌素A不能抑制的慢性器官移植免疫排斥[21-22]，同時(shí)避免了環(huán)孢霉素引發(fā)腫瘤的可能性。另外，如將它和其他免疫抑制劑(如環(huán)孢菌素)聯(lián)合使用，抗免疫排斥效果會(huì)更好，可有效抑制急性腎同種異體移植免疫排斥反應(yīng)，并減少對(duì)腎的毒害[23]。

雷帕霉素及其類(lèi)似物還具有很強(qiáng)的抗惡性腫瘤作用，與癌癥化療藥物聯(lián)合使用，可顯著提高對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力。報(bào)道顯示，與順鉑或紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可以有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[24-25]。在小鼠模型中，使用四甲氧基愈創(chuàng)木酸(tetra-O-methyl nordihydroguaia-retic acid)與雷帕霉素聯(lián)合治療，其存活率顯著提高[26]。如今，研發(fā)的第二代半合成雷帕霉素衍生物(圖1)，如替西羅莫司(Wyeth, 3)和依維莫司(Novartis, 4)，與雷帕霉素相比，具有更有效的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，并且毒性更低。這些衍生物已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)作為治療腎癌和惡性淋巴腫瘤的臨床用藥[27]。隨著對(duì)雷帕霉素研究的深入，發(fā)現(xiàn)它還具有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生等功能。在體外和體內(nèi)神經(jīng)變性模型中，它可以減弱泛素化蛋白聚集和降低神經(jīng)元損傷，這對(duì)于由蛋白的錯(cuò)誤折疊和聚集引起的疾病(如帕金森病)提供了一個(gè)有希望的治療策略[28-29]。雷帕霉素也可以減弱小鼠脊髓損傷后病理性神經(jīng)疼痛的發(fā)展[30]。此外，其半合成衍生物佐他莫司(5)(圖1)可以有效預(yù)防血管萎縮。佐他莫司是四唑環(huán)取代雷帕霉素C-42位的羥基，它被血液緩慢輸送到冠狀血管壁支架周?chē)乐寡芪s變窄，同時(shí)不引起炎癥反應(yīng)[31]。2013年，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)佐他莫司作為穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈支架的藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用。

更有趣的是，雷帕霉素在模式生物酵母、線蟲(chóng)、果蠅和小鼠中都能顯著延長(zhǎng)其壽命。2009年，Harrison等[32]發(fā)現(xiàn)給600天齡(約相當(dāng)于人類(lèi)60歲)的小鼠喂食雷帕霉素可以延長(zhǎng)其壽命，雄鼠和雌鼠均有明顯效果，分別為9%和14%。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)給270天齡的小鼠喂食雷帕霉素，同樣可以顯著提高存活時(shí)間，雄鼠和雌鼠的最大壽命分別延長(zhǎng)16%和13%。

圖1 雷帕霉素及其類(lèi)似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of rapamycin and its rapalogs

