基于Poly-PK策略的多組分藥物研究＊

王 洋，溫麗榮，林思彤，池 逸，林景超

（麥特繪譜生物科技（上海）有限公司 上海 201203）

近年來，隨著藥代動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域新理論、新方法的涌現(xiàn)，研究者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到僅用單體化合物或者幾種有效成分進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究只能反映藥物單體或少數(shù)有效成分本身的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，不能反映多組分藥物整體藥代動(dòng)力學(xué)特征。單成分、單靶點(diǎn)的藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究模型在多組分藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究中存在很大的局限性，而從單一組分到多組分、單靶點(diǎn)到多靶點(diǎn)的藥代動(dòng)力學(xué)研究策略則有待進(jìn)一步開發(fā)與完善。本文重點(diǎn)介紹運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行多組分藥代動(dòng)力學(xué)研究策略（Polypharmacokineties，Poly-PK），并對(duì)該研究策略的發(fā)展前景和技術(shù)挑戰(zhàn)進(jìn)行展望。

1 多組分藥代動(dòng)力學(xué)研究現(xiàn)狀

近幾十年，國(guó)內(nèi)學(xué)者運(yùn)用各種思路與新技術(shù)對(duì)中藥展開藥代動(dòng)力學(xué)探索性研究，在臨床藥物評(píng)價(jià)中經(jīng)常面臨的是機(jī)體內(nèi)在因素（年齡、性別、疾病等）和外在因素（藥物相互作用等）的相互作用，該作用將影響藥物劑量-效應(yīng)和暴露量-效應(yīng)關(guān)系[1]。因此，目前研究多組分藥物藥代動(dòng)力學(xué)可采用藥代動(dòng)力學(xué)-藥效動(dòng)力學(xué)結(jié)合模型（pharmacokinetics-pharmacodynamics，PKPD）、生理藥代動(dòng)力學(xué)模型（physiologically based pharmacokinetic，PBPK）、藥代標(biāo)示物（pharmacokinetic markers，PK-Markers）等。

1.1 多組分PK-PD結(jié)合模型

近年來，采用PK-PD結(jié)合模型研究機(jī)體對(duì)藥物的作用以及藥物對(duì)機(jī)體的效應(yīng)已成為多組分藥物藥動(dòng)學(xué)研究的熱點(diǎn)方法[2]。藥動(dòng)學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)是按時(shí)間進(jìn)行的兩個(gè)密切相關(guān)的動(dòng)力學(xué)過程，PK是研究治療劑量下“血藥濃度-時(shí)間”的關(guān)系，而PD則是研究治療劑量下“藥效-血藥濃度”的關(guān)系。將二者相結(jié)合進(jìn)行研究不僅能闡明藥物在體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律性，也能揭示藥物在效應(yīng)部位作用的特性，是研究藥物劑量與藥物效應(yīng)之間定量關(guān)系的有效工具，能較客觀地闡明“時(shí)間-濃度-效應(yīng)”之間的三維關(guān)系，在優(yōu)選臨床用藥劑量、提高療效和減少毒副作用等領(lǐng)域具有重要的參考價(jià)值[3]。楊永茂[4]以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚為PK指標(biāo)，以腫瘤壞死因子α、內(nèi)毒素和二胺氧化酶為PD指標(biāo)，以作用機(jī)制為導(dǎo)向，以結(jié)構(gòu)方程和微分動(dòng)力系統(tǒng)為方法，為中藥多成分多效應(yīng)之間的關(guān)系研究提供一定的借鑒意義。杜力軍[5]等利用PK-PD結(jié)合模型分析以黃芩苷、小檗堿和蛇床子素作為黃芩、黃連、獨(dú)活等中藥的有效部位群的代表成分，研究三者的代謝過程與發(fā)熱大鼠體溫變化的關(guān)系。但是，PK-PD結(jié)合模型研究仍面臨需要解決的問題，如多組分中藥成分不明確或者干擾因素太多，如何對(duì)有效效應(yīng)物質(zhì)、有效成分、無效成分3個(gè)部分進(jìn)行整體性研究；如何選擇藥效指標(biāo)直接反映治療效果；此外，各成分之間相互影響，同一種有效成分在不同中藥中因所處環(huán)境不同，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)也各不同[6]。因此建立符合中醫(yī)藥理論的多組分、多靶點(diǎn)的PK-PD結(jié)合模型是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中的一個(gè)重要課題。

