高分辨采樣二維液相色譜法同時(shí)測(cè)定金銀花中綠原酸和木犀草苷含量

王智聰, 傅榮杰, 吉建國(guó), 陳 波

(安捷倫科技(上海)有限公司, 上海 200131)

中藥化學(xué)成分是中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),中藥化學(xué)成分分析是中藥藥效物質(zhì)闡明及質(zhì)量控制的關(guān)鍵。中藥化學(xué)成分復(fù)雜,傳統(tǒng)的一維色譜法往往不能提供足夠的分辨率和峰容量,色譜峰重疊現(xiàn)象嚴(yán)重,而二維液相色譜法具有分離效果好和峰容量高等特點(diǎn),已廣泛用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中目標(biāo)組分或全組分的分析[1-4]?；谌S液相色譜法無(wú)樣品信息丟失、峰容量高的特點(diǎn),全二維液相色譜法常用于中藥化學(xué)成分的解析,如指紋譜圖分析、中藥物質(zhì)基礎(chǔ)表征、活性成分篩選或痕量雜質(zhì)篩查等[5,6];基于中心切割二維液相色譜法靈活的切割方式,常用于特定目標(biāo)組分的分離分析等[7,8]。傳統(tǒng)的中心切割二維液相色譜法采用大體積樣品環(huán),收集并儲(chǔ)存第一維目標(biāo)組分,可能會(huì)造成第二維色譜柱的嚴(yán)重過(guò)載,導(dǎo)致色譜峰變形、展寬等,也會(huì)出現(xiàn)切割體積超過(guò)樣品環(huán)體積的情況,造成色譜峰丟失,從而影響準(zhǔn)確定量;如果采用捕集柱進(jìn)行捕集,需要考察捕集柱的捕集能力,溶劑效應(yīng)可能會(huì)影響第二維液相色譜的分離,甚至發(fā)生切割組分在捕集柱中不保留等情況[9]。Giddings[10,11]指出,二維液相色譜法中各組分間的分離效率不應(yīng)受后續(xù)分離的影響,而傳統(tǒng)的以大體積樣品環(huán)或捕集柱為接口的二維液相色譜,即使切割組分在第一維已經(jīng)取得較小的分離度,由于在大體積樣品環(huán)或捕集柱接口重新混合,降低了二維系統(tǒng)的整體分離度。

金銀花具有清熱解毒、疏散分熱等功效?！吨袊?guó)藥典》(2015版)一部收錄金銀花,在“含量測(cè)定”項(xiàng)下,對(duì)綠原酸和木犀草苷的含量測(cè)定分別采用不同的高效液相色譜方法[12]。金銀花化學(xué)成分復(fù)雜,基質(zhì)可能干擾目標(biāo)組分的測(cè)定,尤其是共洗脫組分會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的定性和定量造成影響;使用二維液相色譜法可以檢驗(yàn)色譜峰純度,揭示一維分離中可能與目標(biāo)組分共洗脫的隱藏峰[13,14]。

本文利用高分辨采樣二維液相色譜法(HiRes 2D-LC),結(jié)合全二維液相色譜法連續(xù)切割和中心切割二維液相色譜法多次切割的特點(diǎn)[15],對(duì)金銀花樣品第一維分析的綠原酸和木犀草苷進(jìn)行多次高分辨采樣,利用多組小體積樣品環(huán)不間斷收集第一維的目標(biāo)峰,并對(duì)第一維的多個(gè)目標(biāo)組分進(jìn)行“整峰”切割,在第二維實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)組分與雜質(zhì)的分離,為目標(biāo)峰純度的確認(rèn)奠定基礎(chǔ);目標(biāo)組分在切割、轉(zhuǎn)移過(guò)程中也沒(méi)有損失,基于高分辨采樣的定量基礎(chǔ)也更為可信和可靠。相對(duì)于全二維液相色譜中樣品“全信息”的展示,高分辨采樣二維液相色譜法是將第一維分離的部分組分引入第二維,具有較強(qiáng)的針對(duì)性,對(duì)于中藥特定組分的分離確認(rèn)、準(zhǔn)確定量具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