2 雷帕霉素生物合成基因簇及其合成途徑

圖2 雷帕霉素生物合成基因簇Fig.2 The map of the rapamycin biosynthetic gene cluster

1995年，Schwecke等[7]利用一段紅霉素生物合成基因簇來(lái)源的聚酮合酶(PKS)序列為探針，從雷帕鏈霉菌基因組文庫(kù)中，篩選得到含有雷帕霉素合成基因簇的文庫(kù)質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序、拼接得到完整的雷帕霉素生物合成基因簇(圖2)?；虼厝L(zhǎng)107.3kb，共有26個(gè)ORF(open reading frame，開(kāi)放閱讀框)(表1)，其中rapK編碼分支酸酶，在起始單位DHCHC的合成過(guò)程中發(fā)揮重要功能；rapA、rapB和rapC編碼3個(gè)I型PKS，rapP編碼非核糖體肽合成酶(NRPS)[33-34]。PKS含有以下模塊化的功能結(jié)構(gòu)域：羧酸連接酶(carboxylic acid ligase, CoL)、烯酰還原酶(enoyl reductase, ER)、β-酮脂酰合成酶(β-ketoacyl synthase, KS)、?；D(zhuǎn)移酶(acyltransferase, AT)、脫水酶(dehydratase, DH)、β-酮脂酰還原酶(β-ketoacyl reductase, KR)和酰基載體蛋白(acyl carrier protein, ACP)。3個(gè)PKS復(fù)合體共含有15個(gè)催化模塊，包括1個(gè)合成起始模塊和14個(gè)延伸模塊，每個(gè)延伸模塊催化1個(gè)延伸單位連接到雷帕霉素的聚酮鏈上(圖3)。RapP催化L-哌可酸和聚酮鏈的成環(huán)反應(yīng)，形成前雷帕霉素(pre-rapamycin)。L-哌可酸由賴(lài)氨酸環(huán)化酶RapL催化L-賴(lài)氨酸形成。最后，在RapIJMNOQ等后修飾酶(主要為甲基轉(zhuǎn)移酶、P450)的催化下，前雷帕霉素第9、16、27、39號(hào)位發(fā)生后修飾，最終生成雷帕霉素(圖3)。RapXWV為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子，可能與雷帕霉素的自身抗性有關(guān)。簇內(nèi)尚有多個(gè)功能未知的基因，包括rapD、rapE、rapF、rapV、rapW、rapU、rapT和rapZ(其預(yù)測(cè)功能見(jiàn)表1)[35]。

表1 雷帕霉素基因簇(來(lái)源于雷帕鏈霉菌)的基因及功能Tab. 1 The rapamycin biosynthetic genes (from S. rapamycinicus)and their functions

雷帕霉素的生物合成途徑可以分為聚酮鏈合成的起始、延伸、環(huán)化和后修飾4步，簡(jiǎn)單描述如下：

2.1 聚酮鏈合成的起始

雷帕霉素合成的起始單元DHCHC來(lái)源于莽草酸途徑。分支酸在RapK的催化下形成DCDC(3,4-dihydroxycycloheax-1,5-diene-1-carboxylic acid)，進(jìn)一步形成DHCHC，但是DCDC是如何轉(zhuǎn)化成DHCHC的，尚有待解析[5,9]。DHCHC在羧酸連接酶的催化下被ATP活化形成AMP-DHCHC二元復(fù)合物，之后轉(zhuǎn)移到活化的ACP上，由此開(kāi)始聚酮鏈延伸。ACP是PKS合酶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，在磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)的催化下從輔酶A獲得磷酸泛酰巰基乙胺基(PPT)從而活化[35]。

分支酸在RapK的催化下合成DCDC，再以DCDC為底物合成雷帕霉素起始單元DHCHC。PKS(RapA、RapB、RapC)催化聚酮鏈的起始和延伸；RapL催化L-派克酸的形成；RapP催化聚酮鏈和L-派克酸的環(huán)化；RapIJMNOQ分別催化相應(yīng)位點(diǎn)的后修飾。

2.2 聚酮鏈的延伸

在RapA、B和C 3個(gè)PKS、14個(gè)延伸模塊的催化作用下，以一定的順序通過(guò)縮合反應(yīng)將7分子的丙二酰輔酶A和7分子的甲基丙二酰輔酶A依次連接到聚酮鏈上。同時(shí)，每個(gè)模塊上不同的功能結(jié)構(gòu)域：ER、KS、AT、DH 、KR等催化相應(yīng)位點(diǎn)的加氫和脫水反應(yīng)(圖3)。模塊3和模塊6上的功能結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是失活的，因?yàn)橄鄬?duì)應(yīng)的羰基沒(méi)有被催化[36]。

2.3 聚酮鏈的環(huán)化

聚酮鏈的環(huán)化是在RapP的催化作用下完成的。RapP將L-哌可酸(L-pipecolic acid)連接到雷帕霉素聚酮鏈上，環(huán)化形成前雷帕霉素[37]。RapP催化反應(yīng)沒(méi)有嚴(yán)格的底物專(zhuān)一性，它也可以催化脯氨酸和雷帕霉素聚酮鏈的環(huán)化形成脯氨酰雷帕霉素[33](圖1)。L-哌可酸來(lái)源于L-賴(lài)氨酸，此反應(yīng)由賴(lài)氨酸環(huán)化酶RapL催化完成[6,8]。

