基于質譜的蛋白質激酶-小分子相互作用研究進展＊

陳 津，王方軍

（1.福建厘科大學臨床分子診治研發(fā)中心，福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 泉州 362000；2.中國科學院分離分析化學重點實驗室，中國科學院大連化學物理研究所 大連 116023）

正常細胞中蛋白質激酶受到嚴格調控，蛋白質激酶表達量和活性發(fā)生變化將引起細胞生物學過程的紊亂甚至導致癌癥等惡性疾病的發(fā)生。早在20世紀70年代末期，科研人員就發(fā)現了激酶和癌癥的聯(lián)系，激酶活性不受控制將會引起細胞性狀發(fā)生改變最終導致疾病[1-3]。利用靶向小分子抑制劑或激動劑對特定蛋白質激酶的活性進行特異性調控能為相關疾病提供有效的治療方案，小分子抑制劑也成為了目前最重要的抗腫瘤藥物之一。截止2017年，共有38種小分子激酶抑制劑類藥物獲美國FDA批準并應用于臨床。目前已經有5000多種蛋白質激酶和蛋白質激酶-抑制劑復合體的晶體結構被成功解析，極大促進了人們對抑制劑作用機理的理解并為新型小分子抑制劑藥物的設計合成提供了重要參考。靶向激酶的小分子抑制劑是生命健康領域的一個重要研究熱點，探究蛋白質激酶與小分子相互作用機制可以為各種疾病治療藥物的設計研究提供重要指導[4]，包括腫瘤[5]，神經學[6]，免疫學[7]，心臟病[8]和傳染病[9]等。

1 蛋白質激酶和小分子抑制劑簡介

蛋白質激酶是一類能將底物蛋白質磷酸化的磷酸基轉移酶，將ATP上的γ磷酸基團轉移到底物蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上[10]。蛋白質磷酸化在細胞信號的傳導中起著至關重要的作用，直接影響著蛋白質的功能、相互作用和信號通路，對細胞的生長、增殖、代謝、轉錄、分化、衰亡等過程產生重要影響。人類基因編碼中有518種蛋白質激酶[11]，可分為傳統(tǒng)型和非典型蛋白質激酶。傳統(tǒng)型激酶（478種）可劃分為AGC、CAMK、CK1、CMGC、STE、TK和TKL等激酶家族。剩余的40種激酶可歸屬于13個非典型激酶家族[12]。不同家族的激酶針對不同類型的蛋白質底物，在信號通路中的功能也有顯著差異。根據磷酸化作用的蛋白質不同，還可將蛋白質激酶分為絲氨酸/蘇氨酸蛋白質激酶STK（serine/threonine-specific protein kinase）和酪氨酸蛋白質激酶TPK（tyrosine-specific protein kinase）。在人源蛋白質激酶中有約80%屬于STK激酶[11]。

表1 靶向蛋白質激酶的小分子抑制劑的分類

蛋白質激酶結構有較大相似度，尤其是其催化活性結構域高度保守。在此區(qū)域中含有主要由β-折疊（β-sheet）構成的N-lobe區(qū)域和主要由α-螺旋（α-helix）構成的C-lobe區(qū)域。ATP結合在兩者構成的溝狀區(qū)，并且和N-lope和C-lope之間有相互作用。除此之外，ATP還和蛋白質激酶其他結構保守的區(qū)域有相互作用，比如連接N-lope和C-lope的鉸鏈區(qū)（hinge region），磷酸基團結合環(huán)（phosphate-binding loop，P-loop），活化環(huán)（activation loop），催化環(huán)（catalytic loop）等[13,14]。通常，hinge region能與ATP中的腺苷有氫鍵等相互作用；P-loop中含有保守序列GXGXФG（Ф為苯丙氨酸或者酪氨酸），能靈活靠近ATP并與磷酸基團發(fā)生作用[15]?；罨h(huán)末端還存在一個保守的DFG（Asp-Phe-Gly）序列區(qū)域。

