受體色譜：中藥靶向活性成分高效篩選技術(shù)＊

劉嘉君，賈曉妮,2，王 靜，曾凱竹，李 倩，趙新鋒＊＊

（1.西北大學(xué)藥學(xué)院 西安 710069；2.西安市精神衛(wèi)所中心 西安 710100）

中醫(yī)藥是我國(guó)的民族特色和寶貴財(cái)富，為防治重大疾病做出了重要貢獻(xiàn)。作為中醫(yī)臨床主要用藥形式，中藥復(fù)方具有組成復(fù)雜、辯證靈活、化學(xué)成分多樣及作用機(jī)理復(fù)雜等特點(diǎn)[1]，使得其活性成分篩選發(fā)展成為復(fù)雜性科學(xué)問題。目前，中藥活性成分篩選方法主要包括整體動(dòng)物模型、細(xì)胞模型、酶和受體模型、基因芯片、傳統(tǒng)生物色譜和計(jì)算機(jī)模擬等技術(shù)。上述方法為中藥活性成分篩選做出了重要貢獻(xiàn)，但在篩選速度、特異性和效率等方面尚需進(jìn)一步的工作[2]。因此，中藥活性成分篩選依然是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，迫切需要在理論、原理和方法方面進(jìn)行突破，推動(dòng)以中藥為源泉的創(chuàng)新藥物研發(fā)進(jìn)程。

1 受體色譜的內(nèi)涵及外延

1.1 受體色譜概念

眾所周知，G-蛋白偶聯(lián)受體為人體內(nèi)最大一類細(xì)胞膜受體，介導(dǎo)多種重要生理功能，是藥物發(fā)揮藥效的主要靶點(diǎn)。藥物進(jìn)入體內(nèi)后與受體通過親和作用形成穩(wěn)定復(fù)合物，啟動(dòng)下游級(jí)聯(lián)式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮藥效。針對(duì)傳統(tǒng)中藥活性成分篩選方法在藥物活性成分篩選方面周期長(zhǎng)、準(zhǔn)確率低和后期臨床研究風(fēng)險(xiǎn)大等問題，筆者課題組通過歸納分析體內(nèi)藥物與受體作用過程的特點(diǎn)和傳統(tǒng)色譜技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)藥物-受體作用過程與色譜系統(tǒng)溶質(zhì)的吸附-解離行為極為相似，將受體識(shí)別藥物的高特異性和色譜技術(shù)的高分離能力相結(jié)合，提出了受體色譜新概念[2-10]。其內(nèi)涵是將藥物靶蛋白識(shí)別藥物的特異性作為色譜保留行為的本質(zhì)，延續(xù)了色譜技術(shù)的高分離能力，凸顯了藥物識(shí)別的靶向性特征，減少了藥物篩選的盲目性，提高了藥物篩選的準(zhǔn)確性。其外延可將任意靶蛋白、DNA等大分子或生物分子固載于色譜填料表面，應(yīng)用于復(fù)雜體系中其特異性配體的分離分析，服務(wù)于中藥及其復(fù)方關(guān)鍵功效物質(zhì)解析。

1.2 受體色譜的特點(diǎn)

由于受體色譜集成了受體識(shí)別藥物的高特異性和色譜技術(shù)的高分離能力，具有高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性和高靶向預(yù)測(cè)能力，已成為藥物-受體相互作用在線分析和復(fù)雜體系藥物活性成分高效篩選的重要方法之一[3-10]。其概念的提出，拓展了親和色譜研究范疇，更明確地表達(dá)了親和色譜的功能性特征。與傳統(tǒng)色譜技術(shù)相比，受體色譜具有以下優(yōu)勢(shì)：①受體分子通過溫和的固定化方法鍵合在固定相表面，可保證較高的柱效；②受體經(jīng)固定化后所處的膜脂質(zhì)微環(huán)境與在細(xì)胞膜上微環(huán)境相似，穩(wěn)定性好，可多次重復(fù)使用；③可采用色譜學(xué)方法對(duì)固定化受體的構(gòu)象及取向進(jìn)行梳理、調(diào)控、優(yōu)化，最大程度模擬體內(nèi)受體-藥物的相互作用；④可用于中藥復(fù)雜體系藥物活性成分高效、靶向篩選及藥物-受體相互作用快速分析。

