FoxO3基因與膀胱癌臨床病理特征及預后的相關性

楊晗杰，劉各亮，劉波

0 引言

膀胱癌是泌尿生殖道惡性腫瘤，它對人類泌尿生殖系統(tǒng)的危害僅次于前列腺癌，是全球最常見的九大癌癥之一，每年因膀胱癌死亡的人數(shù)不斷上升，引起了人們的廣泛關注[1-2]。膀胱癌的大部分病例為非肌層浸潤性膀胱癌，其中大部分患者預后較好，但容易復發(fā)，復發(fā)后甚至可能進展為肌層浸潤性膀胱癌[3-4]；而其余部分預后不良的病例中死亡率約占50%[5]。對于浸潤性膀胱癌的治療，標準的方法仍以根治手術切除膀胱為主，同時聯(lián)合化療[6]。對于不能耐受或不愿意接受根治手術的患者，可采用膀胱部分切除（電切至腫瘤周圍正常組織1.0 cm）聯(lián)合輔助化療的方法，它的優(yōu)點是膀胱的保留率較高，同時還避免了根治性膀胱切除術后的并發(fā)癥及對生活質量的影響，但臨床分期、病理分級是決定預后的重要因素[7]。目前對于膀胱癌的確切發(fā)病機制尚不清楚，但膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展與染色體異常、表觀遺傳學改變和遺傳多態(tài)性密切相關，其遺傳學改變與其治療及預后密切相關[8-9]。大量研究已經(jīng)證明癌基因和腫瘤抑制因子的表達在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，在膀胱癌的早期檢測和預后中發(fā)現(xiàn)新的生物標志物[10-11]。

叉頭框O類（FoxO）轉錄因子屬于轉錄調控因子的叉頭家族，其特征在于由4個成員即FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6組成的稱為“叉頭框”的保守DNA結構域[12]。研究人員發(fā)現(xiàn)它們參與了細胞周期的調控、凋亡和對活性氧的抗性等多種細胞過程[13-15]。同時，也揭示了這些轉錄因子起到腫瘤抑制因子的作用，有利于干細胞的維持和壽命延長[16]。最新研究報道指出，在癌細胞凋亡過程中，circ-FoxO3被發(fā)現(xiàn)顯著增加，能誘導腫瘤細胞的凋亡[17]。有研究表明FoxO3在許多癌癥如乳腺癌和前列腺癌的發(fā)展中起著非常重要的作用[18-19]。因此，本研究旨在探討FoxO3表達與膀胱癌臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 資料

收集湘雅二醫(yī)院2011年1月—2013年1月期間，術后病理證實為膀胱癌患者的臨床資料及其癌組織及癌旁組織標本111例，男79例，女32例。年齡36～79歲，平均年齡55.23±8.72歲。根據(jù)第7版AJCC癌癥TNM分期[20]，Tis～T1淺表性膀胱癌共63例，T2～T3非淺表性膀胱癌共48例。根據(jù)WHO2004分級法[21]，組織學分型低級別77例，高級別34例。局部淋巴結轉移者33例，無淋巴結局部轉移者78例。全部111例膀胱癌組織作為實驗組，在患者術后，依據(jù)患者的病情及實際情況進行相應的輔助治療，分為根治性膀胱切除術8例，根治性膀胱切除術+GC方案（吉西他濱+順鉑）23例，電切手術+吉西他濱膀胱灌注63例，電切手術+MVAC方案（甲氨蝶呤+長春花堿+阿霉素+順鉑）10例，電切手術+CMV方案（順鉑、甲氨蝶呤和長春新堿）7例。同時取距腫瘤邊緣1～2 cm以上，經(jīng)病理證實為正常膀胱組織的111例癌旁正常組織作為對照組。

納入標準：（1）經(jīng)病理學明確診斷為膀胱癌；（2）具有充分的影像學檢查和臨床檢查支持診斷；（3）出院后患者至少接受過一次隨訪或檢查。排除標準：（1）患有其他腫瘤疾病；（2）接受治療前膀胱癌已有遠處轉移者。本研究通過湘雅二醫(yī)院臨床試驗倫理委員會批準，所有患者均對研究知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量PCR檢測FoxO3 mRNA含量

提取腫瘤及癌旁正常組織中總RNA?？俁NA提取試劑盒購買于北京天恩澤基因科技公司，反轉錄試劑盒購自杭州博日科技有限公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明。使用紫外分光光度計檢測提取后的各RNA樣本的OD260/280值，并計算RNA濃度，置-80℃保存?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）方法測定樣品中FoxO3 mRNA的含量。根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫公開的基因及miR BASE數(shù)據(jù)庫中的基因序列，使用Primer5.0引物設計軟件，通過上海生工公司合成引物。引物序列見表1。PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司，RT-qPCR儀器使用德國ABI公司7500型定量PCR儀。RT-qPCR反應程序如下：95℃預變性30 s，然后按以下條件循環(huán)40次：變性95℃ 5 s，退火/延伸30 s。檢測結果以β-actin為內參照，將目標基因的Ct值與β-actin的Ct值作對比，計算各目的基因mRNA的相對表達量，ΔCt目標=Ct目標-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，以2-ΔΔCt表示兩組目標基因表達量的比值[22]。