小分子激酶抑制劑是一類可以靶向結合并調控蛋白質激酶活性的小分子化合物，根據他們相互作用機制的不同，可以將小分子抑制劑分成六種類型（表1）[16]。Type I抑制劑結合“DFG-in”構象狀態(tài)下的蛋白質激酶（即天冬氨酸和苯丙氨酸指向ATP結合位點）；Type II抑制劑結合“DFG-out”構象下未被激活的蛋白質激酶。以上這兩種類型抑制劑都是通過競爭占據ATP的結合位置達到抑制酶活性的目的，屬于ATP競爭型抑制劑。Type III抑制劑的作用位點十分接近ATP結合區(qū)域；而Type IV抑制劑的作用位點偏離ATP和底物的結合區(qū)域。這2種抑制劑都是天然的別構型抑制劑，通過結合激酶蛋白質非ATP結合區(qū)域調節(jié)蛋白質結構從而實現激酶活性調控。因為所有蛋白質激酶均具有序列結構高度保守的ATP結合區(qū)，ATP競爭型抑制劑往往特異性較差。為了選擇性結合并調控某一特定的蛋白質激酶，發(fā)展別構型抑制劑是提高調控選擇性的關鍵。Type V抑制劑（也稱作bivalent inhibitors）通常連接著激酶結構域中兩個不同的區(qū)域，以Src激酶為例，它的type V抑制劑一端是ATP類似物另一端是非底物配體雙磷酸化肽段，分別結合激酶的ATP結合區(qū)域和SH2結合域從而抑制激酶活性[17]。以上這五類抑制劑主要通過氫鍵、鹽橋鍵、疏水相互作用等非共價作用力靶向蛋白質激酶，屬于可逆型小分子抑制劑。Type VI抑制劑與上述種類抑制劑不同，是通過共價鍵與激酶相連的不可逆抑制劑。

目前通過FDA批準的激酶小分子抑制劑藥物中，涉及到多種類型，例如靶向CDK4/6的抑制劑Palbociclib屬于Type I；靶向B-Raf的抑制劑Dabrafenib屬于Type II；靶向MEK1/2的抑制劑Trametinib屬于Type III；靶向FKBP12/mTOR的抑制劑Temsirolimus屬于Type IV；靶向BTK的抑制劑Ibrutinib屬于Type VI等。然而，這些抑制劑的使用經常會伴隨一些副作用的產生，包括血球減少、皮膚病、消化系統(tǒng)異常、抑郁癥、肺病等[18]。因此，研究激酶與小分子抑制劑的相互作用機制，開發(fā)新型高效無副作用的抑制劑仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)。

2 基于質譜的蛋白質激酶和小分子抑制劑相互作用研究

X射線晶體衍射（X-ray diffraction,XRD）[19,20]、冷凍電鏡（Cryo-electron microscopy,Cryo-EM）[21,22]和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）[23-25]等分析方法已經被廣泛用于蛋白質激酶和小分子相互作用機制研究，但這些常規(guī)分析方法對蛋白質樣品的用量和純度要求較高、樣品制備困難、分析通量較低。近年來，一系列基于質譜技術的蛋白質-小分子相互作用分析方法得到快速發(fā)展（表2），這些方法具有靈敏度高、通量高、樣品制備簡單、可確定相互作用位點等特點，已經成為傳統(tǒng)分析方法的重要補充。本綜述主要針對基于質譜的蛋白質激酶-小分子相互作用普適性分析方法的主要研究進展。

2.1 氫氘交換-質譜分析方法

氫氘交換質譜分析（hydrogen-deuterium exchangemass spectrometry,HDX-MS）是指利用氘代溶劑（D2O，CH3OD等）與樣品蛋白質分子上的氫原子發(fā)生互換，并通過質譜檢測酶解肽段質量偏移確定發(fā)生氫氘原子交換的蛋白質序列位置[26]。一般容易發(fā)生氫氘交換的氫原子多位于蛋白質與溶液的接觸界面，比位于蛋白質結構內部或參與氫鍵形成的氫原子的交換速率更快，可以根據氫氘交換速率的不同探測蛋白質的結構及動態(tài)變化[27]。當小分子抑制劑與激酶結合時，會影響結合位置的氫原子的氫氘交換速率，通過氫氘交換速率的變化可以探究小分子和激酶的相互作用區(qū)域及強度。HDX-MS具體操作流程主要分成以下幾個步驟[28]：分別讓蛋白質和蛋白質-抑制劑復合物與氘代試劑混合實現氘代標記；在一定交換時間后通過酸化水溶液（pH2.5）實現蛋白質變性并盡量維持在0℃左右終止氫氘交換反應；進行蛋白質酶解并對酶解肽段混合物進行色譜串聯(lián)質譜連用（LC-MS/MS）系統(tǒng)進行分析。根據實驗獲得肽段質量偏移隨著時間的變化曲線可以解析抑制劑存在的情況下蛋白質的動態(tài)變化。除了蛋白質或者蛋白質-小分子復合物本身結構的性質之外，影響氫氘交換速率的還有溶液的pH、溫度等因素[29]。

