干擾素對JAK2 V617F陽性骨髓增殖性腫瘤PD-1/PD-L1及Treg表達(dá)的影響

張麗軍，齊峰，成志勇，張朝，吳士杰，郭艷濤，孫麗娜，彭占仙，梁文同

0 引言

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms, MPN）是指分化相對成熟的一系或多系骨髓細(xì)胞不斷地克隆增殖所致的一組腫瘤性疾病。大部分MPN患者中存在著JAK2 V617F、JAK2基因第12號(hào)外顯子（exon l2）、MPL W515K基因第10號(hào)外顯子（exonl0）、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin,CARL）等突變[1]。JAK2 V617F突變導(dǎo)致酪氨酸激酶過度活化并持續(xù)激活JAK/STAT等信號(hào)通路[2]。干擾素α-2b（interferon alpha, IFN-α2b）通過作用于JAK-STAT信號(hào)通路，發(fā)揮其抗腫瘤、抗血管新生、影響細(xì)胞遷移的作用[3]，可用于MPN的經(jīng)典治療。相關(guān)研究顯示，干擾素α-2b可使約80%的MPN患者達(dá)到血液學(xué)緩解，并可以減輕脾腫大，且不存在向白血病轉(zhuǎn)化的潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。

程序性死亡受體-1（programmed death-1,PD-1）即CD279，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞表面，其介導(dǎo)的抑制信號(hào)在自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫和感染免疫方面發(fā)揮了重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用[5]。程序性死亡配體-1（programmed death-ligand 1, PD-L1）即CD274，是PD-1的配體，主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞（APC）及腫瘤細(xì)胞[6]。PD-L1與T細(xì)胞受體PD-1結(jié)合后可誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭、失活、凋亡[7]，形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Treg）是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，CD4+Treg主要作用是抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞，發(fā)揮負(fù)調(diào)控免疫系統(tǒng)的作用[8]。

JAK2 V617F陽性的MPN患者中PD-1/PD-L1及Treg的表達(dá)及干擾素對其表達(dá)的影響尚無相關(guān)報(bào)道。本研究初步探討了PD-1、PD-L1及Treg在JAK2 V617F陽性患者的表達(dá)及干擾素對PD-1/PD-L1通路及Treg的影響，以期為MPN的診療提供新的思路及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年10月—2018年4月在保定市第一醫(yī)院門診或住院接受定量PCR檢測確定有JAK2 V617F突變的MPN患者61例，其診斷均符合2016年WHO血液學(xué)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)。分為初治組41例，男23例，女18例，年齡27～82歲，中位年齡60歲。其中真性紅細(xì)胞增多癥（PV）11例、原發(fā)性血小板增多癥（ET）18例、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）12例；IFN-α2b治療組20例，男11例，女9例，年齡27～81歲，中位年齡62歲。其中真性紅細(xì)胞增多癥（PV）6例、原發(fā)性血小板增多癥（ET）8例、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）6例，IFN-α2b治療組均接受IFN-α2b皮下或肌肉注射，每次300萬U，3次/周，治療6月以上；另收集20例健康志愿者作為對照組，男10例，女10例，年齡25～66歲，中位年齡59歲。研究方案由保定市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑

