固相萃取-大體積程序升溫進(jìn)樣氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定飲用水中3種揮發(fā)性N-亞硝胺

李登昆, 張 云, 劉祥萍, 趙士權(quán), 陳春靜, 熊麗林

(南京市疾病預(yù)防控制中心, 江蘇 南京 210003)

N-亞硝胺來源于橡膠、皮革等化工制造業(yè),同時(shí)也是飲用水消毒副產(chǎn)物(disinfection by-product, DBP),對(duì)哺乳動(dòng)物具有強(qiáng)烈的遺傳毒性及致癌性[1-4]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(international agency for research on cancer, IARC)將N-亞硝基二甲基胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)、N-亞硝基甲基乙基胺(N-nitrosomethylethylamine, NMEA)列為2A類致癌物,將N-亞硝基二乙基胺(N-nitrosodiethylamine, NDEA)列為2B類致癌物[5]。世界衛(wèi)生組織建議飲用水中NDMA限量為100 ng/L[6],美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(USEPA)規(guī)定飲水中NDMA、NMEA、NDEA最大容許濃度分為7、20及2 ng/L[7]。

自1989年加拿大安大略省[8]確認(rèn)飲用水中消毒副產(chǎn)物NDMA以來,各國(guó)日益重視飲用水中N-亞硝胺問題,而建立靈敏、準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法也成為研究者關(guān)注的重點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)揮發(fā)性N-亞硝胺的檢測(cè)主要采用氣相色譜(GC)法,常用檢測(cè)器有氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)、氮磷檢測(cè)器(NPD)、熱能分析(TEA)儀及單四極桿質(zhì)譜(Q-MS)。FID[9,10]是通用型檢測(cè)器,定性能力差、方法靈敏度低,NPD[9,11]對(duì)N-亞硝胺的檢測(cè)也存在響應(yīng)低的缺點(diǎn),隨著新技術(shù)的發(fā)展FID、NPD逐漸被取代;TEA[9,12]對(duì)N-亞硝胺具有高度特異性,但應(yīng)用范圍窄且價(jià)格較為昂貴;Q-MS[9,12,13]是早期檢測(cè)N-亞硝胺的主要方式,性能穩(wěn)定、應(yīng)用廣泛,但對(duì)EI源產(chǎn)生無差別的離子碎片甄別困難、假陽(yáng)性干擾難以排除。近年來隨著三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(QqQ-MS/MS)的發(fā)展,氣相色譜與三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用已逐漸成為N-亞硝胺分析的常規(guī)技術(shù)手段,其采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式掃描,具有選擇性好、定性特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)[9,14-18]。

表 1 3種揮發(fā)性N-亞硝胺的理化性質(zhì)

NDMA:N-nitrosodimethylamine; NMEA:N-nitrosomethylethylamine; NDEA:N-nitrosodiethylamine; IARC: International Agency for Research on Cancer; 1 mmHg=0.133 kPa; logKow: octanol-water partition coefficient; logKoc: organic carbon partition coefficient.

由于飲用水中N-亞硝胺的含量極低,多在ng/L的水平[4,19],如何提取、濃縮是困擾研究者的另一難題,目前國(guó)內(nèi)外基本都采用固相萃取再氮吹的方式對(duì)飲用水中亞硝胺進(jìn)行富集、濃縮[9,14,20,21,24],但NDMA、NMEA及NDEA的沸點(diǎn)低、蒸汽壓大、揮發(fā)性強(qiáng),氮吹濃縮極易損失,即便采取添加同位素內(nèi)標(biāo)的方式,回收率依然難以達(dá)到滿意效果[14,20,21]。大體積程序升溫進(jìn)樣(LVI-PTV)技術(shù)使用容納大體積樣品的裝置及可控時(shí)間的溶劑放空裝置,選擇性去除樣品中的大量溶劑,可以實(shí)現(xiàn)痕量目標(biāo)化合物的在線濃縮,避免揮發(fā)性物質(zhì)的損失,簡(jiǎn)化操作步驟,縮短樣品預(yù)處理時(shí)間,同時(shí)提高分析方法的靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度[22,23]。固相萃取-程序升溫進(jìn)樣技術(shù)結(jié)合氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,將是分析飲用水中易揮發(fā)痕量組分的理想手段。3種揮發(fā)性N-亞硝胺的理化性質(zhì)見表1。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890B/7000C,美國(guó)Agilent公司),配備Agilent PAL自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)及Agilent多模式進(jìn)樣口(MMI);全自動(dòng)固相萃取儀(Thermo Fisher AT280,美國(guó)Thermo Fisher公司); Milli-Q水純化系統(tǒng)(Milli-Q Reference,美國(guó)Millipore公司);電子分析天平(ML203/02,瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 試劑與材料