HDX-MS作為蛋白質結構和相互作用動力學研究的一個有效工具，已經被成功用于蛋白質激酶與小分子（如ATP及其類似物、核酸小分子、藥物小分子等）相互作用機制分析[30,31]。Marshall等人將該技術用于研究藥物imatinib、sunitinib與產生抗藥性的激酶receptor tyrosine kinase（KIT）的相互作用機理，發(fā)現蛋白質激酶突變體D816H使KIT變成活性形式從而無法與抑制劑結合；而突變體V560D有兩種低能量結構，一種結構松散類似于D816H，一種結構相對緊湊，類似于野生型KIT，受到這兩種低能量結構的影響，抑制劑對突變體V560D的抑制效果介于野生型和突變體D816H之間[32]。Zhang等人將HDX-MS用于別構抑制劑GNF-2與酪氨酸激酶Bcr-Abl的結合位置和相互作用機理研究[33]。氫氘交換質譜分析主要缺點是在樣品酶解、色譜分離、質譜離子化等過程中存在明顯的氫氘原子回交現象，這將顯著影響分析的準確性，限制了該方法的應用。并且，此方法對樣品預處理和色譜分離等條件控制較為嚴格，例如必須低溫操作降低回交現象，從而極大影響了蛋白質樣品的酶解效率、肽段色譜分離分辨率等[26]。

2.2 共價化學標記-質譜分析方法

交聯(lián)質譜分析（cross-linking combined with MS，XL-MS）是近年來迅速發(fā)展的研究蛋白質結構和相互作用的質譜分析技術。交聯(lián)反應包括將一個蛋白之內或者兩個蛋白之間功能基團通過化學交聯(lián)試劑共價連接，蛋白質酶解后對發(fā)生交聯(lián)反應的肽段進行富集和分離鑒定從而確定空間上相鄰的兩個交聯(lián)位點[34]。通常來說，交聯(lián)試劑由一個特定長度的間隔臂連接著兩個功能基團，這兩個基團根據性質可與蛋白質的賴氨酸、半胱氨酸或其他氨基酸發(fā)生共價化學反應[35]。蛋白質交聯(lián)后可直接進入質譜分析，比如Nazabal和Wenzel考察了抑制劑PKF17、PKF118等對蛋白復合物tymidin kinase/TCf4/β-catenin的影響[36]。此外，還可以通過對交聯(lián)的蛋白質進行酶解，對酶解后的交聯(lián)肽段進行分析。酶解后的肽段混合物在進入液相色譜串聯(lián)質譜分析之前，往往還會采用富集或分離手段（如體積排阻色譜[37]，離子交換色譜[38]，親和標簽富集[39,40]等）對交聯(lián)肽段進行富集從而降低樣品的復雜程度。交聯(lián)質譜分析方法已被成功用于研究蛋白磷酸酶PP2A復合物結構[41]和進行內源性蛋白質復合物的深度覆蓋分析[42]。

基于活性的蛋白質組分析[43]（activated-based probe profiling，ABPP）是應用化學探針（activated-based probe，ABP）靶向蛋白質中有特定結構和生物活性的區(qū)域。該化學探針由反應基團、報告基團和將二者相連的聚乙二醇鏈或者碳鏈組成，反應基團一般是親電小分子，用于選擇性結合蛋白酶的活性中心，報告基團可以是熒光基團、生物素基團或者是用于引入新基團的正交反應基團等[43,44]。Cravatt實驗室將小分子碎片結合親電基團作為親電試劑，靶向結合蛋白質中的活性半胱氨酸位點。為了得到該小分子與蛋白質的相互作用信息，還需引入化學探針（該化學探針可通過“點擊”反應引入輕重標簽）[45]。具體過程如下：將樣品分成等量的兩份，一份加入親電試劑隨后加入化學探針與之反應，另一份直接加入化學探針處理。而后分別引入輕重標簽后混合，富集，酶解，液相色譜串聯(lián)質譜分析。此時，先與親電試劑結合和直接與化學探針結合的活性半胱氨酸位點所在的肽段的質譜強度存在顯著差異，根據所在肽段定量的比值來判斷小分子與蛋白質的相互作用，從而為抑制劑的設計等提供指導[45]。例如，該方法證明了親電試劑靶向MAP3激酶MLTK的第22位的活性半胱氨酸的位點會抑制該激酶的活性并且還能夠得到產生相互作用的小分子等[45]。

