鐵皮石斛提取物促進(jìn)肌肉損傷修復(fù)作用的機理研究＊

田林娜，李亦凡，林丹丹，范昌健，吳 鵬，盧 娟，陳際名，馬 嘯,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)體育學(xué)院 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院普洱茶學(xué)教育部重點實驗室昆明 650201；3.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院 昆明 650201）

鐵皮石斛是多年生蘭科草本植物，是一種較為常見的中草藥，近年來受到諸多媒體的關(guān)注后，具有較高的認(rèn)知度和知名度。鐵皮石斛的入藥部位多為莖部，高度大約在15-30 cm之間，直徑3-7 mm，比較常見的形態(tài)為干燥后經(jīng)加工成為團狀，俗稱“鐵皮楓斗”[1,2]。鐵皮石斛中的多糖類組分、石斛堿、芪類及其衍生物、生物堿、氨基酸、微量元素及揮發(fā)性成分（烴類、醛類、酮類、烯烴類、醇類、酯類等）等有較強的天然活性，具有增強免疫力、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等功效，近年來關(guān)于鐵皮石斛的新功效開發(fā)工作也在蓬勃開展。

近年來，隨著我國大眾體育與全民健身浪潮的興起、社會體育的推廣力度和收接受程度日益加深，人民群眾參與社會體育活動的熱情高漲，豐富的體育項目與運動方式為其提供多種選擇。然而，不同類型的體育項目，其運動強度的不同，勢必會對運動者機體帶來不可避免的疲勞和損傷現(xiàn)象。EGFR（epidermal growth factor receptor）是一種糖蛋白，是表皮生長因子受體（HER）的一種，上皮生長因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的酪氨酸激酶型受體。廣泛分布于哺乳動物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，EGFR信號通路對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。EGFR作為細(xì)胞生長因子的一種參與了骨骼肌再生過程，并且發(fā)揮了重要的再生修復(fù)作用。根據(jù)2010年版《中華人民共和國藥典》記載，鐵皮石斛主治筋骨痿軟，骨骼肌是重要的運動器官，隨著近年來大眾運動健身習(xí)慣的養(yǎng)成，肌肉損傷預(yù)防和損傷恢復(fù)成了非常受關(guān)注的領(lǐng)域[3-5]。EGFR作為細(xì)胞生長因子的一種參與了骨骼肌再生過程，并且發(fā)揮再生修復(fù)的作用[3-5]。因此，本研究將明確鐵皮石斛水提物對C2C12細(xì)胞和骨骼肌組織中EGFR的調(diào)控作用為目標(biāo)，探明其對肌肉損傷修復(fù)作用的機理具有較強的科學(xué)價值和現(xiàn)實意義。。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

C2C12小鼠成肌細(xì)胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)，細(xì)胞形態(tài)貼壁，保管條件為90%FBS(胎牛血清，fetal bovine serum)+10%DMSO（二甲基亞砜，Dimethyl sulfoxide）中液氮凍存，在37℃，5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中無菌恒溫培養(yǎng)。

實驗動物選擇采用雄性SD大鼠，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，周齡為8-10周，體質(zhì)量150±10 g。飼育條件：動物房溫度24℃，相對濕度50-60%，外周做隔音處理，正常環(huán)境噪音小于80分貝，24小時循環(huán)通風(fēng)換氣，光周期的控制為12小時(明)/12小時(暗)，解剖實驗操作前禁食12小時,自由飲水。

選用的鐵皮石斛原料購于北京云中子商貿(mào)有限公司，原產(chǎn)于云南省普洱市。石斛水提取物提取工藝為，首先使用粉碎機將鐵皮石斛進(jìn)行粉碎處理，按照料液比1∶30,80±10℃熱水浸出1小時后，使用雙層醫(yī)用紗布進(jìn)行過濾處理，濾渣保留，按照1∶30、1∶20、1∶10的料液比反復(fù)熱水浸出3次，之后將全部濾液合并后做離心處理，取上清液；減壓濃縮至原液體積的1/6-1/8后，放入冰箱-20℃冷凍處理；使用真空冷凍干燥機對冷凍后的濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到干燥鐵皮石斛提取物，含水率低于2.5%，產(chǎn)率為15-20%。實驗用主要藥品和試劑：EGFR抗體（CellSignalingTechnology）、抗壞血酸（維生素C）[6]（阿拉丁）、乙腈（美國TEDIA）、三氟乙酸（德國MERCK）、鹽酸（阿拉?。?、氫氧化鈉（阿拉?。?。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及劃痕實驗

在細(xì)胞培養(yǎng)板中將C2C12細(xì)胞接種,先使用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，至60-70%細(xì)胞出現(xiàn)匯合后,倒掉培養(yǎng)液,使用PBS進(jìn)行2次清洗，然后加入含2%馬血清的DMEM分化培養(yǎng)液進(jìn)行分化,體外分化培養(yǎng)C2C12細(xì)胞5天后，進(jìn)行饑餓后加鐵皮石斛提取物處理，實驗分為空白對照組和不同濃度鐵皮石斛提取物組，濃度分別為20、40、80、160 ug?mL-1。處理后提取細(xì)胞蛋白，用于Western blot分析。

