糖腎方改善糖脂代謝紊亂“肝腎同治”機(jī)制研究＊

趙婷婷，張浩軍，嚴(yán)美花，李 平

（中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所免疫炎性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100029）

糖尿病已成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的流行性疾病，其發(fā)病人數(shù)日益增長，其中II型糖尿病占90%以上。我國18歲以上人群糖尿病患病率已達(dá)11.6%，患病人口1.14億，而糖尿病前期患者高達(dá)50.1%[1]。糖尿病并發(fā)癥如糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要死因，據(jù)國際糖尿病組織報(bào)道，2013年全球約509.7萬人因糖尿病及其并發(fā)癥而死亡，其中中國患者127.1萬人[2]。因此，糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制和藥物防治已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)之一。

脂代謝紊亂是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。多項(xiàng)前瞻性研究已證實(shí)脂代謝紊亂是預(yù)測2型糖尿病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。糖尿病血脂異常的主要臨床表現(xiàn)為血清甘油三酯升高和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）降低，可伴低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoproteincholesterol，LDL-C）升高[3]。糖尿病患者不能有效地利用葡萄糖，導(dǎo)致脂肪動(dòng)員增加，血循環(huán)中游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）升高。過剩的FFA進(jìn)入脂肪細(xì)胞合成為甘油三酯被儲存起來，F(xiàn)FA在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)積聚導(dǎo)致脂毒性的產(chǎn)生。FFA在肝組織蓄積表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD），在腎臟則導(dǎo)致DN。

糖尿病患者體內(nèi)FFA水平升高激活炎癥通路，肝臟一方面成為炎癥因子作用的靶器官，同時(shí)也通過炎癥因子釋放加重了炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了脂肪肝[4,5]和DN的病理進(jìn)程[6]。NAFLD患者微量蛋白尿患病率顯著高于無脂肪肝患者，且獨(dú)立于一些潛在的混雜變量[7]，提示NAFLD和DN有著密切聯(lián)系。因此，糾正與改善脂代謝紊亂在糖尿病肝腎損害的防治中具有重要意義。

本團(tuán)隊(duì)在國家科技部“973”計(jì)劃課題、國家自然科學(xué)基金委員會國際合作重點(diǎn)項(xiàng)目等支持下，對近三十年來中醫(yī)藥治療糖尿病腎病1646篇文獻(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的梳理，繼承前人經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合自身臨床實(shí)踐，創(chuàng)新性提出“從肝論治”糖尿病腎病，以“益氣柔肝、活血通絡(luò)”立法，組方糖腎方。下文將從糖腎方治療糖尿病腎病臨床研究和體內(nèi)外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和化學(xué)成分研究等方面進(jìn)行描述。

1 糖腎方治療DN改善脂代謝的臨床試驗(yàn)研究

2007年4 月至2009年12月間，團(tuán)隊(duì)在北京、上海、河北唐山等地6家三甲醫(yī)院開展了多中心、隨機(jī)雙盲、安慰劑平行對照臨床試驗(yàn)（注冊號：ChiCTR-TRC-10000843，中日友好醫(yī)院倫理號：2006-059）。共納入180例氣虛血瘀證2型糖尿病腎病（符合微量白蛋白尿期和顯性蛋白尿期）患者，在ACEI或ARB基礎(chǔ)治療上，受試者按2:1的比例隨機(jī)分為糖腎方組或安慰劑組。其中糖尿病微量白蛋白尿患者98例（糖腎方組66 vs安慰劑組32），大量白蛋白尿患者82例（糖腎方組56 vs安慰劑組26），給藥治療24周。

研究結(jié)果[8]顯示：糖腎方改善了顯性蛋白尿期患者倦怠乏力、肢體麻木等氣虛血瘀相關(guān)癥狀，與安慰劑比較差異顯著（P=0.0371）。在微量白蛋白尿期，糖腎方治療組在減少尿蛋白排泄和改善腎小球?yàn)V過率方面與國際公認(rèn)的一線用藥ACEI/ARB療效一致，在延緩腎功能進(jìn)展方面更具優(yōu)勢；在顯性蛋白尿期，尿蛋白排泄增加，腎小球?yàn)V過率呈進(jìn)行性下降，此時(shí)ACEI/ARB加安慰劑治療無法阻止疾病進(jìn)展，在此階段糖腎方明顯起到了降低24 h尿蛋白定量，提高腎小球?yàn)V過率的治療作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，糖腎方顯著降低DN患者總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride）、LDL水平，升高HDL水平，改善脂代謝紊亂[9,10]。兩組不良事件發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。幾年來，我們在全國多家三級甲等醫(yī)院推廣使用糖腎方治療DN（氣陰兩虛夾瘀型），收到良好的效果。