二維液相色譜系統(tǒng)(1290 Infinity II,美國(guó)Agilent公司),包括高速泵(二元泵,G7120A)、全能泵(四元泵,G7104A)、自動(dòng)進(jìn)樣器(G7167B)、柱溫箱(G7116B)、二極管陣列檢測(cè)器(G7117B)、閥驅(qū)(G1170A)、二維接口閥(G4243A)、多中心切割閥(G4242A)、色譜工作站(OpenLAB CDS ChemStation Edition C01.08)和二維色譜軟件(2D-LC Software A.01.04 SR1)等。

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、磷酸(分析純)和乙酸(分析純)(德國(guó)Merck公司);綠原酸和木犀草苷對(duì)照品(純度>98%，上海詩(shī)丹德公司);超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備;金銀花樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幍辍?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取適量綠原酸和木犀草苷對(duì)照品,分別加入適量50%(v/v)甲醇水溶液超聲溶解,分別配制成質(zhì)量濃度為2.0 g/L和1.0 g/L的綠原酸和木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;取適量綠原酸和木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,加入50%(v/v)甲醇水溶液稀釋,配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,綠原酸的質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、100、50、25、10和5 mg/L,木犀草苷的質(zhì)量濃度分別為100、50、25、10、5.0、2.5、1.0和0.5 mg/L。

1.3 樣品前處理

取金銀花樣品適量,粉碎,過(guò)四號(hào)篩;取篩下物約2 g,精密稱(chēng)定,置于具塞錐形瓶中,加入50 mL 50%(v/v)甲醇水溶液,稱(chēng)定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用50%(v/v)甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾,精密量取濾液5 mL,置于25 mL棕色量瓶中,加入50%(v/v)甲醇水溶液至刻度,搖勻,待測(cè)。

1.4 色譜條件

1.4.1第一維液相色譜

色譜柱:ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國(guó)Agilent公司);柱溫:35 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:15 ℃;流動(dòng)相A: 0.4%(v/v)磷酸水溶液;流動(dòng)相B:乙腈;流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 8%B; 1.0～5.0 min, 8%B～14%B; 5.0～6.0 min, 14%B～20%B; 6.0～12.0 min, 20%B～24%B; 12.0～13.0 min, 24%B～95%B; 13.0～18.0 min, 95%B; 18.0～18.1 min, 95%B～8%B; 18.1～23.5 min, 8%B。進(jìn)樣量:2 μL。

圖 1 高分辨采樣二維液相色譜儀的接口示意圖Fig. 1 Interface diagram of high resolution sampling two-dimensional liquid chromatography (HiRes 2D-LC) a. the first dimension (1D) heat cut through Deck A (multiple heart-cutting valve A capillaries), the second dimension (2D) separation through Deck B ; b. 1D heat cut through Deck B, 2D separation through Deck A; ASM: active solvent modulator.

1.4.2第二維液相色譜

色譜柱:ZORBAX RRHD SB-Phenyl柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm,美國(guó)Agilent公司);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相A: 0.5%(v/v)乙酸水溶液;流動(dòng)相B:乙腈;流速:1.8 mL/min。梯度洗脫:0～1.0 min, 10%B～30%B; 1.0～1.1 min, 30%B～10%B。第二維梯度停止時(shí)間(2D gradient stop time): 1.1 min;第二維循環(huán)時(shí)間(2D cycle time): 1.5 min;檢測(cè)波長(zhǎng):350 nm;數(shù)據(jù)采集頻率:40 Hz。

二維色譜采樣模式:高分辨采樣。綠原酸:目標(biāo)峰切割開(kāi)始時(shí)間6.02 min;采樣時(shí)間6 s;切割次數(shù)5次。木犀草苷:目標(biāo)峰切割開(kāi)始時(shí)間10.50 min;采樣時(shí)間4 s;切割次數(shù)4次。