2.4 前雷帕霉素的后修飾

雷帕霉素的生物合成存在復(fù)雜的后修飾過(guò)程，負(fù)責(zé)前雷帕霉素后修飾的基因共有6個(gè)(rapI、rapJ、rapM、rapN、rapO和rapQ)。其中，rapI、rapM與rapQ編碼甲基轉(zhuǎn)移酶；rapJ和rapN編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶；rapO編碼鐵氧還蛋白。Gregory等[35]運(yùn)用基因敲除和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定，推測(cè)了前雷帕霉素后修飾的過(guò)程，按先后順序依次為：a：RapI(O-甲基轉(zhuǎn)移酶)催化39位羥基的甲基化；b：RapJ(P450)催化C9位的加氧反應(yīng)，形成羰基；c：RapM(O-甲基轉(zhuǎn)移酶)催化16位羥基的甲基化；d：最后，RapN(P450)與RapQ(甲基轉(zhuǎn)移酶)分別催化27位C的羥基化及甲基化；其中RapJ和RapN加氧反應(yīng)(C9和C27)需要鐵氧還蛋白R(shí)apO的參與。前雷帕霉素經(jīng)過(guò)以上一系列后修飾，最終形成雷帕霉素(圖3)。C9、C16 與C39位的甲基均來(lái)源于甲硫氨酸。

圖3 雷帕霉素生物合成途徑示意圖Fig.3 Schematic map of the rapamycin biosynthetic pathway

值得一提的是，不同產(chǎn)生菌來(lái)源的雷帕霉素生物合成基因簇存在一定的差異。1995年，日本靜岡縣發(fā)現(xiàn)了一種新的產(chǎn)雷帕霉素的菌株游動(dòng)放線菌(Actinoplanessp. N902-109)，該菌產(chǎn)雷帕霉素的能力是雷帕鏈霉菌的近10倍[38]。最近，對(duì)兩株菌中的雷帕霉素生物合成基因簇序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)PKS基因(rapA、rapB和rapC)和rapP在兩個(gè)基因簇中的分布完全一致，其余基因也高度同源[39]。但參與前體合成和前雷帕霉素后修飾基因的分布位置則明顯不同。有趣的是，游動(dòng)放線菌N902-109來(lái)源的基因簇中不存在負(fù)調(diào)控基因rapS/R和rapY，同時(shí)存在ActrapTH編碼的酯酶II，它可能參與編輯PKS，該酶的作用可能是N902-109雷帕霉素高產(chǎn)的原因所在，但卻不存在于雷帕鏈霉菌來(lái)源的基因簇中。另外，在N902-109中，編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的rapM基因多了一個(gè)拷貝，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存在于雷帕鏈霉菌基因簇的rapQ(編碼甲基轉(zhuǎn)移酶)和rapG的同源基因(圖2)[39]。

3 雷帕霉素生物合成的分子調(diào)控

現(xiàn)有關(guān)于雷帕霉素生物合成的分子調(diào)控均在雷帕鏈霉菌中完成的，通過(guò)分析雷帕鏈霉菌中雷帕霉素的生物合成基因簇序列，5個(gè)ORF被預(yù)測(cè)為調(diào)控基因，包括rapG、rapH、rapS、rapR和rapY(圖2，表1)，研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)诶着撩顾睾铣蛇^(guò)程中發(fā)揮不同的調(diào)控作用[11-12,40]。