1.3 受體色譜的發(fā)展

歷經(jīng)十余年的發(fā)展，筆者課題組以呼吸系統(tǒng)疾病藥物靶點(diǎn)β2-腎上腺素受體（β2-AR）及心腦血管疾病藥物靶點(diǎn)α1-腎上腺素受體（α1-AR）、血小板受體P2Y12（P2Y12R）、內(nèi)皮素受體（ETA和ETB）、血管緊張素II受體I型和II型受體（AT1和AT2）為例，建立了系列受體色譜模型（圖1）。利用上述色譜模型，建立了系列受體-藥物快速和精準(zhǔn)分析色譜方法，開展了系列固定化受體-藥物相互作用研究，篩選了系列中藥單體和復(fù)方活性成分，證明受體色譜可成功應(yīng)用于受體-藥物相互作用研究和中藥活性成分靶向篩選。該方法為受體-藥物相互作用高通量分析和復(fù)雜體系藥物活性成分高通量和高內(nèi)涵篩選提供了可靠方法。

2 受體色譜模型的建立

2.1 受體固定化方法

受體固定化方法包括物理吸附、隨意固定和定向固定三類。物理吸附法操作簡(jiǎn)便，蛋白質(zhì)固載量大，但受體與固體材料通過吸附作用結(jié)合較弱，易流失；隨意固定化法利用受體自身氨基、羧基及巰基與固體材料表面醛基等發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，反應(yīng)效率高，但無(wú)位點(diǎn)特異性，受體構(gòu)象雜亂不易，活性位點(diǎn)損失嚴(yán)重；定向固定化法利用受體結(jié)構(gòu)中融合生物素、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和組氨酸標(biāo)簽（His-tag）等分別與親和素、谷胱甘肽和鎳離子修飾的固體材料發(fā)生親和作用進(jìn)行固定化，能統(tǒng)一固定化受體取向，減小活性位點(diǎn)損失，但仍存在耐鹽程度低和穩(wěn)定性差等不足。

2.1.1 受體高容量定向固定化法

為解決受體鍵合量問題，筆者課題組通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)對(duì)固定相表面進(jìn)行接枝改性，通過重氮鹽反應(yīng)和鎳離子螯合反應(yīng)將His-tag融合受體定向固載于改性修飾后的色譜填料表面，建立了高密度His-tag功能蛋白質(zhì)定向固定化色譜固定相制備方法[5,10]。該方法不僅確保了固定相表面受體取向和構(gòu)象的一致性，而且減少了活性位點(diǎn)損失，顯著提高了受體固載量。

2.1.2 受體密度可控一步固定化法

傳統(tǒng)受體固定化方法實(shí)施的前提是獲得高純度受體，主要通過三步柱色譜法實(shí)現(xiàn)。為了避免受體分離純化過程導(dǎo)致的活性損失，筆者課題組受生物正交反應(yīng)啟發(fā)，分別將О6-鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶（SNAP-tag）和脫鹵素酶（HALO-tag）融合至受體末端，利用兩種酶與其底物的特異性共價(jià)反應(yīng)，將受體固載于底物修飾的固體填料表面，建立了密度可控、高特異性和單層均一的受體一步固定化方法[2]。由于此類反應(yīng)特異性高，可直接將目的蛋白從細(xì)胞裂解液中以共價(jià)鍵捕獲至固體填料表面，最大限度減少了受體活性損失，具有快速、可靠、選擇性強(qiáng)和固定化效率高的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

2.2 受體色譜固定相表征

固定化受體的生物活性是成功構(gòu)建受體色譜模型的重要依據(jù)之一，其表征方法是分析化學(xué)和藥物分析領(lǐng)域面臨的難點(diǎn)問題之一，目前尚未檢索到有效的方法。圍繞該問題，筆者課題組分別從形態(tài)學(xué)和生物活性方面開展了較為系統(tǒng)的工作，建立固定化受體色譜固定相形態(tài)學(xué)、取向、構(gòu)象和活性綜合表征方法學(xué)。

2.2.1 形態(tài)學(xué)表征

形態(tài)學(xué)表征主要表征固定化受體色譜固定相的物理化學(xué)性質(zhì)，可用經(jīng)典的化學(xué)表征方法實(shí)現(xiàn)。具體而言，用光電子能譜表征固定化色譜固定相的內(nèi)部和外部元素組成[2]，用透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡表征其內(nèi)外部形貌。

2.2.2 取向及構(gòu)象表征

以受體特異性抗體為分子探針，建立了以容量因子、結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)為指標(biāo)的固定化受體取向及構(gòu)象表征方法；創(chuàng)新性地將激光共聚焦顯微鏡應(yīng)用于固定化受體位點(diǎn)特異性取向及構(gòu)象變化活性表征中，以Cy5等熒光染料為探針，以熒光信號(hào)強(qiáng)弱為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)固定化受體具有配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化活性[2]。