2 結(jié)果與討論

2.1 二維液相色譜儀的接口

二維液相色譜儀的接口可采用二位八通閥或二位十通閥,并配置兩支樣品環(huán),交替儲(chǔ)存、分析第一維切割的組分;二位八通閥的連接流路比較簡(jiǎn)單,但其中一個(gè)樣品環(huán)的收集和洗脫會(huì)出現(xiàn)不同方向的情況;二位十通閥可以保證兩個(gè)樣品環(huán)收集和洗脫方向相同,但收集和洗脫的流路長(zhǎng)短不一致,上述兩種接口均因流路不對(duì)稱(chēng)對(duì)二維液相色譜方法的建立和優(yōu)化有較高要求[16]。Talus等[17]采用二位十通閥接口,發(fā)現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)的流路易造成第二維壓力變化較大,顯著影響二維分析結(jié)果及第二維色譜柱的使用壽命。近期發(fā)展的二位四通雙流路閥可以實(shí)現(xiàn)流路的完全對(duì)稱(chēng),減小閥切換時(shí)系統(tǒng)壓力的變化,進(jìn)一步簡(jiǎn)化了二維液相色譜方法的建立和運(yùn)用。本文采用五位十通閥作為二維接口,如圖1所示,該閥在實(shí)現(xiàn)一維與二維切割組分轉(zhuǎn)移的同時(shí),還可以進(jìn)行“在線稀釋”,即在不增加第三路稀釋溶劑(或泵)的情況下,在線使用第二維溶劑對(duì)切割組分進(jìn)行稀釋,從而減小或消除溶劑效應(yīng)[18,19];其中“在線稀釋”的功能可以打開(kāi)或關(guān)閉，如圖1所示，ASM中毛細(xì)管 6-9 處于旁路位置，“在線稀釋”處于“關(guān)閉”狀態(tài)，此時(shí)該閥相當(dāng)于常規(guī)的二位四通雙流路閥。

傳統(tǒng)的二位八通閥或二位十通閥二維接口配置2支樣品環(huán),高分辨采樣二維液相色譜儀采用具有在線溶劑稀釋功能的ASM閥作為二維接口,并且將傳統(tǒng)的2支樣品環(huán)采用多中心切割閥代替,如圖1所示,兩個(gè)多中心切割閥的樣品環(huán)組件Deck A和Deck B,每個(gè)Deck可配置6支樣品環(huán),這樣高分辨采樣二維液相色譜的接口可擴(kuò)展至12支樣品環(huán)。如圖1a所示,第一維目標(biāo)組分依次儲(chǔ)存于Deck A的樣品環(huán)中,然后閥切換至圖1b所示,第一維目標(biāo)組分繼續(xù)依次儲(chǔ)存于Deck B的樣品環(huán)中;與此同時(shí),第二維流動(dòng)相將儲(chǔ)存于Deck B或Deck A樣品環(huán)中的切割組分依次導(dǎo)入第二維色譜柱進(jìn)行分析。

2.2 金銀花樣品的一維液相色譜分析

在《中國(guó)藥典》方法[12]的基礎(chǔ)上,本文采用HiRes 2D-LC對(duì)金銀花樣品中的綠原酸和木犀草苷組分進(jìn)行峰純度確認(rèn)和含量測(cè)定。第一維采用C18色譜柱,金銀花樣品的一維液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖 2 金銀花樣品的第一維液相色譜圖Fig. 2 1D LC chromatograms of Lonicerae Japonica FlosYellow parts were for 1D multiple target heart cuts.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的二維液相色譜分析

按1.4節(jié)色譜條件,對(duì)綠原酸和木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行二維液相色譜分析(見(jiàn)圖3),其中圖3a為綠原酸5個(gè)切割片段疊加的色譜圖,圖3b為木犀草苷4個(gè)切割片段疊加的色譜圖。

圖 3 (a)綠原酸和(b)木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品的第二維疊加色譜圖Fig. 3 2D overlay chromatograms of (a) chlorogenic acid and cynaroside standard samples

高分辨采樣二維液相色譜法可以對(duì)第一維的目標(biāo)組分或多個(gè)目標(biāo)組分進(jìn)行切割,每個(gè)組分可進(jìn)行一次或多次連續(xù)切割;高分辨采樣模式是基于時(shí)間觸發(fā)的切割方式,在二維方法設(shè)置中,對(duì)各組分設(shè)置切割開(kāi)始時(shí)間、采樣持續(xù)時(shí)間和切割次數(shù)等。本文對(duì)綠原酸的色譜峰進(jìn)行5次切割,每次切割采樣持續(xù)時(shí)間6 s,對(duì)木犀草苷的峰進(jìn)行4次切割,每次切割采樣持續(xù)時(shí)間4 s。第一維的流速為0.2 mL/min,每次切割體積為20 μL,多中心切割閥配置的樣品環(huán)體積為40 μL;對(duì)綠原酸和木犀草苷來(lái)說(shuō),切割體積分別約占樣品環(huán)體積的50%和33%。