1.2 基于生理的藥代動(dòng)力學(xué)模型（PBPK）

PBPK是根據(jù)人體生理系統(tǒng)參數(shù)、藥物理化性質(zhì)以及PK數(shù)據(jù)整合分析以提早預(yù)測(cè)人體內(nèi)的PK及藥效學(xué)特征。模型主要包括三個(gè)部分：系統(tǒng)特異的參數(shù)（血流速度、組織組成等）、藥物特異的參數(shù)（蛋白結(jié)合率、酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)等）和模型結(jié)構(gòu)[7]。PBPK模型結(jié)構(gòu)是根據(jù)每個(gè)器官中的藥物濃度變化作為一個(gè)模塊，然后將所有模塊中藥物濃度和血藥濃度的定量關(guān)系建立整體模塊來實(shí)現(xiàn)對(duì)全身組織器官中藥物濃度進(jìn)行動(dòng)態(tài)描述。因此，利用PBPK模型對(duì)藥物藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行篩選；通過結(jié)合體外數(shù)據(jù)和生理放大系數(shù)，PBPK模型預(yù)測(cè)藥物在動(dòng)物和人的整體藥代動(dòng)力學(xué)行為；結(jié)合體外代謝實(shí)驗(yàn)，可提前預(yù)測(cè)藥物相互作用；在臨床階段，PBPK模型結(jié)構(gòu)可以預(yù)測(cè)人體不同生理?xiàng)l件（不同年齡、不同疾病狀態(tài)、不同種族）下的PK及藥效特征[8,9]。He[10]等基于多組織/器官全體PBPK模型，以懷孕相關(guān)的生理參數(shù)，用于描述孕婦參考藥物（二甲雙胍、地高辛等）的PK，與非懷孕或產(chǎn)后（PP）婦女的PK相比，預(yù)測(cè)藥物（二甲雙胍、地高辛、咪達(dá)唑侖等）在孕婦中潛在的暴露變化。也有人對(duì)腎衰竭患者進(jìn)行PBPK預(yù)測(cè)[11]，該研究建議建立并驗(yàn)證藥物模型和腎衰竭患者生理學(xué)模型，整合可體現(xiàn)生理改變影響藥物PK特征的關(guān)鍵藥物參數(shù)和生理學(xué)參數(shù)，經(jīng)過臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證后，才可用于腎衰竭患者PK特征預(yù)測(cè)。

1.3 藥代標(biāo)示物（PK-Markers）

PK-Markers研究方法中的標(biāo)示物需要滿足三個(gè)條件：首先，標(biāo)示物存在于所研究的藥物中或者藥物相關(guān)的代謝物；其次，標(biāo)示物與藥效作用相關(guān)，在體內(nèi)暴露顯著；最后，標(biāo)示物可以用現(xiàn)代分析方法檢測(cè)且在不同時(shí)間點(diǎn)下濃度不同[12]。該法突出了代謝物的概念，即多組分藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究應(yīng)該基于血清中的、有代表性的、與藥物效應(yīng)相關(guān)的組分進(jìn)行分析[13]。因此，尋找合適的標(biāo)示物成為該方法的重點(diǎn)。李川等[14]基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立同時(shí)檢測(cè)16種人參皂苷成分的方法，并研究了大鼠口服三七提取物后人參皂苷在體內(nèi)的吸收與分布情況，對(duì)三七中的PK markers進(jìn)行了鑒定，研究結(jié)果顯示原人參二醇類人參皂苷GRa3、GRb1、GRd可作為表征三七水提物經(jīng)口服后合適的PK markers。

2 Poly-PK策略提出

近十幾年，代謝組學(xué)技術(shù)（LC-MS、GC-MS和NMR等）的成熟與應(yīng)用，代謝組學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度得到大幅提高[15]，代謝組學(xué)不僅可以同時(shí)檢測(cè)成百上千的小分子代謝物，利用生物信息方法還可以系統(tǒng)地闡釋給定條件下生物機(jī)體內(nèi)源性代謝物譜的動(dòng)態(tài)變化及其與外源性干擾之間的關(guān)系[16]。因此，這種外源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在生物體內(nèi)隨時(shí)間變化過程的代謝組學(xué)研究更能滿足PK研究目的[17]。