IFN-α2b購自北京凱因科技股份有限公司（批號(hào)20170046），人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119），F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3、CD4、CD8單抗、PE標(biāo)記的CD25單抗及APC標(biāo)記的Foxp3單抗均購自美國BD公司（Becton, Dickinson and Company），PD-1（FITC Mouse Anti-Human CD279，批號(hào)7285690）及PD-L1（PE Mouse Anti-Human CD274，批號(hào)7104833）抗體購自美國BD PharmingenTM公司，血液基因組DNA提取試劑盒購自北京博邁德生化科技有限公司，引物由北京賽百盛公司合成，TaqMan Gene Expression MasterMix購自ABI公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）JAK2 V617F突變量檢測 分別采集各組的新鮮骨髓液2 ml，以100 U/ml的肝素鈉抗凝，DNA提取試劑盒提取標(biāo)本DNA，終濃度50～100 ng/μl，qRT-PCR（包括探針反應(yīng)）反應(yīng)體系共25 μl，反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min 1循環(huán)，95℃ 15 s，60℃1 min 40循環(huán)，設(shè)置空白對照及標(biāo)準(zhǔn)品。依照標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算JAK2及JAK2 V617F的絕對拷貝值，計(jì)算JAK2 V617F與JAK2的比值，即JAK2 V617F突變率。PCR反應(yīng)體系引物序列及探針如下：JAK2上游引物：5'-CAG CAA GTA TGA TGA GCA AGC TTT-3'，下游引物：5'-TGA ACC AGA ATA TTC TCG TCT CCAC-3'；探針：5'-FAM-TCA CAA GCA TTT GGT TTT-MGB-3'；JAK2 V617F下游引物：5'-CCA GAA TAT TCT CGT CTC CAC TGA A-3'。

1.3.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測PD-1、PD-L1的表達(dá) 收集各組骨髓細(xì)胞，分別加入0.8 μl PD-1抗體、1 μl PD-L1抗體充分混勻后室溫避光孵育15 min。加入溶血素（1：1 000）低速渦流混勻，室溫避光靜置8～10 min，離心棄上清液。PBS洗滌1次，1 ml PBS重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。CellQuest軟件獲取1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，以CD45/SSC設(shè)門分出髓系細(xì)胞群及淋巴細(xì)胞群，以CD45陽性率及顆粒度分為髓系細(xì)胞群及淋巴細(xì)胞群，分別檢測髓系細(xì)胞及淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)。PD-1、PD-L1表達(dá)高于20%為陽性表達(dá)。

1.3.3 流式細(xì)胞學(xué)檢測Treg的表達(dá) 收集各組外周血單個(gè)核細(xì)胞加入熒光素標(biāo)記的單克隆抗體CD3、CD4、CD8、CD25。PBS緩沖液洗滌一次，離心棄上清液。加1 ml Foxp3 Fixation/permeabilization工作液。室溫避光孵育40 min。PBS洗滌2次。重懸細(xì)胞加入二抗Foxp3，室溫避光孵育20 min。PBS洗一次后重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測Treg。

1.3.4 原代細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下取15例初治MPN患者抗凝骨髓液和外周血4 ml，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，取含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于50 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入PBS稀釋后的IFN-α2b至終濃度1×106U/L放入37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)后細(xì)胞檢測骨髓髓系細(xì)胞PD-1、PD-L1及外周血Treg的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較選用q檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)程度采用Pearson直線相關(guān)分析法分析，干擾素體外干預(yù)數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組JAK2 V617F、PD-1、PD-L1及Treg表達(dá)分析

初治組JAK2 V617F、髓系細(xì)胞PD-1、髓系細(xì)胞PD-L1及Treg表達(dá)均高于IFN-α2b治療組和對照組（P＜0.05）；IFN-α2b治療組JAK2 V617F、髓系細(xì)胞PD-1、髓系細(xì)胞PD-L1及Treg表達(dá)高于對照組（P＜0.05）。

初治組和IFN-α2b治療組淋巴細(xì)胞PD-1、PD-L1表達(dá)水平雖然高于對照組，但表達(dá)量低，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1、圖1。

2.2 JAK2 V617F突變量＜50%組和JAK2 V617F突變量≥50%組PD-1、PD-L1及Treg的表達(dá)

將41例初治組患者進(jìn)行分層分析，分為JAK2 V617F突變量＜50%組、JAK2 V617F突變量≥50%組，分別有20例、21例。結(jié)果顯示：JAK2＜50%組PD-1、PD-L1及Treg的表達(dá)明顯低于JAK2≥50%組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 JAK2 V617F陽性MPN患者JAK2 V617F、PD-1、PD-L1及Treg表達(dá)的相關(guān)性