2.4 金銀花樣品的二維液相色譜分析

金銀花樣品的二維色譜圖如圖4所示,從圖4a可以看出,綠原酸的5個(gè)切割組分在第二維色譜中均未檢出其他雜峰,說(shuō)明在第一維分離中,綠原酸與雜質(zhì)分離良好,無(wú)共洗脫峰或隱藏峰;從圖4b可以看出,通過(guò)第二維色譜分離,在木犀草苷的第2和第3個(gè)切割組分中均顯示有雜質(zhì)。高分辨采樣二維液相色譜法通過(guò)第二維不同分離機(jī)理或不同選擇性色譜柱的進(jìn)一步分離,提高了目標(biāo)峰與雜質(zhì)的分離度,可用于色譜峰純度的確認(rèn)，或檢查目標(biāo)峰是否包含隱藏的共洗脫雜質(zhì)。

圖 4 金銀花樣品中(a)綠原酸和(b)木犀草苷的 第二維疊加色譜圖Fig. 4 2D overlay chromatograms of (a) chlorogenic acid and (b) cynaroside in Lonicerae Japonica Flos

高分辨采樣二維液相色譜法使用連續(xù)切割的特點(diǎn),可以控制目標(biāo)組分的切割窗口,對(duì)某一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)組分實(shí)現(xiàn)片段式“整峰”切割,從而為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)峰的準(zhǔn)確定量提供技術(shù)基礎(chǔ)。對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行二維液相色譜分析,結(jié)果顯示,在5～1 000 mg/L范圍內(nèi),綠原酸的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)為1.000 00;在0.5～100 mg/L范圍內(nèi),木犀草苷的線性關(guān)系良好,r為0.999 97。

2.5 加標(biāo)回收率的考察

進(jìn)行了兩個(gè)水平的基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)的考察,每個(gè)水平平行制備3份,分析結(jié)果見(jiàn)表1。在低濃度和高濃度加標(biāo)水平下,綠原酸和木犀草苷的平均加標(biāo)回收率為94.0%～101.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.3%,說(shuō)明高分辨采樣二維液相色譜法定量準(zhǔn)確。

表 1 綠原酸和木犀草苷的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.6 重復(fù)性考察

按1.3節(jié)樣品前處理方法制備金銀花樣品提取液,按照1.4節(jié)二維液相色譜條件進(jìn)行分析,重復(fù)分析6次,第二維連續(xù)色譜圖的疊加圖如圖5所示,綠原酸和木犀草苷保留時(shí)間的RSD分別為1.2%和0.6%,峰面積的RSD分別為0.4%和4.3%,說(shuō)明高分辨采樣二維液相色譜法具有優(yōu)異的重復(fù)性。

圖 5 金銀花樣品連續(xù)6次進(jìn)樣的第二維疊加色譜圖Fig. 5 2D overlay chromatogram of Lonicerae Japonica Flos for the six replicates of consecutive Nos. 1-5: chlorogenic acid cuts; Nos. 6-9: cynaroside cuts; F: loop flush.

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

按1.3節(jié)樣品前處理方法制備金銀花樣品提取液,按照1.4節(jié)二維液相色譜條件進(jìn)行分析,樣品測(cè)試液中綠原酸和木犀草苷的質(zhì)量濃度分別為257.3 mg/L和5.9 mg/L,換算為金銀花樣品中綠原酸和木犀草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.2%和0.077%, 《中國(guó)藥典》(2015版)[12]中規(guī)定綠原酸和木犀草苷的量分別不得少于1.5%和0.050%,測(cè)試樣品中指標(biāo)成分滿(mǎn)足其要求。

3 結(jié)論

本文使用高分辨采樣二維液相色譜法對(duì)金銀花中綠原酸和木犀草苷進(jìn)行分析。高分辨采樣二維液相色譜法可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組分的峰純度確認(rèn)和準(zhǔn)確定量分析,該技術(shù)可用于中藥的質(zhì)量控制,以及食品、制藥、生物、環(huán)境等領(lǐng)域復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析。