在雷帕鏈霉菌NRRL5491中，增加rapG或者rapH基因拷貝數(shù)可以顯著提高雷帕霉素產(chǎn)量；反之，如將基因敲除則導(dǎo)致產(chǎn)量顯著下降，由此證實(shí)它們?cè)诶着撩顾睾铣蛇^(guò)程中發(fā)揮正調(diào)控作用。序列比對(duì)結(jié)果顯示，RapG和RapH分別屬于AraC和LAL家族的調(diào)控因子。RapG含有一個(gè)位于C端的HTH(螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋)，與來(lái)自大腸埃希菌的調(diào)控因子SoxS同源，但缺乏多數(shù)AraC家族調(diào)控蛋白擁有的位于N端的二聚化結(jié)構(gòu)域。RapH含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是位于C末端和N末端的HTH DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。RapH與來(lái)自另一種免疫抑制劑FK506生物合成基因簇的正調(diào)控因子FkbN基因序列顯示出高度的相似性(72%)[43-44]。RapG和RapH作為雷帕霉素合成的正調(diào)控因子，它們協(xié)同調(diào)控著雷帕霉素的生物合成，其中RapG占主導(dǎo)作用，而RapH僅發(fā)揮輔助功能[12]。另外，這2個(gè)正調(diào)控因子的DNA編碼序列中均含有放線菌稀有密碼子TTA，因此，它們的翻譯必須依賴(lài)于bldA(編碼TTA的轉(zhuǎn)運(yùn)tRNA)[12,42-44]。

rapR、rapS和rapY為雷帕霉素生物合成的負(fù)調(diào)控基因[11]。rapR/S編碼一對(duì)雙組分系統(tǒng)(twocomponent system, TCS)，包括應(yīng)答調(diào)控蛋白R(shí)apR和組氨酸蛋白激酶RapS，它們與變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)來(lái)源的TCS CutR-CutS和天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的TCS AfsQ1-AfsQ2具有較高同源性[45-46]。rapY編碼屬于TetR家族的調(diào)控蛋白R(shí)apY，是抗生素外排抑制子，它含有一個(gè)位于N末端的HTH DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與來(lái)源于放線紫紅素(actinorhodin)合成基因簇的actII以及特曲霉素(tetracenomycin)合成基因簇的tcmR同源性較高[11]。3個(gè)負(fù)調(diào)控基因的分別過(guò)表達(dá)均導(dǎo)致雷帕霉素產(chǎn)量的顯著下調(diào)，而將rapS或rapY缺失可以大幅提高雷帕霉素的發(fā)酵產(chǎn)量(分別提高4.6與3.7倍)。由于RapS與RapR是一對(duì)雙組分系統(tǒng)，可以斷定RapS的功能是通過(guò)其匹配的應(yīng)答調(diào)控蛋白R(shí)apR來(lái)實(shí)現(xiàn)的。轉(zhuǎn)錄分析表明，RapS/R對(duì)rapY的轉(zhuǎn)錄行使抑制功能，而RapY則負(fù)調(diào)控rapX的轉(zhuǎn)錄。rapX編碼一種ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它可能通過(guò)外排雷帕霉素進(jìn)而防止產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞本身的毒害作用。另外，在rapS缺失的菌株里過(guò)表達(dá)rapX，可以進(jìn)一步提高雷帕霉素的產(chǎn)量，與原始株產(chǎn)量相比，提高幅度達(dá)6.7倍[11]。

綜上，我們可以看到，關(guān)于雷帕霉素生物合成的分子調(diào)控均停留在基因簇內(nèi)分布的調(diào)控因子，而對(duì)于基因簇外調(diào)控因子參與雷帕霉素生物合成的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。但考慮到基因簇外調(diào)控因子往往行使多效性或全局性調(diào)控功能，而且在不同鏈霉菌中相對(duì)比較保守，因此，來(lái)源其他鏈霉菌的全局性調(diào)控因子的研究信息可以應(yīng)用到雷帕鏈霉菌的代謝工程分子改造中，或許會(huì)取得不錯(cuò)的改造效果。

4 優(yōu)化雷帕霉素發(fā)酵水平的策略

表2 不同碳源、氮源對(duì)雷帕霉素產(chǎn)量的影響Tab. 2 Effects of different carbon and nitrogen sources on rapamycin production