表1 RT-qPCR引物序列Table1 Primer sequence of RT-qPCR

1.3 Western blot檢測FoxO3蛋白的相對含量

使用石蠟標本提取蠟塊切片總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取50 μg總蛋白變性后進行SDS-PAGE恒壓電泳，半干法將電泳產(chǎn)物轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，4℃封閉2 h，滴加一抗（兔FoxO3多克隆抗體購于Abcam公司），4℃條件下保存10 h，TBST洗4次，每次10 min，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗（山羊抗兔IgG，Santa Cruz公司），37℃條件下孵育2 h，TBST洗10 min，4次，ECL試劑盒進行顯色，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)自動成像并以β-actin為內參分析FoxO3蛋白的相對含量。

1.4 免疫組織化學染色

采用SP法檢測膀胱癌組織及癌旁正常組織中FoxO3蛋白的表達情況。選用已知正常膀胱組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，HistostainTMSP-9000免疫組織化學染色試劑盒（Zymed公司）染色。常規(guī)脫蠟至水的樣本石蠟切片，微波加熱修復抗原，至沸騰后停止加熱5 min，然后重復加熱一次，冷卻至常溫。切片經(jīng)過PBS沖洗后滴加正常山羊血清。滴加一抗（兔FoxO3多克隆抗體購于Abcam公司），4℃過夜。復溫并用PBS沖洗后，滴加二抗工作液（生物素標記山羊抗兔IgG），37℃下30 min。PBS沖洗后滴加辣根標記工作液孵育，DAB顯色5～10 min，鏡下調整染色時間，蘇木精對比染色1 min后樹膠封片，拷片后拍照保存。鏡下隨機取10個視野，根據(jù)每個視野中陽性細胞數(shù)，陽性染色細胞≤10%為陰性表達；＞10%為陽性表達。

1.5 隨訪

首先對所有患者采用電話隨訪的方式了解其存活情況，隨后對于仍存活的患者再采用門診隨訪。隨訪截至2017年10月。統(tǒng)計5年總生存期和無瘤生存時間?？偵嫫跒槭中g到死亡或最后隨訪時間，無瘤生存時間為手術至腫瘤復發(fā)或轉移。根據(jù)隨訪結果繪制Kaplan-Meier（K-M）生存曲線，比較總生存率和無瘤生存率。所有患者均完成隨訪。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示。服從正態(tài)分布的計量資料兩組之間的比較采用t檢驗和配對t檢驗。使用單因素方差分析進行多組間比較；方差不齊時則行使Welch法，通過Dunnetts’T3檢驗進行組間多重比較。計數(shù)資料用χ2檢驗。預后的單因素分析采用Kaplan-Meier法，采用Log rank檢驗；預后的多因素分析采用Cox模型；相關分析采用Spearman等級法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學結果

FoxO3蛋白主要集中表達于細胞核，細胞質弱表達，呈棕黃色或棕褐色顆粒的陽性反應，見圖1。FoxO3蛋白陽性表達率在膀胱癌組織中為32.4%，低于癌旁正常組織的72.1%（P＜0.05），見表2。

2.2 FoxO3基因的表達結果

與癌旁正常組織相比，膀胱癌組織中的FoxO3 mRNA及其蛋白的表達顯著下降（P＜0.0001），見圖2。

2.3 膀胱癌中FoxO3蛋白與臨床特征的相關性

圖1 免疫組織化學檢測癌旁正常(A)及膀胱癌組織(B)中FoxO3的表達 (×200)Figure1 FoxO3 expression in adjacent normal tissues(A) and bladder cancer tissues(B) detected by immunohistochemical method (×200)

表2 膀胱癌和癌旁正常組織中FoxO3蛋白表達情況Table1 FoxO3 expression in bladder cancer tissues and adjacent tissues

圖2 RT-qPCR(A)及Western blot(B,C)檢測膀胱癌及癌旁組織中Foxo3表達結果Figure2 FoxO3 expression in bladder cancer tissues and adjacent tissues was detected by RT-qPCR(A) and Western blot(B,C) analysis

膀胱癌淋巴結轉移組的FoxO3蛋白陽性率均顯著低于無轉移組（P=0.03）。TNM分期中，T2～T3浸潤性膀胱癌組的FoxO3蛋白陽性率均顯著低于Tis～T1淺表性膀胱癌組（P=0.0014）。WHO2004分級中，高級別組的FoxO3蛋白陽性率均顯著低于低級別組（P=0.0018）。不同性別、年齡的膀胱癌患者FoxO3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 膀胱癌中FoxO3表達與術后生存率的相關性