劃痕實驗前，確認(rèn)每板細(xì)胞計數(shù)為2.5×107個。在培養(yǎng)皿中用無菌槍頭在每板內(nèi)沿圓心畫一條“一”字，將其分為均勻的兩個部分，劃線筆直無傾斜。并在培養(yǎng)皿底部作上分區(qū)標(biāo)記，以便拍照觀察。使用磷酸緩沖鹽溶液沖洗一遍培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞，去除劃痕劃下的細(xì)胞。此時記為0 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞情況并拍照，拍照完成后，進(jìn)行加藥處理，并將培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)2 h后于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照[7-9]。

1.2.2 骨骼肌孵育及處理

對大鼠進(jìn)行頸椎脫位處理后，將其肌肉迅速平緩地從體內(nèi)取出。肌肉的兩端用縫合線捆綁，固定在孵育裝置上，靜息張力設(shè)定為0.5 g，肌肉在7 mL Krebs Ringer碳酸氫鹽緩沖液（KRB）中預(yù)孵育30分鐘，向緩沖液持續(xù)通入95%O2-5%CO2的混合氣體，并保持溫度在37℃。首先進(jìn)行30分鐘預(yù)孵育，目的是消除手術(shù)過程中對肌肉組織本身直接進(jìn)行物理接觸刺激帶來的應(yīng)激性變化，使肌肉組織內(nèi)各生理水平盡量恢復(fù)到接近于在體內(nèi)的正常狀態(tài)。預(yù)孵育結(jié)束后，之后將肌肉在含有指定濃度鐵皮石斛提取物的7 mL新鮮緩沖液中孵育30分鐘，以檢測目標(biāo)試劑對大鼠離體肌肉的刺激效果。然后，刺激后肌肉組織立即凍結(jié)保存，用于Western blot分析[10]。

1.2.3 Western Blot檢測

對凍存的細(xì)胞樣本和肌肉組織樣本進(jìn)行，進(jìn)行BCA蛋白定量，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上配制8%的凝膠，根據(jù)蛋白定量結(jié)果加樣本量，121 V恒壓電泳90 min。轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，5%BSA封閉1 h。1∶1000稀釋蛋白抗體（一抗），封閉后加入一抗4℃搖床過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜3次，每次10 min，再在封閉液中加入二抗(1∶5000-10000辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體)，室溫1.5 h。再用PBST洗膜3次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯色，曝光機中進(jìn)行曝光。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件ANOVA進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01有明顯顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛水提物對C2C12細(xì)胞遷移率的影響

圖1 鐵皮石斛水提物對C2C12細(xì)胞遷移率的影響

C2C12細(xì)胞在經(jīng)過不同濃度鐵皮石斛水提物2 h處理后，鐵皮石斛水提物（80 ug·mL-1）組的細(xì)胞遷移率明顯上升（圖1.F），與空白對照組相比有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。鐵皮石斛水提物40ug·mL-1及160 ug·mL-1組的細(xì)胞遷移率略高于空白對照組，但差異不明顯（圖1.D、H）。綜上所訴，鐵皮石斛水提物在處理細(xì)胞2小時對細(xì)胞的遷移效果有一定的促進(jìn)效果，此效果與鐵皮石斛水提物的濃度有關(guān)。

圖2 鐵皮石斛提取物處理2 h后C2C12細(xì)胞中EGFR中蛋白表達(dá)的影響

2.2 鐵皮石斛水提物對C2C12細(xì)胞EGFR表達(dá)量的影響

EGFR是一種糖蛋白，屬于ErbB受體家族的一種，為酪氨酸激酶型受體。廣泛分布于哺乳動物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，EGFR信號通路對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。因此，我們利用蛋白免疫印跡法對C2C12細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)進(jìn)行分析[11]。

實驗結(jié)果表明，經(jīng)鐵皮石斛提取物處理后C2C12細(xì)胞中EGFR與對照組相比有顯著上升(圖2)。這個結(jié)果說明，鐵皮石斛提取物能夠有效調(diào)控EGFR蛋白的表達(dá)，從而起到促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖的作用。

2.3 鐵皮石斛水提物對骨骼肌組織EGFR表達(dá)量的影響

為了進(jìn)一步研究鐵皮石斛水提物能否增加骨骼肌組織中EGFR表達(dá)水平，利用骨骼肌組織離體孵育實驗體系（圖3），我們用含有鐵皮石斛水提物的緩沖液對骨骼肌組織進(jìn)行孵育處理，通過實驗，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，骨骼肌組織經(jīng)過鐵皮石斛水提物處理后其EGFR表達(dá)量顯著上調(diào)（圖4）。