表1 JAK2 V617F陽性骨髓增殖性腫瘤不同組JAK2 V617F、PD-1、PD-L1及Treg表達(dá)量的關(guān)系 (±s)Figure1 Expression of JAK2 V617F, PD-1, PD-L1 and Treg in different groups of JAK2 V617F-positive myeloproliferative neoplasms (±s)

表1 JAK2 V617F陽性骨髓增殖性腫瘤不同組JAK2 V617F、PD-1、PD-L1及Treg表達(dá)量的關(guān)系 (±s)Figure1 Expression of JAK2 V617F, PD-1, PD-L1 and Treg in different groups of JAK2 V617F-positive myeloproliferative neoplasms (±s)

Notes： *： P＜0.05, compared with the IFN-α2b treatment group; #： P＜0.05, compared with the control group

Groups JAK2 V617F(%)PD-1 in myeloid cells(%)PD-L1 in myeloid cells(%)PD-1 in lymphocyte(%)PD-L1 in lymphocyte(%) Treg(%)Newly diagnosed group 54.12±24.86* 40.87±23.11*# 44.79±19.15*# 3.26±3.92 5.30±7.95 12.24±7.41*#IFN-α2b treatment group 40.12±20.55 17.86±10.59# 29.95±14.83# 2.25±2.46 4.02±5.88 5.26±3.64#Control group 0 1.62±0.78 1.63±0.84 0.21±0.31 0.16±0.21 1.24±0.83 F 1.099 15.192 4.169 4.557 0.322 2.762 P 0.020 0.000 0.004 0.295 0.526 0.000

圖1 PD-1、PD-L1在JAK2 V617F陽性骨髓增殖性腫瘤初治組和健康對照組中的表達(dá)情況Figure1 Expression of PD-1 and PD-L1 in control group and newly diagnosed group of JAK2 V617F-positive myeloproliferative neoplasms

Pearson相關(guān)性分析表明，JAK2 V617F突變量與髓系細(xì)胞PD-1、PD-L1、淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.498,P＜0.01;r=0.686,P＜0.01;r=0.406,P＜0.01）；髓系細(xì)胞PD-1與髓系細(xì)胞PD-L1、淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)正相關(guān)（r=0.758,P＜0.01;r=0.382,P＜0.05）。Treg與各組均無相關(guān)性（P＞0.05）。淋巴細(xì)胞PD-L1各組間無相關(guān)性（P＞0.05）。

表2 JAK2 V617F突變量與PD-1、PD-L1及Treg的表達(dá)的關(guān)系 (±s)Table2 Relationship between JAK2 V617F and expression of PD-1, PD-L1 and Treg (±s)

表2 JAK2 V617F突變量與PD-1、PD-L1及Treg的表達(dá)的關(guān)系 (±s)Table2 Relationship between JAK2 V617F and expression of PD-1, PD-L1 and Treg (±s)

JAK2 V617F/JAK2 Rate Treg(%)＜50% 2026.25±22.2831.38±15.791.99±2.018.72±5.65≥50% 2142.86±19.6151.43±17.124.20±4.6211.61±8.70 t 3.028 4.730 2.532 1.572 P 0.004 0.000 0.014 0.121 n PD-1 in myeloid cells(%)PD-L1 in myeloid cells(%)PD-1 in lymphocyte(%)

2.4 IFN-α2b對體外培養(yǎng)MPN原代細(xì)胞PD-1、PD-L1及Treg表達(dá)的影響

1×106U/L IFN-α2b體外干預(yù)原代細(xì)胞后，髓系細(xì)胞PD-1、PD-L1及Treg的表達(dá)減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 IFN-α2b作用前后髓系細(xì)胞PD-1、PD-L1，淋巴細(xì)胞PD-1及Treg表達(dá)量的比較 (±s)Table3 Comparison of PD-1, PD-L1 expressions in myeloid cells, PD-1 expression in lymphocyte, Treg expression before and after IFN-α2b treatment (±s)