N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品包括NDMA(CAS: 62-75-9)、NMEA(CAS: 10595-95-6)和NDEA(CAS: 55-18-5),純度均大于99.5%,質(zhì)量濃度均為100 mg/L,購(gòu)自美國(guó)o2si公司;甲醇(色譜純)購(gòu)自德國(guó)Merck公司;二氯甲烷(色譜純)和椰殼活性炭SPE小柱(2 g/6 mL, 80～120目)購(gòu)自德國(guó)CNW公司;無水硫酸鈉(分析純,使用前于馬弗爐中450 ℃灼燒4 h,冷卻后密封保存?zhèn)溆?和硫代硫酸鈉(分析純)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑限公司;純水由Milli-Q凈化系統(tǒng)制得。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件

大體積程序升溫進(jìn)樣口,進(jìn)樣方式:溶劑排空進(jìn)樣;進(jìn)樣體積:10 μL;隔墊吹掃流量:3 mL/min;升溫程序:50 ℃保持0.08 min,以600 ℃/min升至325 ℃,保持5 min;溶劑放空模式:到分流出口的吹掃流量:60 mL/min;吹掃時(shí)間:2.58 min;放空流量:100 mL/min;放空時(shí)間:0.08 min;載氣節(jié)省模式下氦氣流速:20 mL/min,等待時(shí)間:5 min。

色譜柱:VF-WAXms柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國(guó)Agilent公司);載氣:He(純度>99.999%);流量:1.2 mL/min。

柱溫升溫程序:初始溫度為50 ℃,保持1 min,以10 ℃/min的速度升溫至110 ℃,再以15 ℃/min的速度升溫至200 ℃,最后以40 ℃/min的速度升溫至250 ℃,保持7 min。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:EI源;傳輸線溫度:250 ℃;離子源溫度:280 ℃;電離能量:70 eV;前四極桿溫度:180 ℃;后四極桿溫度:180 ℃;碰撞池:碰撞氣為N2(純度>99.999%),流速為1.5 mL/min;淬滅氣為He(純度>99.999%),流速為2.25 mL/min;掃描方式:MRM模式;溶劑延遲:5 min。3種揮發(fā)性N-亞硝胺質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表 2 3種揮發(fā)性N-亞硝胺的前級(jí)離子、子離子、碰撞能量(CE)、駐留時(shí)間及豐度

* Quantitative ion.

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液從-20 ℃冰箱取出,置室內(nèi)恒溫后,用甲醇稀釋,配制成2.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液,置于棕色玻璃瓶?jī)?nèi),再用二氯甲烷逐步稀釋,配制成質(zhì)量濃度為100、200、500、1 000、2 000和5 000 ng/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 樣品處理

椰殼活性炭SPE小柱依次用6 mL二氯甲烷沖洗并用氮?dú)獯蹈?用6 mL甲醇沖洗并用氮?dú)獯蹈?用6 mL甲醇及15 mL純水活化平衡,活化平衡過程連續(xù)進(jìn)行并保證SPE小柱液面不干。將1.0 L水樣以10 mL/min的速度通過SPE小柱,萃取完成后氮吹10 min,吹干SPE小柱。用10 mL二氯甲烷分2次(每次5 mL)浸泡洗脫至收集管,洗脫液加入5～8 g無水硫酸鈉脫水,取1.0 mL萃取液上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