針對(duì)傳統(tǒng)中藥PK發(fā)展的瓶頸問題，如采用單一或若干成分的傳統(tǒng)PK方法來研究多組分中藥PK并不契合實(shí)際[18]，多組分藥物中各成分之間相互影響應(yīng)該如何體現(xiàn)[19]，賈偉研究團(tuán)隊(duì)逐步提出了多組分中藥PK研究新策略即Poly-PK研究策略。該策略是利用代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)藥物自身的化學(xué)成分、不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)產(chǎn)生的次級(jí)代謝成分，以及不同時(shí)間點(diǎn)生物體的內(nèi)源性代謝物3個(gè)水平同時(shí)進(jìn)行絕對(duì)定性、定量檢測(cè)，聯(lián)合生物信息學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性和關(guān)聯(lián)性分析比較，在分子水平上刻畫多組分藥物在體內(nèi)的整體、動(dòng)態(tài)的代謝和相互作用過程，充分體現(xiàn)復(fù)雜藥物成分的整體、協(xié)同代謝效應(yīng)[20,21]（圖1）。該研究策略與傳統(tǒng)方法相比，通過多組分中藥與代謝組學(xué)相結(jié)合監(jiān)測(cè)藥物及機(jī)體用藥前后的代謝輪廓變化，實(shí)現(xiàn)了外源性物質(zhì)與內(nèi)源性代謝物之間的關(guān)系。其次，通過監(jiān)測(cè)多組分藥物在機(jī)體吸收后發(fā)生生物轉(zhuǎn)化的代謝物，可以明確哪些成分是經(jīng)過腸道菌群或者肝酶代謝產(chǎn)生的活性成分，有助于研究外源性物質(zhì)的代謝通路，揭示多組分藥物的作用機(jī)制[22]。

3 Poly-PK策略初步驗(yàn)證

圖1 Poly-PK研究策略

在這種新的研究策略下，首次考察普洱茶對(duì)人體代謝影響的研究，初步驗(yàn)證了Poly-PK策略的有效性和可行性[23]。采用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-QTOF/MS）和氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（GC-TOF/MS）對(duì)普洱茶中的成分及尿液樣本進(jìn)行代謝物分析鑒定，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品鑒定，在UPLC-QTOF/MS和GC-TOF/MS兩個(gè)平臺(tái)分別鑒定出132種和58種物質(zhì)。隨后對(duì)志愿者飲茶后0,1,3,6,9,12,24小時(shí)的尿液樣本中的代謝成分隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。將喝茶后不同時(shí)間點(diǎn)的尿液成分與0點(diǎn)尿液成分相比較，尋找到喝茶后引起改變的內(nèi)源性物質(zhì)118種。將喝茶后不同時(shí)間點(diǎn)的尿液與茶提取液相比較，得到尿液中有19種物質(zhì)成分是從普洱茶中吸收的，還有26種物質(zhì)成分是從普洱茶吸收并經(jīng)體內(nèi)代謝產(chǎn)生的。例如普洱茶中的咖啡因成分，在肝臟內(nèi)經(jīng)過細(xì)胞色素P450氧化酶體系的作用生成7-二甲基黃嘌呤、可可豆堿、茶堿三種成分，而可可豆堿、茶堿則進(jìn)一步代謝為1,7-二甲基尿酸、1-甲基黃嘌呤，隨后生成1-甲基尿酸。通過該項(xiàng)研究確定了普洱茶中的成分、飲用后被機(jī)體吸收的成分以及對(duì)機(jī)體內(nèi)源性代謝物的影響，利用生物信息學(xué)方法分析三者之間的相互作用，初步闡明了普洱茶的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。也驗(yàn)證了Poly-PK研究策略的有效性和可行性。

圖2 黃芪湯成分代謝變化

為了實(shí)現(xiàn)Poly-PK研究方法在中藥研究中的應(yīng)用，隨后，采用相同策略及技術(shù)開展復(fù)方中藥黃芪湯I(xiàn)期臨床研究，對(duì)健康志愿者服用中藥黃芪湯（黃芪和甘草）前后藥物的多種化學(xué)成分在體內(nèi)的吸收、代謝過程，以及對(duì)機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究[24]。研究結(jié)果顯示黃芪湯包含有84種不同的化學(xué)成分，服藥前志愿者體內(nèi)被檢測(cè)到292種體內(nèi)代謝物，服藥后則被檢測(cè)到532種代謝物。對(duì)服藥前與服藥后各時(shí)間點(diǎn)的代謝物分析比較，發(fā)現(xiàn)其中有485種代謝物發(fā)生變化，并且這種變化與服用黃芪湯有關(guān)。經(jīng)生物信息學(xué)分析得知，黃芪湯中有56種成分是以原型成分形式被吸收進(jìn)入血液，還有292種新成分（黃芪湯的次級(jí)代謝物）是黃芪湯中的原藥成分通過機(jī)體代謝新產(chǎn)生的。另外，有166種體內(nèi)的代謝物（內(nèi)源性代謝產(chǎn)物）由于服用黃芪湯發(fā)生了顯著變化（圖2）。黃芪湯成分被體內(nèi)吸收和代謝后，能顯著調(diào)節(jié)機(jī)體數(shù)十種內(nèi)源性代謝物通路，也就是說黃芪湯中的成分在體內(nèi)代謝過程的同時(shí)能對(duì)機(jī)體的代謝產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生了藥效作用。