以上共價化學標記方法中所采用的化學反應試劑存在分子尺寸較大，難以標記位阻較大的蛋白質微觀結構區(qū)域；并且所采用的標記反應如針對賴氨酸側鏈氨基的酰胺化等反應會嚴重影響相應蛋白質的電荷分布、結構和活性[46,47]，標記后的蛋白質基本上都失去生理活性。

針對上述共價化學標記的方法的不足，Zhou等人發(fā)展了基于賴氨酸側鏈二甲基化的活性標記方法用于研究蛋白質復合物中的賴氨酸近程微環(huán)境（Lysine Proximal Microenvironment，圖1）。由于標記試劑分子量小，能對蛋白質復合物中的全部賴氨酸進行結構特異性差異標記；由于該反應不影響蛋白質電荷情況，在標記后蛋白質仍然能夠保持生物學活性；從而實現了大分子量蛋白質復合物（700 kDa）內部蛋白質相互作用的系統(tǒng)分析[48]。Linden等人根據1252個激酶-配體的晶體結構得到85個與配體結合位點相關的激酶保守序列的氨基酸[12]，發(fā)現甘氨酸、賴氨酸等氨基酸在保守區(qū)域的多個位點均有分布，對賴氨酸近程微環(huán)境的分析有利于蛋白質激酶尤其是保守區(qū)域與小分子的相互作用的研究。并且，在生理條件下蛋白質中的賴氨酸一般帶正電荷，與鄰近氨基酸殘基間的相互作用如靜電相互作用、氫鍵等是調節(jié)蛋白質結構和蛋白-蛋白相互作用的關鍵因素之一。小分子抑制劑常與激酶的賴氨酸殘基相互作用從而更好地靶向蛋白質激酶并抑制其活性，例如抑制劑MK2206、PIA23分別與AKT1激酶的K268[49]、K14[50]位點；抑制劑Imatinib與ABL1激酶的K271位點[51]；抑制劑MP7與PDK1激酶的K111位點[52]等都存在相互作用。分析賴氨酸近程微環(huán)境相互作用對于研究蛋白質及蛋白質復合物的結構和功能調控機理具有重要作用，在研究蛋白質激酶和小分子相互作用上表現出極大的潛力。

2.3 基于蛋白質熱穩(wěn)定性的質譜分析方法

蛋白質的結構隨著溫度的升高發(fā)生改變，由此可以得到關于蛋白質的熱熔解曲線（thermal melting curve），當小分子結合蛋白質時會引起蛋白質穩(wěn)定性的變化從而影響其熱熔解曲線[53,54]，具體表現在熱熔解曲線發(fā)生偏移（cellular thermal shift assay，CETSA）[55]。

圖1 基于二甲基化標記的活性標記方法研究賴氨酸的近程微環(huán)境

蛋白質隨著溫度的升高會發(fā)生變性隨后發(fā)生聚沉[56]，這將導致在磷酸鹽緩沖液中的溶解該蛋白質的量逐漸減少[55-57]。Mikhail等人依據這點特性，通過定量標記試劑TMT標記溶解的蛋白質組樣品，結合液相色譜串聯(lián)質譜，實現一次進樣同時分析蛋白質的十個溫度點的熱穩(wěn)定性，得到蛋白質的熱熔解曲線。通過對比蛋白質和蛋白質-小分子的熱熔解曲線的偏移，高通量的篩選小分子或藥物在活細胞中的作用底物蛋白質[58]。例如，為蛋白質激酶抑制劑十字孢堿（staurosporine）確定了50多個靶點蛋白質（如激酶PKN1，AURKA）。此外，Huber等人也利用蛋白質的熱穩(wěn)定性的變化得到甲氨喋呤等小分子的靶向底物[59]?；跓岱€(wěn)定性的方法能夠得到小分子與蛋白質在細胞內的相互作用信息，這更能反應蛋白質實際的生理環(huán)境?？偠灾?，這種檢測熱穩(wěn)定性變化的方法能有效鑒定藥物的靶向蛋白質底物，有助于系統(tǒng)研究藥物功效和毒性。然而，該方法不能給出藥物與靶向蛋白的具體位點結合信息。