對(duì)比了DB-5MS Ultra Inert柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國(guó)Agilent公司)與VF-WAXms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)兩種色譜柱的分離能力,結(jié)果顯示,3種揮發(fā)性N-亞硝胺在兩種色譜柱上于11 min內(nèi)都能獲得良好的分離,但使用VF-WAXms色譜柱可獲得更好的峰形和靈敏度,故本法選擇VF-WAXms色譜柱作為分析柱。兩種色譜柱分離效果見圖1。

圖 1 使用DB-5MS Ultra Inert柱和VF-WAXms 柱時(shí)3種揮發(fā)性N-亞硝胺(10 μg/L)在MRM模式下的總離子流圖 Fig. 1 Total ion chromatograms (TIC) of the three volatile N-nitrosamines (10 μg/L) obtained using the DB-5MS Ultra Inert column and VF-WAXms column in MRM mode DB-5MS Ultra Inert column: initial 35 ℃, hold for 5 min; increase to 250 ℃ at a rate of 20 ℃/min, hold for 5 min; VF-WAXms column: initial 50 ℃, hold for 1 min; increase to 110 ℃ at a rate of 15 ℃/min; rise to 250 ℃ at a rate of 40 ℃/min, hold for 7 min.

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

N-亞硝胺組分經(jīng)質(zhì)譜儀離子化后,通過母離子、子離子掃描方式,篩選出較理想的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子對(duì),再結(jié)合Agilent MassHunter設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)助手與分析實(shí)驗(yàn)助手軟件,優(yōu)化選擇出最佳離子對(duì)、碰撞能量及駐留時(shí)間等,3種揮發(fā)性N-亞硝胺最佳MRM質(zhì)譜參數(shù)見表2, MRM色譜圖見圖2。

圖 2 3種揮發(fā)性N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品(10 μg/L) 的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of the three volatile N-nitrosamines mixed standard (10 μg/L)

CompoundRT/minLinear range/(ng/L)Linear equationr2LOD/(ng/L)LOQ/(ng/L)NDMA8.0451-50Y=22.992X+30.5130.99920.20.7NMEA8.6281-50Y=18.486X+7.0200.99910.060.2NDEA8.9721-50Y=15.437X+9.7730.99990.030.08

Y: peak area;X: mass concentration, ng/L.

2.3 大體積程序升溫進(jìn)樣的優(yōu)化

大體積程序升溫氣化進(jìn)樣,通過增加進(jìn)樣量來提高方法靈敏度,但增大進(jìn)樣量的同時(shí)也會(huì)引入更多的“臟”物質(zhì)進(jìn)入色譜系統(tǒng),造成色譜柱及離子源的污染,故在滿足方法靈敏度的條件下,應(yīng)盡量減少進(jìn)樣體積。本文通過多次試驗(yàn)優(yōu)化進(jìn)樣量,當(dāng)進(jìn)樣體積為10 μL時(shí),可滿足USEPA Method 521[14]最低檢出濃度要求,然后考查初始溫度、排空時(shí)間、升溫速率等各變量因素,大體積程序升溫進(jìn)樣最佳條件見1.3.1節(jié)。

2.4 固相萃取柱的選擇

飲用水中痕量N-亞硝胺的萃取、富集,目前最常用的吸附材料為椰殼活性炭[14,20,24],本文采用80～120目椰殼活性炭SPE小柱進(jìn)行飲用水添加回收試驗(yàn),取得較好試驗(yàn)預(yù)期,結(jié)果見表3。有文獻(xiàn)[16]報(bào)道采用Oasis HLB固相萃取小柱萃取化妝品中10種揮發(fā)性亞硝胺取得滿意效果,但本文采用該固相萃取小柱對(duì)飲用水進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),3種揮發(fā)性N-亞硝胺均未能有效萃取,這與朱翔[24]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。同時(shí),還對(duì)C18固相萃取小柱進(jìn)行了考查,同樣無法有效萃取3種N-亞硝胺。