在雷帕霉素發(fā)酵研究初期，研究者在培養(yǎng)基優(yōu)化方面開(kāi)展了大量工作，為雷帕霉素的產(chǎn)量提升做出了很大貢獻(xiàn)，這些工作主要是由Arnold Demain博士的研究團(tuán)隊(duì)[47]完成的。他們測(cè)試了35種不同碳源(包括多糖、單糖、寡糖以及有機(jī)酸)對(duì)雷帕霉素產(chǎn)量的影響，結(jié)果顯示，纖維二糖、果糖、半乳糖、肌醇、甘露糖、甘露醇和木糖均可導(dǎo)致其產(chǎn)量的增加(表2)。同樣測(cè)試了氨基酸作為氮源對(duì)產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)和雷帕霉素產(chǎn)量提升的效果(表2)，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基里添加天冬氨酸、精氨酸和組氨酸的氨基酸組合對(duì)菌種生長(zhǎng)以及雷帕霉素的產(chǎn)量提升效果顯著[48]。在以上培養(yǎng)基條件下，L-賴(lài)氨酸的添加將能夠大幅提高產(chǎn)量(提高1.5倍)，產(chǎn)量達(dá)到134mg/L，這可能是因?yàn)長(zhǎng)-賴(lài)氨酸的添加可以增加雷帕霉素合成的前體物質(zhì)L-哌可酸所致。而甲硫氨酸和苯丙氨酸則抑制它的生物合成。推測(cè)甲硫氨酸可能抑制雷帕霉素生物合成相關(guān)的O-甲基轉(zhuǎn)移酶和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶的活性，從而降低雷帕霉素的產(chǎn)量[49]；而苯丙氨酸抑制雷帕霉素合成的機(jī)制還沒(méi)有得到解析。Cheng等[50]還測(cè)試了磷酸鹽、銨鹽、鎂與鐵離子對(duì)雷帕霉素合成的影響，他們發(fā)現(xiàn)磷酸鹽(K2HPO4)、銨(NH4Cl)、鎂(MgSO4·7H2O)會(huì)抑制它的生物合成；相反，濃度為100mg/L(0.36mmol/L)的FeSO4(高于雷帕鏈霉菌生長(zhǎng)所需的二價(jià)鐵濃度)卻能刺激了雷帕霉素的合成。為了更系統(tǒng)地優(yōu)化培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分，Sinha等[51]利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)方法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法，通過(guò)在發(fā)酵的不同時(shí)段添加營(yíng)養(yǎng)成分，響應(yīng)雷帕霉素合成的代謝需求，將其產(chǎn)量提高到320.89mg/L。

雷帕霉素發(fā)酵產(chǎn)量低，一個(gè)核心的問(wèn)題是缺少優(yōu)良的菌種。因此，開(kāi)展高產(chǎn)菌株的育種研究是必需的。傳統(tǒng)的育種方法是主要使用理化誘變策略，如紫外線(UV)照射和亞硝基胍(NTG)誘變等，通過(guò)大批量篩選獲得雷帕霉素高產(chǎn)菌株。例如，Baby Rani等[52]將吸水鏈霉菌進(jìn)行NTG誘變，經(jīng)過(guò)篩選獲得一株產(chǎn)量達(dá)210mg/L的突變菌株MTCC5681，相對(duì)于原始菌株(45mg/L)，產(chǎn)量提高了5倍。在此基礎(chǔ)上，他們還做了發(fā)酵條件的優(yōu)化，突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)量又提高了1.6倍，達(dá)到了360mg/L。Cheng等[53]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)慶大霉素處理雷帕霉素產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體，可以有效獲得高產(chǎn)菌株。在該研究中，他們篩選到一株高產(chǎn)突變體C14-1，它的產(chǎn)量比出發(fā)菌株高60%；結(jié)合NTG誘變處理，獲得另一株突變體C14-2，其產(chǎn)量進(jìn)一步提高到195mg/L，比親本菌株增加124%。另外，理化誘變結(jié)合原生質(zhì)體融合技術(shù)也被應(yīng)用于雷帕霉素高產(chǎn)菌株的育種研究中。Chen等[54]運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)，在通過(guò)種內(nèi)原生質(zhì)體融合和種間原生質(zhì)體融合獲得7株相對(duì)高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，再經(jīng)過(guò)一輪Genome shuffling結(jié)合高通量篩選手段，從33216個(gè)菌株中篩選到1株雷帕霉素產(chǎn)量高達(dá)445mg/L的突變菌株GS-1437。Xu等[55]通過(guò)96孔微量滴定板篩選了7000個(gè)菌株，其中一株高產(chǎn)菌株的雷帕霉素產(chǎn)量達(dá)420mg/L。