圖1 受體色譜模型的構(gòu)建及應(yīng)用

2.2.3 活性表征

以受體激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和拮抗劑為工具藥，研究其與固定化受體相互作用的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)，對(duì)受體配體識(shí)別活性進(jìn)行表征；以受體下游偶聯(lián)蛋白Gs，Gi和Go等及其相關(guān)活性短肽為探針，獲得其與固定化受體相互作用過程的熵變，對(duì)受體下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性進(jìn)行表征，建立了固定化受體配體識(shí)別活性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性表征方法，為在線表征固定化受體色譜雙元活性提供了方法[2]。

3 受體色譜模型的應(yīng)用

3.1 受體-藥物相互作用研究

受體-藥物動(dòng)態(tài)識(shí)別行為及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程對(duì)于闡明受體結(jié)構(gòu)與功能、揭示藥物體內(nèi)作用機(jī)制、發(fā)現(xiàn)藥物新靶標(biāo)、指導(dǎo)后期臨床用藥和開發(fā)創(chuàng)新藥物具有重要意義。筆者課題組通過系列研究，證明受體色譜在受體-藥物相互作用快速分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.1.1 經(jīng)典前沿分析和競(jìng)爭(zhēng)置換法

從作用機(jī)理分析，受體色譜系統(tǒng)受體-藥物相互作用推動(dòng)力為弱分子間作用力，筆者認(rèn)為，經(jīng)典的前沿分析與競(jìng)爭(zhēng)置換法同樣適用于受體色譜。據(jù)此，筆者以α1A-AR和β2-AR為例，分別采用前沿分析和競(jìng)爭(zhēng)置換法研究了不同工具藥與兩種受體的相互作用，測(cè)定了不同工具藥在兩種受體色譜柱上的熱力學(xué)平衡常數(shù)等參數(shù)，與放射性配體免疫法所得結(jié)果高度一致，證明受體色譜法可用于受體-藥物相互作用研究[6,8]。

3.1.2 直接進(jìn)樣法

針對(duì)經(jīng)典前沿分析法和競(jìng)爭(zhēng)置換法分析時(shí)間長(zhǎng)和配體用量大的不足，筆者建立了基于配體進(jìn)樣量與容量因子依賴關(guān)系的直接進(jìn)樣法數(shù)學(xué)模型，該模型不需用大量配體飽和色譜柱，只需進(jìn)樣不同濃度的配體，即可快速分析受體-配體的相互作用，獲得其相互作用參數(shù)，特別適用于來源困難或珍貴配體的分析[4,5]。

3.1.3 非線性色譜法

受體-配體相互作用的熱力學(xué)參數(shù)主要探討結(jié)合反應(yīng)發(fā)生的可能性，而動(dòng)力學(xué)參數(shù)主要判斷配體成藥的可行性。為了克服前沿色譜法等方法缺乏受體與藥物相互作用熱力學(xué)參數(shù)的不足，筆者將非線性色譜法引入至受體-藥物相互作用研究，證明該方法不僅能準(zhǔn)確測(cè)定平衡常數(shù)，而且能同步獲得受體與配體的結(jié)合速率參數(shù)，為蛋白質(zhì)-藥物相互作用參數(shù)的全面測(cè)定提供了借鑒[6,7]。此外，該方法同樣不需用大量配體飽和色譜柱，能有效彌補(bǔ)前沿分析和競(jìng)爭(zhēng)置換在分析時(shí)間長(zhǎng)和藥物用量大等方面的不足。

3.1.4 吸附能量分布模型

吸附模型的正確選擇對(duì)受體-藥物相互作用精準(zhǔn)分析意義重大。筆者課題組將吸附能量分布模型（AED）引入至β2-AR與藥物的相互作用研究，通過系統(tǒng)的AED計(jì)算，對(duì)直接前沿分析和位點(diǎn)特異性競(jìng)爭(zhēng)前沿分析色譜-質(zhì)譜所得吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，獲得最佳吸附模型，準(zhǔn)確測(cè)定受體-藥物相互作用參數(shù)[3]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法所得結(jié)果更接近于放射性配體免疫法，結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確度均高于競(jìng)爭(zhēng)置換法和前沿分析法等傳統(tǒng)方法。其原因可能在于色譜固定相的改進(jìn)、方法靈敏度的提高以及數(shù)學(xué)模型的優(yōu)化。更為重要的是，藥物在受體色譜柱上的保留時(shí)間變化率可用于預(yù)測(cè)藥物與受體的作用力。方法只需單次進(jìn)樣，即可同時(shí)鑒定競(jìng)爭(zhēng)劑與受體的結(jié)合位點(diǎn)并預(yù)測(cè)競(jìng)爭(zhēng)劑的受體結(jié)合活性，能夠精準(zhǔn)分析G-蛋白偶聯(lián)受體-藥物相互作用。