3 討論與結(jié)論

圖3 骨骼肌組織離體孵育實驗體系示意圖

圖4 鐵皮石斛提取物處理后骨骼肌組織中EGFR中蛋白表達(dá)的影響

伴隨著全面健康熱潮，體育愛好者和廣大健身群體在從事體育鍛煉和運動的過程中很容易忽視對鍛煉的強度與時間的把控，不規(guī)范的運動方式及過度長時間體育運動都會導(dǎo)致的運動性疲勞和骨骼肌損傷，此類問題已經(jīng)日益成為運動生理學(xué)、運動醫(yī)學(xué)以及運動訓(xùn)練學(xué)界研究的熱點。同時，因為骨骼肌的疲勞和損傷表觀上無法準(zhǔn)確評估和實施醫(yī)療對策，所以研究而的熱點也是一個難點，運動性疲勞及損傷問題主要以肌肉疲勞及損傷為主，而在體育運動中骨骼肌作為軀干和四肢的主要動員肌群，其疲勞以及損傷的問題極其常見，同時也非常關(guān)鍵。骨骼肌一旦發(fā)生了運動性疲勞和損傷，會造成人體機體的運動支持器官不能有效和穩(wěn)定的支持其機能維持在正常水平上，嚴(yán)重影響了對象人群的生活質(zhì)量和健康預(yù)期。特別是因疲勞形成損傷的肌肉組織如果不能得到有效的恢復(fù)，會直接導(dǎo)致肌肉收縮速度緩慢，效率降低，缺乏正常的伸展與收縮能力。這會造成從事運動人員的動作不規(guī)范，整體不協(xié)調(diào)不連貫，誘發(fā)肌肉二次損傷概率大大升高。同時，運動損傷所帶來的不適感與疼痛感也給人們?nèi)粘Ｉ詈凸ぷ鲙砹藰O大的不便，這也會直接挫傷廣大群眾參與大眾體育活動與全民健身的積極性和熱情。所以，除了積極普及大眾體育項目與指導(dǎo)群眾運動技能之外，通過有針對性的科學(xué)研究，利用各種有效手段及時補充損失的機能，使運動所帶來的骨骼肌損傷能夠快速恢復(fù)，增強體育運動的健康促進(jìn)效果與質(zhì)量，提高人民群眾的整體身體健康水平，已經(jīng)成為國內(nèi)外運動生理學(xué)和運動醫(yī)學(xué)學(xué)者與社會指導(dǎo)員們關(guān)注的焦點之一。近年來科學(xué)應(yīng)用天然植物成分的功效性來預(yù)防骨骼肌疲勞、促進(jìn)損傷恢復(fù)，增強肌肉力量和柔韌性，增加肌肉耐力，提高協(xié)調(diào)控制機體各運動部分的能力，從而使人民身體強健成為一個熱門課題。近些年，世界上很多科研人員和知名制藥企業(yè)都在努力嘗試研究開發(fā)具有抗疲勞、促損傷恢復(fù)以及抗衰老功效的藥物和保健食品，但目前尚未有特別有效的藥物問世。另一方面，傳統(tǒng)中藥越來越受重視，并且有許多藥物都表現(xiàn)出有良好的抗疲勞、促損傷恢復(fù)和抗衰老的效果。大部分的藥物都有抗氧化、促新生的成分，具有清除因疲勞或老化導(dǎo)致的代謝異常產(chǎn)生過量副產(chǎn)物自由基的功能[12]。

因此，在推進(jìn)全民參與體育運動的大背景之下，針對肌肉疲勞和肌肉拉傷等常見的運動損傷形式，需要一種安全并有效的方法來緩解和抑制此類情況的發(fā)生。隨著經(jīng)濟發(fā)展、生活水平的提高和老齡化社會的到來，亞健康問題越來越嚴(yán)重，人們對養(yǎng)生保健的關(guān)注度也在逐漸增加，對保健食品的需求也愈加旺盛[13,14]。現(xiàn)在，鐵皮石斛保健食品功能中以增強免疫和緩解體力疲勞進(jìn)而擁有較高的知名度和市場占有率，得到消費者的普遍認(rèn)可。深度研究鐵皮石斛功效機理，明確其功效機制，針對運動人群和亞健康人群的不同需求，開發(fā)出具有針對性的保健食品，可以開拓鐵皮石斛保健食品未來發(fā)展的新空間。

當(dāng)前世界推崇綠色食品、綠色運動，提倡綠色健康的生活方式，但是運動所產(chǎn)生的肌肉損傷問題一直是人們不可回避的難題，本實驗明確一定濃度的鐵皮石斛水提物能夠上調(diào)C2C12細(xì)胞和肌肉組織中EGFR的表達(dá)水平，并能促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖，這個研究發(fā)現(xiàn)在健康問題備受關(guān)注的現(xiàn)代，很可能成為解決運動引起的肌肉損傷問題的一個契機和重要線索[15-17]。

中醫(yī)藥越來越受到國際的普遍認(rèn)可，而中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)保健食品也必將成為未來國際市場的熱點。下一步，我們將繼續(xù)深入開展鐵皮石斛活性成分及相關(guān)功能的基礎(chǔ)研究，目標(biāo)定位于開發(fā)出具有明確功效成分、確切功效靶點的相關(guān)產(chǎn)品，使鐵皮石斛相關(guān)保健產(chǎn)品得到越來越多國內(nèi)外消費者的青睞。