此外，該研究將芒柄花黃素、甘草次酸、甘草素、甘草苷、異甘草苷進(jìn)行了傳統(tǒng)PK分析，將Poly-PK分析結(jié)果與常規(guī)藥物PK結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩種方式的處理結(jié)果基本保持一致，但是Poly-PK能夠提供的信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出前者，在所檢出的化合物種類和數(shù)量、觀察到的藥物互相作用關(guān)系、以及獲得的人體代謝應(yīng)答信息（藥效信息）方面是傳統(tǒng)PK方法無法比擬的。

這種新思路利用代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)藥物自身的化學(xué)成分、體內(nèi)產(chǎn)生的次級(jí)代謝成分，以及生物體的內(nèi)源性代謝物三組變量同時(shí)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，聯(lián)合生物信息學(xué)方法對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性和關(guān)聯(lián)性的分析比較，獲得遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)藥代動(dòng)力學(xué)方法所能得到的藥物代謝信息，體現(xiàn)復(fù)雜藥物整體成分的代謝效應(yīng)。

4 展望

多組分藥物在疾病治療中的重要作用越來越凸顯[25,26]。藥物多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的整體性特征決定成分/組分之間存在獨(dú)特的協(xié)同或拮抗作用，而這種協(xié)同或拮抗作用的研究則需要符合該特點(diǎn)的藥物研究模式。從Poly-PK概念的提出，到采用普洱茶在人群中開展驗(yàn)證性研究，再到真正意義上的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究，Poly-PK研究策略顯現(xiàn)出其有效性和可行性。Poly-PK整合了藥物分子輪廓分析技術(shù)和定量代謝組學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)幾十種甚至上百種藥物成分的體內(nèi)代謝變化以及人體的代謝應(yīng)答（藥效）進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，展示了復(fù)雜藥物原型成分、經(jīng)過代謝的次級(jí)成分、機(jī)體在藥物影響下發(fā)生的代謝變化以及三者之間的相互關(guān)系，在系統(tǒng)水平上描繪出復(fù)雜藥物系統(tǒng)的體內(nèi)ADME全過程。

多組分藥物藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析流程相對(duì)比較復(fù)雜，通常涉及多種不同的軟件，因此，賈偉團(tuán)隊(duì)開發(fā)了相匹配的生物信息學(xué)軟件，R包—Poly-PK，采用10個(gè)函數(shù)實(shí)現(xiàn)了從數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異性物質(zhì)鑒定、分組、PK參數(shù)的計(jì)算、各種多元統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)分析、聚類分析等藥代動(dòng)力學(xué)及對(duì)機(jī)體效應(yīng)分析的全部功能，實(shí)現(xiàn)研究結(jié)果可視化。目前，該研究結(jié)果發(fā)表于生物信息學(xué)和計(jì)算生物學(xué)權(quán)威學(xué)術(shù)期刊Bioinformatics上（Bioinformatics.2017），該軟件包獲得軟件著作權(quán)，并已被CRAN收錄，可免費(fèi)下載使用（https://CRAN.R-project.org/package=polyPK）[27,28]。

目前多組分藥代動(dòng)力學(xué)研究尚處于探索階段，雖然前期已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但仍然在許多方面存在著問題需要進(jìn)一步解決。比如多組分藥物中，有的成分含量高，有的成分含量則很低，如何高通量準(zhǔn)確的定性和定量藥物組分是系統(tǒng)、全面地分析藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)的根本保證。臨床藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)中，采樣點(diǎn)的確定對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果具有重大的影響，中藥成分復(fù)雜，采樣點(diǎn)的設(shè)計(jì)要兼顧多個(gè)有效成分。同時(shí)，劑量不同藥動(dòng)學(xué)特征也有可能不同，綜合上述問題，有時(shí)則必須進(jìn)行多個(gè)臨床試驗(yàn)[29]。因此，建立符合多組分、多靶點(diǎn)相互作用的專屬性藥代動(dòng)力學(xué)研究與技術(shù)評(píng)價(jià)體系成為當(dāng)前中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究的首要任務(wù)，將為中藥創(chuàng)新與現(xiàn)代復(fù)方中藥研發(fā)及臨床合理用藥提供有力工具。