在過(guò)去幾年中，也有通過(guò)基因工程或代謝工程手段以提高雷帕霉素發(fā)酵產(chǎn)量的研究報(bào)道，但相對(duì)較少。例如，Huang等[56]在吸水鏈霉菌TYQ0915中異源整合表達(dá)了來(lái)自阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的LAL家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aveR，可以使雷帕霉素的發(fā)酵產(chǎn)量提高了2倍，達(dá)到1.5mg/g；Geng等[57]通過(guò)在ATCC29253中敲除pfk(6-phosphofructokinase基因)同時(shí)過(guò)表達(dá)dahP(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase基因)和rapK，使雷帕霉素產(chǎn)量提升了142.3%，達(dá)到250.8mg/L。Jung等[58]以吸水鏈霉菌ATCC29253為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變得到突變體UV2-2，并在UV2-2中過(guò)表達(dá)pcc(propionyl-CoA carboxylase基因)的同時(shí)添加丙酸，可使雷帕霉素的產(chǎn)量達(dá)到42.8mg/L；但是，過(guò)表達(dá)甲基丙二酰-CoA變位酶(methylmalonyl-CoA mutase)和甲基丙二酰-CoA連接酶(methylmalonyl-CoA ligase)效果不顯著。

發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也顯著影響雷帕霉素的發(fā)酵產(chǎn)量[59-60]。最近研究顯示，提供純氧和低攪拌速率可以避免對(duì)鏈霉菌顆粒的剪切，在這種條件下雷帕霉素產(chǎn)量最高可達(dá)到780mg/L[59]。此外，一項(xiàng)研究評(píng)估了吸水鏈霉菌MTCC4003雷帕霉素生產(chǎn)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，這項(xiàng)研究在最佳的發(fā)酵條件下(300r/min攪拌速率和1vvm發(fā)酵罐中的通氣速率)使用可靠的數(shù)學(xué)模型(其參數(shù)包括最大比生長(zhǎng)速率、飽和常數(shù)、抑制常數(shù)和生長(zhǎng)產(chǎn)量系數(shù))，最終在2.2L生物反應(yīng)器中得到1316mg/L的雷帕霉素，這是在文獻(xiàn)報(bào)道的分批發(fā)酵中獲得的最高雷帕霉素產(chǎn)量[64]。

5 總結(jié)與展望

雷帕霉素問(wèn)世已50年有余，從作為抗真菌劑被發(fā)現(xiàn)，逐漸成為用量低、藥效高、低毒性的免疫抑制劑，如今人們正在發(fā)掘它在神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤和抗衰老方面的功能。由于它的多重功效，尤其是作為抗癌藥物，有理由相信未來(lái)對(duì)它的需求量將逐年上升。鑒于雷帕霉素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不適合化學(xué)合成，將來(lái)仍將依賴(lài)于發(fā)酵生產(chǎn)，因此迫切需要研發(fā)優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。雖然運(yùn)用傳統(tǒng)理化誘變育種技術(shù)結(jié)合發(fā)酵工藝優(yōu)化提升了雷帕霉素的發(fā)酵水平，但是這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著其生物合成途徑得到全面解析以及雷帕霉素產(chǎn)生菌遺傳操作體系的不斷完善[61]，為我們發(fā)展基于代謝工程理念的分子育種提供了可能。雷帕霉素的合成亦受到復(fù)雜的調(diào)控，這也是工業(yè)生產(chǎn)菌種發(fā)酵單位偏低的原因之一。但是，對(duì)于這方面的研究還很薄弱，深入開(kāi)展雷帕霉素生物合成的分子調(diào)控研究，解析其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將為生產(chǎn)菌種的改造提供重要的理論指導(dǎo)。