2 糖腎方減輕糖尿病肝腎組織損害的作用研究

本團(tuán)隊(duì)先后利用4種糖尿病腎病模型針對糖腎方開展了系列實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了糖腎方在降低24 h尿蛋白排泄、改善腎臟組織病理損傷方面均顯著優(yōu)于陽性對照藥蒙諾/安博維，為臨床試驗(yàn)結(jié)論提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)支撐依據(jù)。

我們從日本引進(jìn)了與人類糖尿病進(jìn)展特點(diǎn)和病理特征比較相似的自發(fā)性2型糖尿病動(dòng)物模型—OLETF大鼠，該鼠早期以胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂為主，以后逐漸出現(xiàn)胰腺功能減退，晚期合并糖尿病腎臟病變。研究發(fā)現(xiàn)，糖腎方對肥胖OLETF大鼠能減輕體重，降低血糖，減少24 h尿蛋白排泄，改善腎小球硬化及小管間質(zhì)間質(zhì)纖維化損害[11]，降低血清中白介素-10（interleukin-10，IL-10）和腫瘤壞死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）等炎癥介質(zhì)[12]，改善TC水平和磷脂水平[13]，減輕肝臟損傷[14]，表明糖腎方在改善糖尿病肝腎損害的同時(shí)，也在一定程度上糾正了其脂代謝的紊亂。

采用高脂飲食合并小劑量鏈尿佐菌素成功誘導(dǎo)了類似于2型糖尿病伴脂代謝紊亂的大鼠模型，基于此模型給予糖腎方治療20周觀察其對大鼠肝腎損害的影響。結(jié)果表明：糖腎方也降低了模型大鼠的尿白蛋白排泄和減輕了腎組織病理損害，抑制了腎臟炎癥因子IL-1β及TNF-α mRNA及蛋白的表達(dá)[15]。而且，糖腎方對谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT又稱 ALT）、谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT又稱AST）異常升高也有明顯降低作用，明顯減輕模型大鼠肝組織病理改變[16]。

團(tuán)隊(duì)繼而采用10周齡自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠為模型組，同周齡db/m小鼠為對照組，連續(xù)給予糖腎方12周。結(jié)果顯示[17]，糖腎方治療組db/db小鼠血清ALT和AST水平顯著低于非治療組，說明糖腎方對糖尿病引起的肝功能損害具有保護(hù)作用。肝臟HE染色結(jié)果表明，db/db非治療組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，體積較正常增大，嚴(yán)重者胞質(zhì)疏松，且匯管區(qū)及中央靜脈周圍脂肪變性明顯。糖腎方治療組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列尚整齊，肝細(xì)胞無明顯脂肪變性，脂肪病變程度評分顯著減少。油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠肝組織大量油紅沉積，而糖腎方治療后脂滴變小，數(shù)量變少，進(jìn)一步驗(yàn)證糖腎方能夠顯著減少肝臟脂質(zhì)沉積。

3 糖腎方改善糖尿病脂代謝紊亂防治肝腎損害的分子機(jī)制研究

圖1 糖腎方改善糖脂代謝“肝腎同治”研究思路圖

脂代謝紊亂與胰島素抵抗、多種細(xì)胞因子異常分泌、糖原沉積、氧化應(yīng)激、AMPK活化等諸多因素密切相關(guān)。最近的研究顯示，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的激活在上述因素介導(dǎo)的脂代謝紊亂中發(fā)揮著核心作用，是導(dǎo)致糖尿病脂代謝紊亂的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB）信號通路驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)在腎臟病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，而mTOR一方面通過激活A(yù)kt啟動(dòng)NF-κB信號通路，另一方面通過激活I(lǐng)KK激酶，降解IκB從而激活NF-κB。同時(shí)NF-κB激活釋放的炎癥介質(zhì)CRP、IL-6及TNF-α等能夠激活mTOR，從而進(jìn)一步加劇脂代謝紊亂。肝腎纖維化是糖尿病脂代謝紊亂介導(dǎo)肝腎損害的主要病理特征。眾所周知TGF-β1/Smad3信號通路是肝腎纖維化的關(guān)鍵機(jī)制。TGF-β1通過促進(jìn)Smad3轉(zhuǎn)錄入核從而促進(jìn)膠原沉積。最新研究發(fā)現(xiàn)mTORC1在這一過程中扮演重要作用。雷帕霉素能夠有效阻斷Smad3引起的膠原沉積[18]和TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化。此外，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，阻斷mTOR能夠顯著降低腎臟TGF-β1表達(dá)，減少腎小球細(xì)胞外基質(zhì)積聚，提示mTOR是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19]。基于上述理論以及糖腎方有效改善肝腎炎癥和纖維化的療效特點(diǎn)，本團(tuán)隊(duì)提出科學(xué)假說：糖腎方改善糖尿病脂代謝紊亂防治肝腎損害的一個(gè)主要分子機(jī)制是通過調(diào)控mTOR信號通路，抑制NF-κB驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)和TGF-β1/Smad3通路介導(dǎo)的纖維化實(shí)現(xiàn)（圖1）。