2.5 洗脫溶劑的選擇及洗脫體積的優(yōu)化

目前國(guó)內(nèi)外主要研究方法中都選用二氯甲烷作為N-亞硝胺的萃取、洗脫溶劑[14,15,20,21,24,25],且相關(guān)研究表明二氯甲烷是最理想的洗脫溶劑[25],故本文選擇二氯甲烷作為洗脫溶劑,并考查了二氯甲烷洗脫體積對(duì)洗脫效率的影響。在飲用水加標(biāo)濃度為50 ng/L時(shí),分別用5、10和15 mL的二氯甲烷進(jìn)行洗脫,3種揮發(fā)性N-亞硝胺平均洗脫效率分別為73.2%～85.8%、103%～109%和92.6%～99.6%,結(jié)果顯示,洗脫量為5 mL時(shí),洗脫不夠充分,洗脫量為10和15 mL時(shí),均可充分洗脫,為避免浪費(fèi)試劑、污染環(huán)境,選用10 mL作為洗脫體積。

2.6 線性范圍與檢出限

配制線性范圍為1～50 ng/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3節(jié)儀器條件測(cè)定,以定量離子峰面積(Y)對(duì)濃度(X, ng/L)繪制線性回歸方程,以3倍信噪比(S/N)為檢出限,以10倍S/N為定量限。本法飲用水取樣量為1.0 L, 3種揮發(fā)性N-亞硝胺組分的保留時(shí)間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)見表3。

2.7 準(zhǔn)確度及精密度

以實(shí)驗(yàn)室自來水作為飲用水樣,加入1.4節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)使用液,充分?jǐn)嚢杌靹?配制成10.0、20.0、50.0 ng/L的加標(biāo)樣品,每個(gè)水平各5份,按照1.5節(jié)樣品萃取程序進(jìn)行預(yù)處理,按1.3節(jié)儀器條件測(cè)定,同時(shí)取純水做空白對(duì)照。以加標(biāo)回收率指標(biāo)考察方法的準(zhǔn)確度及精密度,結(jié)果見表4。加標(biāo)回收率為94.8%～109%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%,說明該方法準(zhǔn)確度和精密度較好。

表 4 3種揮發(fā)性N-亞硝胺在飲用水中3個(gè)添加水平下的加標(biāo)回收率及精密度(n=5)

-: less than LOQ.

2.8 飲用水樣的采集及測(cè)定

參照GB/T 5750.2-2006[26]的相關(guān)采樣規(guī)定,選用1 L具聚四氟乙烯材質(zhì)蓋墊棕色螺紋口玻璃瓶采集樣品,在采樣之前加入0.1 g硫代硫酸鈉固體作為脫氯劑,水樣充滿玻璃瓶后加蓋密封,避光、冷藏運(yùn)輸,送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)及時(shí)完成萃取檢測(cè)。采集本市7家自來水廠的水源水、出廠水、末梢水及市售瓶裝飲用天然水、飲用凈水共27份,進(jìn)行飲用水中3種揮發(fā)性N-亞硝胺含量的測(cè)定。樣品測(cè)定結(jié)果見表5。

表 5 飲用水中3種揮發(fā)性N-亞硝胺含量測(cè)定結(jié)果

-: less than LOQ. WHH, NFSQ, YB, CSL, CY, and GS stand for acronyms of the brand of bottled drinking water.

3 結(jié)論

本文建立了SPE-PTV-GC-EI-MS/MS測(cè)定飲用水中3種揮發(fā)性亞硝胺的方法,采用保留時(shí)間和MRM雙重定性、外標(biāo)法定量,本法選擇性好、靈敏度高、樣品前處理簡(jiǎn)單,線性關(guān)系、加標(biāo)回收率及重現(xiàn)性等方法學(xué)指標(biāo)均較好,是飲用水中揮發(fā)痕量N-亞硝胺組分理想的檢測(cè)技術(shù)手段。