表3 膀胱癌中FoxO3蛋白與臨床特征的相關性Table3 Correlation of FoxO3 protein with clinical characteristics of bladder cancer patients

本組111例患者隨訪時間60月，失訪12例，死亡59例，總生存率為46.9%。局部復發(fā)、轉移70例，總體無瘤生存率為36.9%。對FoxO3在膀胱癌中的表達進行K-M分析顯示，膀胱癌組織中FoxO3陽性者總體生存率（P=0.005）和總體無瘤生存率（P＜0.001）均顯著高于FoxO3陰性者，見圖3。

圖3 FoxO3表達與術后總體生存率(A)和無瘤生存率(B)的關系Figure3 Correlation of FoxO3 expression with postoperative overall survival ratio(A) and tumor-free survival ratio(B)

2.5 膀胱癌預后的多因素分析

將患者性別、年齡、FoxO3表達、淋巴結轉移、TNM分期、WHO分級、治療方法與預后的關系分別進行比較，治療方法以手術治療和手術結合輔助治療分類，采用多因素Cox比例風險模型分析后，結果顯示，F(xiàn)oxO3陰性表達、TNM分期、淋巴結轉移和WHO分期是患者預后不良的影響因素（均P＜0.05）。而年齡、性別、治療方法則與預后無關（均P＞0.05），見表4。

表4 膀胱癌患者的Cox比例回歸風險模型 (n=111)Table4 Cox proportional regression risk model of patients with bladder cancer (n=111)

3 討論

在過去30年里，轉移性膀胱癌的治療并沒有取得重大的進展。盡管膀胱切除術聯(lián)合新輔助化療與膀胱癌患者預后的改善相關，但后期患者的生存率依然較差[23]。因此，從分子水平的角度來解決這一疾病至關重要。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，與鄰近的正常組織相比，膀胱癌組織中FoxO3的表達下降。眾所周知，F(xiàn)oxO家族受多種信號轉導途徑調控，最重要的是PI3KPKB/c-Akt信號通路[24]。該途徑的直接磷酸化導致FoxO失活，膀胱癌也隨著通路的逐漸磷酸化而發(fā)展[25]。這可能是FoxO3基因在膀胱癌組織減少的一種方式。同時也有人指出，所有FoxO家族成員的廣泛體細胞缺失造成了進行性癌癥傾向并且以血管瘤和胸腺淋巴瘤為特征的病癥，表明FoxO是腫瘤抑制劑[26]，這進一步支持了我們的結果。

早期研究表明，F(xiàn)oxO3a陽性表達與乳腺癌臨床分期、腋窩淋巴結轉移和預后相關[27]。在結直腸癌中，研究人員發(fā)現(xiàn)FoxO3表達可能與腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期和組織學分類有關，且FoxO3可能成為判定結直腸癌嚴重程度及預后效果的預測因子[28]。本研究也發(fā)現(xiàn)，浸潤性膀胱癌患者的FoxO3蛋白陽性率低于淺表性膀胱癌患者，淋巴結轉移患者FoxO3蛋白陽性率明顯低于無淋巴結轉移者。所有原發(fā)性膀胱腫瘤中約90%來源于膀胱黏膜的移行細胞癌，然后逐漸侵入固有層，并轉移到固有肌層，周圍脂肪和鄰近的盆腔結構中，并且發(fā)展伴隨著淋巴瘤發(fā)病率的增加淋巴結轉移。隨著腫瘤惡化入侵和淋巴結轉移的晚期，膀胱癌細胞中持續(xù)的Akt激活，通過下調大量的轉錄因子FoxO3促進細胞分化和存活[25]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)FoxO3在膀胱癌組織中的陽性表達與患者中較高的OS率相關。通過誘導Fas配體，Bcl-2家族成員和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體等死亡受體配體的表達，活化的FoxO3蛋白很有可能增強細胞凋亡，因此阻止膀胱癌的進展[17]。

綜上所述，我們推測FoxO3的表達可能與膀胱癌的臨床病理特征和預后相關。因此，F(xiàn)oxO3的表達可以作為膀胱癌的預后指標。同時我們收集了來自根治性膀胱切除術、電子切除術以及根治性膀胱切除術、電子切除術與輔助化療相結合的幾種方法來源的病例樣本，經(jīng)Cox回歸分析后表明手術與手術結合輔助治療對患者的預后無明顯差異，猜測原因可能與樣本量較少、患者個體差異較大有關，因此這幾種治療方式對本研究患者的生存率分析影響無統(tǒng)計學意義，針對治療方法與預后的相關性，仍需要我們后期會進一步研究更大的樣本數(shù)據(jù)，以期重點研究不同的治療方法對患者生存率的影響，同時結合FoxO3等相關蛋白分子的表達水平探討它們共同作用下對患者生成率的影響。