基礎(chǔ)研究證實(shí)，糖腎方顯著下調(diào)DN模型動(dòng)物腎組織NF-κB p65磷酸化水平，減少單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和 IL-1β表達(dá)，顯著降低模型大鼠腎組織TGF-b1/Smad3信號通路以及I型膠原和IV型膠原水平，上調(diào)db/db小鼠腎臟中過氧化物酶體增殖劑激活受體ɑ（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARɑ）及其輔助激活因子-1α（PPARγcoactivator-1α，PGC-1α）、肝X 受體（liver X-activated receptor，LXR）和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）蛋白和mRNA水平，減少腎臟脂質(zhì)沉積[20]。

糖腎方可顯著上調(diào)db/db小鼠肝組織腺苷一磷酸激活蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）的磷酸化水平及抑制轉(zhuǎn)錄因子膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP1）的表達(dá)及入核，從而顯著下調(diào)其下游脂肪酸從頭合成靶分子和膽固醇合成關(guān)鍵酶蛋白及基因水平；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，糖腎方可顯著增加db/db小鼠肝組織PI3K/Akt蛋白水平和減少p-mTOR水平，提示糖腎方可一定程度改善肝組織胰島素抵抗與mTOR介導(dǎo)的脂質(zhì)沉積。從而系統(tǒng)揭示了糖腎方改善脂代謝紊亂肝腎同治的科學(xué)內(nèi)涵[17]。

4 糖腎方化學(xué)成分分析與鑒定研究

為了進(jìn)一步挖掘糖腎方的物質(zhì)基礎(chǔ)，團(tuán)隊(duì)利用化學(xué)物質(zhì)組學(xué)方法建立了建立了糖腎方整體化學(xué)物質(zhì)指紋圖譜，運(yùn)用現(xiàn)代色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對糖腎方進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，通過HPLC-DAD-TOFMS等色譜分析手段，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定出糖腎方中的51個(gè)成分，主要為皂苷類、有機(jī)酸類、黃酮類等成分，各類成分在藥材中的分布具體為：15個(gè)來源于山茱萸的有機(jī)酸及黃酮類成分、10個(gè)來源于三七的皂苷類成分、12個(gè)來源于鬼箭羽的黃酮類及有機(jī)酸類等成分、4個(gè)來源于枳殼的黃酮苷類成分、10個(gè)來源于黃芪的黃酮類及皂苷類成分。

5 討論

具有“益氣柔肝、活血通絡(luò)”功效的糖腎方改善脂代謝保護(hù)肝腎功能的機(jī)制研究是中醫(yī)基礎(chǔ)理論、現(xiàn)代文獻(xiàn)研究、臨床RCT研究和分子生物學(xué)研究綜合運(yùn)用的成果，體現(xiàn)了“病-癥-方-效-理”研究思路，實(shí)現(xiàn)了臨床-實(shí)驗(yàn)室-臨床的轉(zhuǎn)化，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了良好示范。

目前西醫(yī)對NAFLD和DN均采用綜合治療方法，都要求調(diào)整基本生活方式如合理飲食適當(dāng)運(yùn)動(dòng)，減輕體重。該治療措施對疾病早期有一定的療效，可以延緩疾病的進(jìn)展，然而，對中晚期病變，特別是臟器出現(xiàn)硬化和纖維化階段尚無有效的治療藥物。同時(shí)，多種、大劑量藥物的服用，給肝腎本身帶來了極大的負(fù)擔(dān)及損害。糖腎方的優(yōu)勢特色在于系統(tǒng)改善機(jī)體脂代謝紊亂，同時(shí)發(fā)揮保護(hù)肝腎功能的功效，而且副作用較小。

本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)從糖脂代謝紊亂、炎癥和纖維化三個(gè)層面揭示了糖腎方。然而，糖腎方調(diào)控上述通路的具體分子靶點(diǎn)是什么？能否采用RNA-seq的方法，進(jìn)一步挖掘糖腎方新的分子靶點(diǎn)以及上述三條通路之間發(fā)生聯(lián)系的潛在分子。上述科學(xué)問題的解決將進(jìn)一步闡明腎方肝腎同治的科學(xué)依據(jù)，豐富中醫(yī)肝腎同源理論的科學(xué)內(nèi)涵。