另外，生物信息學(xué)分析顯示，雷帕鏈霉菌基因組上存在多達(dá)52個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇[62]。多種產(chǎn)物(尤其是同一類(lèi)型的次級(jí)代謝產(chǎn)物)在生物合成過(guò)程中會(huì)互相競(jìng)爭(zhēng)前體、輔因子、能量和還原力，勢(shì)必會(huì)削弱目標(biāo)產(chǎn)物的合成。因此，敲除競(jìng)爭(zhēng)性產(chǎn)物的合成途徑是有效提高目標(biāo)產(chǎn)物合成效率的策略之一[63-64]。最近，作者所在實(shí)驗(yàn)室發(fā)展了基于CRISPR/Cas9和Cpf1的基因組編輯技術(shù)，可以快速、高效地進(jìn)行基因簇的缺失或中斷[65]，這些方法的建立為通過(guò)阻斷競(jìng)爭(zhēng)途徑構(gòu)建雷帕霉素高產(chǎn)菌株提供了便利。

基因簇多拷貝擴(kuò)增現(xiàn)象廣泛存在于經(jīng)傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)獲得的抗生素高產(chǎn)菌株基因組中，如青霉素(penicillin)、卡那霉素(kanamycin)、林可霉素(lincomycin)的高產(chǎn)菌株[66-68]。受到這種發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)，已成功開(kāi)發(fā)了基于基因簇多拷貝擴(kuò)增技術(shù)的分子育種技術(shù)，顯著提高了放線紫紅素(actinorhodin)和井岡霉素(validamycin)的發(fā)酵產(chǎn)量(分別提高20倍和0.34倍)[69-70]。此外，核糖體工程(ribosome engineering)已被證明是提高鏈霉菌中次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的有效手段。例如，在天藍(lán)色鏈霉菌中依次引入鏈霉素、慶大霉素和利福平三重抗性，突變體的抗生素產(chǎn)量是出發(fā)菌株的48倍[75]。因此，可以嘗試使用核糖體工程和基因簇多拷貝擴(kuò)增等策略來(lái)提高雷帕霉素的發(fā)酵水平。

最近，科研工作者在雷帕霉素的結(jié)構(gòu)改造研究方面也取得了較大的進(jìn)展。Barrie等[36]開(kāi)發(fā)了一種新的組合合成方法：使用聚酮合酶基因的一段序列(約2kb)，通過(guò)模塊間的隨機(jī)同源重組，生成一系列新的模塊丟失或擴(kuò)增的聚酮合酶基因，從而一次性拿到多種母核縮短或延伸的雷帕霉素類(lèi)似物。如需開(kāi)發(fā)更加高效快速的組合生物合成方法，則還要對(duì)PKS的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入解析，構(gòu)效關(guān)系的闡明將為新型雷帕霉素類(lèi)似物的挖掘提供極大的便利。

隨著技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)雷帕霉素認(rèn)知的不斷積累，關(guān)于雷帕霉素的研究不會(huì)終止在這里，希望未來(lái)能開(kāi)發(fā)出更加先進(jìn)的技術(shù)用于雷帕霉素類(lèi)似物的發(fā)現(xiàn)，使其具有更好的功能和更精確的靶向性。同時(shí)，也可用于構(gòu)建更高產(chǎn)的雷帕霉素生產(chǎn)菌株。近年來(lái)，隨著系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)和代謝工程的快速發(fā)展，為提高雷帕霉素的生物合成效率以及開(kāi)發(fā)雷帕霉素類(lèi)似物提供了更多的途徑。