2.4 活性質譜（Native MS）分析

隨著高分辨、高質量檢測范圍質譜技術的快速發(fā)展，質譜已經能對保持活性結構和活性的大分子量蛋白質直接進行分析檢測，分析對象通常是純化蛋白質樣品[60]。Jecklin等人將絲裂原活化蛋白質激酶MAPK14和酪氨酸激酶LCK（lymphocyte specific kinase）與17種激酶抑制劑結合，并通過質譜信號分析得到抑制劑-激酶的解離常數等[61]。Heck等人結合高分辨率、高精度Exactive Plus Orbitrap分析了分子量150 kDa的蛋白質激酶PKG（cGMP-dependent protein kinase）與小分子cAMP和cGMP相互作用[62]。具體過程為（圖2），PKG與小分子cAMP或cGMP共同孵育，在ATP和鎂離子的參與下PKG發(fā)生磷酸化（圖2A），通過EDTA中止磷酸化修飾，并在低溫（4℃）下置換成可與質譜兼容的醋酸銨溶液（圖2B），隨后將含有活性蛋白激酶-小分子復合物的溶液直接進入高分辨率質譜進行分析，并對得到的高精度譜圖進行數據分析（圖2C，D）。根據分析的結果，cAMP和cGMP可分別使PKG發(fā)生高達13和6個的磷酸化修飾[62]。然而，該方法無法直接確定發(fā)生修飾的具體位點，需要通過對蛋白質進行酶解再根據酶解的肽段的液相色譜串聯(lián)質譜分析（即“自下而上”的蛋白質組學分析）方法來確定具體修飾位點[62]。

圖2 Native MS分析蛋白質激酶和小分子相互作用

表2 基于質譜的蛋白質激酶-小分子相互作用的方法

2.5 限制性蛋白質酶解

蛋白質酶解切過程中需要底物蛋白質匹配蛋白酶活性位點的誘導機制形成水解反應過渡態(tài)。當活性蛋白質區(qū)域結構不能被蛋白酶識別，例如與小分子相互作用或發(fā)生蛋白質折疊，則該蛋白質區(qū)域不能被蛋白酶完全水解，即發(fā)生限制性蛋白質水解（limited proteolysis，LiP）[63]。通過研究活性蛋白質與小分子結合前后的酶切區(qū)域和效率差異即可得到部分小分子與蛋白質的相互作用區(qū)域和強度信息。Picotti等人利用限制性蛋白質酶解結合酶解產物質譜分析對蛋白質不同生理狀態(tài)結構變化及其與小分子相互作用進行了高通量分析[64,65]。當小分子結合活性蛋白質時阻礙了蛋白酶（proteinase K）水解小分子相互作用區(qū)域，從而顯著降低該蛋白質區(qū)域的酶解效率。限制性酶解完成后將蛋白質變性并用蛋白酶充分酶解,通過質譜定量分析構象不同區(qū)域對應的肽段，從而推斷出蛋白質與小分子的相互作用區(qū)域。通過此方法，Picotti等人發(fā)現了未被報道的PfkB激酶的抑制劑磷酸烯醇丙酮酸鹽、檸檬酸鹽和鳥苷三磷酸[65]。限制性蛋白水解的方法可以用來測試藥物與蛋白質的相互作用情況并確定藥物的作用區(qū)域，但是對酶解條件的控制要求較為嚴格。

3 總結和展望

蛋白質激酶在生命過程中發(fā)揮著重要作用，許多惡性疾病如腫瘤的產生與蛋白質激酶密切相關，人們對設計研發(fā)靶向蛋白質激酶的新型小分子抑制劑的要求十分迫切?；谫|譜的分析方法能夠全面、系統(tǒng)、準確地研究蛋白質激酶-小分子相互作用，并給出作用位點（或區(qū)域）和作用強度等信息，從而更好的為藥物的設計和疾病的治療提供幫助。隨著技術的發(fā)展，基于質譜的分析手段將不斷的發(fā)展和完善，必定會極大地推動蛋白質激酶-小分子相互作用分析研究，從而更好的為人類的健康服務。