3.2 中藥復(fù)方活性成分篩選

3.2.1 單靶點(diǎn)活性成分篩選模型

受體色譜法兼具色譜技術(shù)的高分離能力和受體與藥物識(shí)別過程的高特異性，在活性成分篩選的同時(shí)進(jìn)行分離鑒定。筆者課題組采用β2-AR色譜柱對(duì)多種中藥提取液進(jìn)行分析，篩選了可與該受體特異性結(jié)合的活性成分，利用反相高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)活性成分進(jìn)行了在線分離與鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2，3-亞甲基二氧-9-甲氧基-原小檗堿、黃連素、巴馬汀和藥根堿為黃連中可與β2-AR相互作用的活性成分，芥子堿硫氰酸鹽和芥子酸膽堿為白芥子中與β2-AR靶向活性成分，證明受體色譜法可用于篩選中藥中的活性成分[9]。

3.2.2 多靶點(diǎn)活性成分篩選模型

上述篩選研究證明，受體色譜可用于中藥活性成分篩選。然而，從篩選機(jī)理分析，一類受體色譜僅能發(fā)現(xiàn)中藥中的一種或一類生物分子，無(wú)法滿足多種類、多靶點(diǎn)中藥活性分子的篩選。如果能將不同受體色譜柱在線組合，就能建立多維受體色譜模型[9]，應(yīng)用于中藥多種類、多靶點(diǎn)活性成分篩選。據(jù)此，筆者將α1-AR和β2-AR色譜柱在線串聯(lián)，當(dāng)藥物供試品進(jìn)入α1-AR柱后，在α1-AR柱上不保留成分可切換至β2-AR色譜柱進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)篩選作用于兩類受體的活性成分；另一方面，在α1-AR柱上保留的成分，也可以再次切換至β2-AR柱，獲得同時(shí)作用于2種受體的多靶點(diǎn)成分。利用該方法，筆者證明黃連中小檗堿、巴馬汀和藥根堿為同時(shí)作用于2種受體的活性成分。

3.2.3 熱病理狀態(tài)活性成分篩選

生物醫(yī)學(xué)研究表明，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象異常變化是眾多疾病的發(fā)病機(jī)制之一，而疾病引起的體溫改變會(huì)調(diào)控蛋白質(zhì)的構(gòu)象。筆者以固定化β2-AR為例，采用受體色譜模型研究了溫度誘導(dǎo)的受體構(gòu)象變化，證明探針?biāo)幬锸中詫?duì)映體麻黃堿和偽麻黃堿在色譜柱上的分離度可用于表征熱病理狀態(tài)下固定化受體的構(gòu)象，為體內(nèi)熱病理狀態(tài)下藥物活性成分高效篩選提供了新的思路[10]。

3.2.4 位點(diǎn)特異性競(jìng)爭(zhēng)活性成分篩選模型

受體色譜篩選藥物活性成分的本質(zhì)是固定化受體-藥物結(jié)合解離行為，缺乏目標(biāo)成分激動(dòng)或拮抗活性的直接信息。筆者課題組采用位點(diǎn)特異性競(jìng)爭(zhēng)前沿色譜-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)6種藥物混合物進(jìn)行了篩選[3]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥苷和甘草苷與沙丁胺醇競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體上同一類位點(diǎn)，提示2種成分具有β2-AR激動(dòng)活性，證明該方法在復(fù)雜體系藥物活性成分篩選的同時(shí)，能有效判定目標(biāo)成分的激動(dòng)或拮抗活性及準(zhǔn)確作用位點(diǎn)，為建立基于受體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的高內(nèi)在活性藥物成分篩選提供了依據(jù)。

4 展望

自受體色譜概念提出至今，筆者課題組圍繞受體色譜在受體-藥物相互作用和中藥活性成分篩選方面開展了大量工作，取得了一定的研究結(jié)果。然而，作為一種以廣泛應(yīng)用為導(dǎo)向的新方法，受體色譜尚需進(jìn)一步完善和提升：①多靶點(diǎn)協(xié)同起效是中藥主要作用特征。以中藥為源泉進(jìn)行靶向活性成分篩選，亟需增加受體種類，發(fā)展多維色譜系統(tǒng)，以滿足多種類和多靶點(diǎn)篩選要求；②配體的受體識(shí)別結(jié)合參數(shù)僅是藥物活性的判定指標(biāo)之一。受體色譜柱中的保留成分是否具有內(nèi)在活性，尚需發(fā)展多元化的指標(biāo)加以探討。若藥物在色譜柱上的保留行為與受體下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)聯(lián)，有望通過色譜法獲得活性成分更豐富的活性信息；③發(fā)展新型受體制備、固定化和藥物成分篩選方法，實(shí)現(xiàn)藥物活性成分智能篩選，以降低受體色譜對(duì)人員技術(shù)的要求，達(dá)到廣泛推廣的目標(biāo)。