表3 IFN-α2b作用前后髓系細(xì)胞PD-1、PD-L1，淋巴細(xì)胞PD-1及Treg表達(dá)量的比較 (±s)Table3 Comparison of PD-1, PD-L1 expressions in myeloid cells, PD-1 expression in lymphocyte, Treg expression before and after IFN-α2b treatment (±s)

Groups n PD-1 in myeloid cells (%)PD-L1 in myeloid cells (%)PD-1 in lymphocyte(%)Treg(%)Before interference1548.48±19.7042.54±22.144.21±4.3210.0±19.40 After interference1545.55±19.5935.79±19.121.67±1.285.27±6.54 F 0.636 0.677 0.199 0.972 P 0.011 0.006 0.476 0.000

3 討論

包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞存在著免疫逃逸機(jī)制。免疫檢查點(diǎn)可以激活T細(xì)胞誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)通路。抑制共刺激信號(hào)可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖，進(jìn)而防止致癌突變。免疫檢查點(diǎn)在阻斷宿主免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用[9]。其中PD-1/PD-L1作為免疫檢查點(diǎn)重要成員，已成為腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)[10-12]。本研究檢測了61例JAK2 V617F陽性MPN患者PD-1、PD-L1的表達(dá)。初治組PD-1、PD-L1均高表達(dá)，且IFN-α2b治療組PD-1、PD-L1的表達(dá)量較初治組明顯減低。同時(shí)JAK2 V617F的表達(dá)與PD-1、PD-L1呈正相關(guān)。

細(xì)胞因子受體JAK-STAT通路是一條重要的細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路的激活對促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡具有重要作用[13]。IFN-α2b可以通過調(diào)控JAK-STAT信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤作用[2]。有研究表明，在肝癌中JAK/STAT1是IFN-γ誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系PD-L1表達(dá)的主要途徑，TNF-α和IFN-γ可協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)[14]。在黑色素瘤中，IFNα與PD-1/PD-L1抑制劑或可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[15]。本研究中MPN患者應(yīng)用IFN-α2b后JAK2 V617F表達(dá)量明顯減少，且PD-1、PD-L1表達(dá)量亦減低。原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示干擾素可以下調(diào)PD-1、PD-L1的表達(dá)。表明干擾素可能通過負(fù)反饋調(diào)控JAK-STAT信號(hào)通路，進(jìn)而下調(diào)PD-1/PD-L1信號(hào)通路，達(dá)到抑制腫瘤的作用。

Treg在腫瘤患者的T淋巴細(xì)胞中所占比例明顯升高，抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性[16]。有研究表明，PD-1/PD-L1信號(hào)通路可能是Treg發(fā)揮抑制作用的機(jī)制之一。PD-1基因敲除小鼠Treg不能抑制CD8+T細(xì)胞增殖或IFN-γ分泌[17]。本試驗(yàn)研究了61例患者Treg的表達(dá)，相比對照組，初治組及治療組Treg的表達(dá)量明顯升高。有研究表明，干擾素作用短期內(nèi)可以引起PD-L1及Treg上調(diào)，可能與Treg數(shù)量的增加使機(jī)體維持保護(hù)性免疫，避免了機(jī)體過度的免疫反應(yīng)有關(guān)[18]，長期作用效果來看，可能參與抑制PD-1、PD-L1及Treg表達(dá)。本研究結(jié)果顯示IFN-α2b作用后可使PD-L1及Treg表達(dá)減低，原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果亦支持該結(jié)論。部分患者干擾素治療后存在PD-L1及Treg上調(diào)，該部分患者是否與預(yù)后不良有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

本研究初步探討了JAK2 V617F陽性MPN患者JAK2 V617F、PD-1、PD-L1及Treg的表達(dá)及各表達(dá)量之間的相互關(guān)系，以及干擾素對MPN患者JAK2 V617F、PD-1、PD-L1及Treg表達(dá)的抑制作用。為PD-1/PD-L1通路在MPN中的作用提供一定的理論依據(jù)。